Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lymfestelsel aandoeningen zoals primaire lymfoedeem, lymfatische misvormingen en lymfatische tumoren zijn zeldzame omstandigheden die aanzienlijke morbiditeit veroorzaken, maar er is weinig bekend over hun biologie. Het isoleren van zeer zuiver menselijke lymfatische endotheelcellen (LEC's) van zieke en gezonde weefsel zou studies van het lymfatische endotheel bij genetische, moleculaire en cellulaire niveau te vergemakkelijken. Verwacht wordt dat deze onderzoeken targets kunnen openbaren nieuwe therapieën die de klinische behandeling van deze aandoeningen kunnen veranderen. Een protocol beschrijft de isolatie van menselijke voorhuid LEC's en lymfatische misvorming lymfatische endotheelcellen (LM LEC's) wordt gepresenteerd. Voor het verkrijgen van een enkele celsuspensie weefsel werd fijngehakt en enzymatisch behandeld met collagenase en dispase II II. De resulterende celsuspensie werd vervolgens gemerkt met antilichamen tegen cluster van differentiatie (CD) markers CD34, CD31, vasculaire endotheliale groeifactor-3 (VEGFR-3) en podoplanin. Stained levensvatbare cellen werden gesorteerd op een fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om de CD34 Low CD31 pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC populatie gescheiden van andere endotheliale en niet- endotheelcellen. De gesorteerde LM LEC's werden gekweekt en uitgebreid on-fibronectine gecoate flessen voor verdere experimenteel gebruik.
Inleiding
Een belangrijke functie van het lymfatische vasculaire systeem te lymfe, een teveel interstitiële vloeistof bevattende lipiden, eiwitten en cellulaire bestanddelen te absorberen en dirigeren het bloed veneuze systeem. Een netwerk van lymfatische haarvaten leidt lymfe naar de lymfeknopen waar het wordt gescreend op de aanwezigheid van vreemde antigenen, een belangrijk proces in immune surveillance en invoering van witte bloedcellen om vreemde antigenen te neutraliseren.
De unidirectionele lymfatisch systeem start in weefsels, waarbij de initiële lymfatische capillair, een unieke structuur en discontinu enkele laag dunwandige vlakke endothe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek verklaring: ethische goedkeuring voor het verzamelen van lymfatische misvorming en voorhuid weefsel werd verkregen uit de Human Research ethische commissies in het Royal Children's Hospital, Melbourne, Australië. Ondertekend toestemming werd ontvangen van ouders van patiënten voorafgaand aan de operatie. Weefselmonsters werden verzameld van patiënten met LM ondergaan chirurgische procedures als onderdeel van hun klinische behandeling en patiënten die een electieve besnijdenis. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Health en Medical Research Council, Australië.
1. Voorbereiding v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na de eerste digestie weefsel na 24 uur in kweek van niet-gefractioneerde monsters onderscheiden endotheelcel kolonies worden waargenomen (Figuur 2A) met fibroblast-achtige cellen en gladde spiercellen. Na het sorteren en na 24 uur in celkweek, de CD34 Lage CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos cellen hechten en laten typische geplaveide morfologie (figuur 2B en C). De FACS hierboven beschreven, zijn we in staat om cellen te zui.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
LEC's spelen een belangrijke rol bij het handhaven van homeostase fluïdum, immuunrespons tegen vreemde antigenen en opname en het transport van bepaalde nutriënten. LEC homeostase kan worden beïnvloed door ziekteprocessen zoals bacteriële infecties en tumormetastase, maar LEC ook somatische mutaties die resulteren in de vorming van disfunctionele lymfevaten en significante morbiditeit voor de getroffen patiënten. Om meer inzicht in de lymfatische misvorming etiologie te krijgen door middel van in vivo impla.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de Baker Foundation en de Stichting 'Women in Science Fellowship' van de Royal Children's ondersteuning van Zerina Lokmić erkennen. Andrew G. Elefanty en Edouard G. Stanley zijn NHMRC Senior Research Fellows. Werk in hun laboratoria werd ondersteund door NHMRC en Stem Cells Australië.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Gebazigd voor het verzamelen van weefselmonsters uit de operatiekamer. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit bevat 500 ml EBM-2 media en humane EGF, hydrocortison, gentamycine (GA-1000), foetaal bovien serum (FBS), VEGF, humane FGF-b, R3-IGF-1 en ascorbinezuur. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Volledige endotheelcel media wordt aangevuld met 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibioticum-antimycoticum oplossing (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | Deze oplossing bevat 10.000 U/ml penicilline, 10.000 mg/ml streptomycine en 25 mg/ml Fungizone antimycoticum. Gebruik bij 1:100 verdunning. |
| Fibronectine uit menselijk plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Gebazigd bij 10 mg/ml concentraties. Het kan tot 1 maand worden hergebruikt indien op 4 °C bewaard en steriel gehouden. Gebruik 7 ml om 150 cm2 flesjes te coaten. |
| StemPro Accutase Celdissociatie reagens | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® wordt gebruikt op 0,05 ml per cm2 om het gehele oppervlak van de fles te bedekken. Het gebruik van kleinere volumes kan resulteren in onvolledige celafscheiding. |
| 0,4% Trypan Blauw kleurstof | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Gebazigd als een levensvatbaarheidskleurstof. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Gebazigd op 0,04% |
| Collageenase II | Worthington Lab | 4176 | Gebazigd op 0,25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Gebazigd op 0,01% |
| 70 mm nylon cel zeefjes | BD Falcon | 352350 | |
| [header] | |||
| PE-geconjugeerd VEGFR-3 klon 9D9F9, klon WM59 | BioLegend | 356204 | Gebazigd op 1:50 verdunning |
| PE-Cy7-geconjugeerd CD34, klon 581 | BioLegend | 343516 | Gebazigd op 1:200 verdunning |
| APC-geconjugeerd muis anti menselijk CD31, klon WM59 | BioLegend | 303116, | Gebazigd op 1:100 verdunning |
| Alexa 488-geconjugeerd rat anti menselijk Podoplanin, klon NC-80. | BioLegend | 337006 | Gebazigd op 1:200 verdunning |
| PE-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Gebazigd op 1:50 verdunning |
| PE-Cy7-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Gebazigd op 1:200 verdunning |
| APC-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Gebazigd op 1:100 verdunning |
| Alexa 488-geconjugeerd muis IgG2a, k isotype, klon RATK2758 | BioLegend | 400525 | Gebazigd op 1:200 verdunning |
Referenties
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
