Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Summary

Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.

Abstract

Lymfestelsel aandoeningen zoals primaire lymfoedeem, lymfatische misvormingen en lymfatische tumoren zijn zeldzame omstandigheden die aanzienlijke morbiditeit veroorzaken, maar er is weinig bekend over hun biologie. Het isoleren van zeer zuiver menselijke lymfatische endotheelcellen (LEC's) van zieke en gezonde weefsel zou studies van het lymfatische endotheel bij genetische, moleculaire en cellulaire niveau te vergemakkelijken. Verwacht wordt dat deze onderzoeken targets kunnen openbaren nieuwe therapieën die de klinische behandeling van deze aandoeningen kunnen veranderen. Een protocol beschrijft de isolatie van menselijke voorhuid LEC's en lymfatische misvorming lymfatische endotheelcellen (LM LEC's) wordt gepresenteerd. Voor het verkrijgen van een enkele celsuspensie weefsel werd fijngehakt en enzymatisch behandeld met collagenase en dispase II II. De resulterende celsuspensie werd vervolgens gemerkt met antilichamen tegen cluster van differentiatie (CD) markers CD34, CD31, vasculaire endotheliale groeifactor-3 (VEGFR-3) en podoplanin. Stained levensvatbare cellen werden gesorteerd op een fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om de CD34 ^Low CD31 ^pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LM LEC populatie gescheiden van andere endotheliale en niet- endotheelcellen. De gesorteerde LM LEC's werden gekweekt en uitgebreid on-fibronectine gecoate flessen voor verdere experimenteel gebruik.

Introduction

Een belangrijke functie van het lymfatische vasculaire systeem te lymfe, een teveel interstitiële vloeistof bevattende lipiden, eiwitten en cellulaire bestanddelen te absorberen en dirigeren het bloed veneuze systeem. Een netwerk van lymfatische haarvaten leidt lymfe naar de lymfeknopen waar het wordt gescreend op de aanwezigheid van vreemde antigenen, een belangrijk proces in immune surveillance en invoering van witte bloedcellen om vreemde antigenen te neutraliseren.

De unidirectionele lymfatisch systeem start in weefsels, waarbij de initiële lymfatische capillair, een unieke structuur en discontinu enkele laag dunwandige vlakke endotheelcellen met gespecialiseerde cel contacten die lymfe ingang ^1,2 toe. Deze haarvaten worden via verankering filamenten om vat ineenstorting in aanwezigheid van verhoogde interstitiële druk ³ voorkomen dat de omliggende bindweefsel matrix bevestigd. De initiële lymfatische haarvaten leeg in het verzamelen van lymfatische haarvatendie samenvloeien tot grotere lymfevaten of aderen. In vergelijking met lymfatische haarvaten initieel, verzamelen lymfevaten dikkere vaatwanden, gepaarde lymfe kleppen en omhuld door een discontinue basale membraan waarin een paar gladde spiercellen ingebed ^4. Gecoördineerde openen en sluiten van lymfatische kleppen en contractie van gladde spiercellen vergemakkelijkt de doorstroming van lymfe ^3. Bij de mens, de lymfatische aderen uit verschillende regio's van het lichaam mee te doen met lymfatische stammen die fuseren tot twee lymfevaten te vormen: de thoracale buis en de rechter lymfatische kanaal. De ductus thoracicus draineert lymfe van de linkerkant van het lichaam en vanaf de rechterzijde onder de borst, terwijl de juiste lymfevat afvoeren lymfe van de rechterarm en rechterkant van het hoofd, nek en borst. Beide leidingen voeren lymfe in de subclavia in de nek ^5.

Aandoeningen van het lymfestelsel zijn over het algemeen gegroepeerd in een verworvennd aangeboren (tabel 1). Voorbeelden van verworven omstandigheden lymfangitis en secundaire lymfoedeem. Lymphangitis is een ontsteking van een lymfevat gevolg van bacteriële infectie. De getroffen lymfevaten verwijden en vul met exsudaat bevatten polymorfonucleaire cellen. In skin deze lymfevaten zichtbaar rood, pijnlijke onderhuidse stroken vaak gepaard met de uitbreiding van de bijbehorende drainerende lymfeklier (lymfadenitis) ^6. Secundair lymfoedeem ontstaat als gevolg van beschadiging of obstructie van het lymfevat of lymfklier obstructie. Dit leidt tot chronische progressieve zwelling door de ophoping van lymfe distaal van de beschadiging of obstructie. In ontwikkelde landen is secundaire lymfoedeem meestal geassocieerd met kanker, waar metastaserende tumoren belemmeren lymfvaten of regionale lymfeknopen, of ten gevolge van anti-kanker therapie na chirurgische verwijdering van lymfeklieren, nabestralingsonderzoek fibrose en post-inflammatoire Thromtrombose en littekens ^7. In andere delen van de wereld, mogelijk secundair lymfoedeem secundaire lymfatische obstructie door parasitaire wormen zoals Wuchereria bancrofti ^6.

Aandoeningen van Lymfatische Vascular System
Verworven	Aangeboren
Lymphadenitis Secundair lymfoedeem	Primair lymfoedeem 10	Sporadische Lymfatische misvormingen 13	Lymfatische misvormingen gerelateerd syndromen 13
	bv Milroy Syndrome Meige syndroom	Eenvoudig: Lymfatische misvormingen	bv Klippel-Tranaunay Syndroom Parks Weber Syndrome Sturge-Weber-syndroom
		Gecombineerd: Capillaire-lymfatische misvormingen Capillaire-lymfatische-veneuze misvormingen Capillaire-lymfatische-arterioveneuze misvorming Capillair-lymfatische veneuze-arterioveneuze misvorming

Tabel 1. Overzicht van de aandoeningen van lymfatische vasculaire systeem.

Aangeboren aandoeningen van het lymfesysteem omvatten primaire (idiopathische) lymfoedeem gedacht te worden veroorzaakt door genetische mutaties lymphangiectasia en afwijkingen van het lymfestelsel ^8,9. Primair lymfoedeem kan sporadisch worden vermoedelijk veroorzaakt door de novo mutaties, of geërfd. Lymfatische aandoeningen kunnen ook worden geïsoleerd of bestaan ​​uit een deel van een meer algemene syndroom ^10. In de pediatrische populatie, 97% van de lymfeoedeem is sporadisch met afwijkingen in lymfatische structuur vat dat regionale lymfedrainage ¹¹ schaden. Ziekte Milroy is een voorbeeld van primair lymfoedeem veroorzaakt door mutatie in het VEGFR-3-gen zichtbaar bij geboorte of kort daarna ^12. Hoewel vooral familiale toestand, kan de ziekte Milroy ook worden geïdentificeerd bij zuigelingen zonder familiegeschiedenis van Milroy de ziekte ^32. De ernst van lymfoedeem is afhankelijk van de hoeveelheid lymfe produktie en het vermogen om lymfe terug transporteren naar veneuze circulatie ^6.

Op basis van de klinische presentatie en in situ endotheelcelproliferatie, zijn afwijkingen van het lymfestelsel geclassificeerd als lymfatische tumoren of lymfatische misvormingen ^13. Kaposiform lymphangiomatosis is een voorbeeld van een LEC tumor ^14. Lymfatische malformaties worden verondersteld te ontstaan ​​tijdens de embryonale ontwikkeling en groeien in verhouding tot het kind ^15,16. Ze regressie zelden maar kan Remain asymptomatisch tot trauma of infectie precipiteert snelle groei leidt tot klinische complicaties. De geordende structuur van lymfenetwerk en geleiding van lymfe uit het weefsel veneuze circulatie hierboven beschreven verstoord in lymfatische malformaties die bestaan ​​uit plaatselijke verzamelingen van abnormale cysteuze structuren gevuld met lymfevocht. Hoewel er geen klinisch of experimenteel bewijs dat deze cystic vaten zijn verbonden met de lymfatische circulatie of dat zij functionele lymfatische kleppen bevat, hun lymfatische identiteit bevestigd door expressie van reeks lymfatische celmarkers zoals podoplanin, CD31, lymfevat Endothelial Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox eiwit 1 (PROX-1) en VEGFR-3 ^15,17,18. Deze cysteuze structuren zijn zowel kleine (microcystische) of grote (macrocystic), maar de meeste lymfatische malformaties bevatten zowel microcystische en macrocystic componenten (Figuur 1) ^16. Na de operatie, spuitgietenn sclerotherapie en / of radiofrequente ablatie de lymfatische misvormingen vaak terugkomen.

Figuur 1. Morfologie van menselijke lymfevaten en lymfatische misvormingen. Normale humane lymfatische (A) en misvorming lymfatische vaten (B en C) gemerkt met antilichaam tegen podoplanin (bruine label, pijl). Human lymfatische misvorming schepen worden gekenmerkt door duidelijke dilatatie en aanzienlijke variatie in lumen grootte. Deze gelokaliseerde abnormale cystische structuren kunnen zowel kleine (microcystische, *) (B) of grote (macrocystic, #) (C) zijn. De meeste lymfatische misvormingen bevatten zowel microcystische en macrocystic componenten. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding weer te geven.

Sommige onderzoekers hebben gesuggereerd dat lymfatische misvormingen zijn een ontwikkelingsstoornis van lymfatische vasculatuur waarbij de LEC geen abnormale groeipotentieel maar hebben geen verbinding met de normale bloedsomloop ^19. Wij hebben echter gevonden dat de LM LEC sneller prolifereren en zijn beter bestand tegen apoptosis dan voorhuid LEC ¹⁵ suggereert dat er een primair defect in de LM LEC's. Bij LM LEC worden geïmplanteerd in een muis xenograft model, vormen ze structuren denken aan lymfatische misvormingen ^15. Dit ondersteunt de hypothese dat lymfatische misvormingen kunnen worden veroorzaakt door een of meer somatische mutaties ontstaan ​​in LM LEC tijdens de foetale ontwikkeling. Inderdaad hebben recente rapporten zo'n mutatie in het p110α katalytische subeenheid van fosfoinositide 3-kinase (PIK3CA) genen ²⁰ geïdentificeerd.

Gezien de vorderingen in DNA sequencing technologie, relevante mutaties cOuld gemakkelijker worden geïdentificeerd in geïsoleerde LM LEC's, het begeleiden van toekomstige studies van deze voorwaarden. De isolatie van levensvatbare LEC zou vergelijkingen tussen abnormale en normale LECs in assays zoals migratie, proliferatie, buis die vermogen en overleving in respons op verminderde beschikbaarheid van voedingsstoffen of pro-apoptotische middelen ¹⁵ te vergemakkelijken. Geïsoleerde LEC zou ons in staat te stellen cel-specifieke genexpressie en proteomics studies uitgevoerd om nieuwe LEC subpopulaties bakenen en ontdekken van nieuwe farmacologische middelen die geschikt zijn voor klinische behandeling van lymfatische misvormingen.

We hebben eerder publiceerde een LEC isolatie methode gebaseerd op magnetische kraal scheiding van LEC's van neonatale voorhuid en lymfatische misvormingen ^15. We meldden een strategie voor het scheiden normale en zieke LEC's van vasculaire endotheliale cellen op basis van de afwezigheid van CD34 expressie, gevolgd door het onderwerpen CD34 ^Neg celfractie positieve selectie van CD31.Echter, deze werkwijze belemmerd door de aanwezigheid van achtergebleven niet-endotheelcellen. Dit was onafhankelijk van de epidermis te verwijderen vóór verder bindweefsel digestie. Deze verontreinigingen algemeen prolifereerden sneller en dus uiteindelijk overgrew de endotheliale celculturen ondanks latere pogingen om LEC isolatie herhalen. Inderdaad, een eerste besmetting van niet-endotheelcellen zo laag als 2% tot 5% voldoende om de LEC populatie ¹⁵ toelaat. Dit bracht ons naar fluorescent geactiveerde celsortering methode te verkennen als een optie om LEC cel opbrengst en zuiverheid te verbeteren. Daarnaast gebruikten we multi-parameter sorteren om de specificiteit van de LEC populaties verbeteren, toevoeging van VEGFR-3 en podoplanin de selectie markers CD34 ^Low CD31 ^pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LECs identificeren.

De rationale voor de selectie van deze merkers werd gebaseerd op de rapporten die tijdens LEC en bloed vasculaire endotheliale cells hebben veel celoppervlaktemerkers gemeen, zoals CD31, LEC's tonen fenotypische variatie in hun expressie van CD34, podoplanin en VEGFR-3 celoppervlak marker in vergelijking met bloed vasculaire endotheliale cellen ^21-23. CD31 is een 130 kDa transmembraan glycoproteïne ook bekend als bloedplaatjes endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM-1). Het wordt beschouwd als een pan-endotheelcel merker omdat het tot expressie wordt gebracht op alle soorten bloed- en lymfevaten ^21,24,25. CD34 is 110 kDa transmembraan glycoproteïne aanwezig op de meeste hematopoietische moedercellen en stamcellen, vasculaire endotheelcellen en enkele lymfevaten ^26.

VEGFR-3, de receptor voor vasculaire endotheliale groeifactoren C en D, aanvankelijk aanwezig op de ontwikkelende aders in het muizenembryo, maar na lymfatische specificatie gereguleerd door de transcriptiefactoren SRY-gerelateerde HMG-box (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor 2 (COUPTF-II) en PROX-1, is VEGFR-3 veneuze expressie verloren en het wordt beperkt tot embryonale LECs ^25,27. Podoplanin, een 38 kDa membraan mucoprotein, wordt eerst opgemerkt op de lymfevaten op ongeveer embryonale dag 11 (~ E11.0) van de muis embryonale ontwikkeling ²⁸ en terwijl het sterk wordt uitgedrukt door microvasculaire lymfevaten, podoplanin expressie door macrocystic lymfatische endotheel in lymfatische misvormingen meer variabel ^15. Flowcytometrie experimenten suggereren dat ten minste enkele CD34 ^Hoge CD31 ^Pos endotheelcellen drukken de lymfatische marker podoplanin ^29. Hoewel systematische evaluatie van LYVE-1 en podoplanin kleuring in humane lymfatische malformaties gebleken dat beide effectief zijn bij het ​​kleuren lymfatisch endothelium misvorming ^30, in normale weefsels, LYVE-1 werd gemeld sterk aanwezig in de initiële lymfatische zijncapillaire endotheel maar verminderd en zelfs afwezig bij het ​​verzamelen van lymfatische endotheel ^31. Omdat ons doel is om te isoleren zowel de initiële en het verzamelen van lymfatische endotheelcellen we hebben ervoor gekozen niet te LYVE-1 gebruiken als onderdeel van onze mobiele strategie selectie. Tenslotte werd de beslissing om deze markers ook gebruikmaken basis van de beschikbaarheid van antilichamen die diagnostisch zijn voor lymfevaten labelen voor microscopische beeldvorming, een eigenschap die verband tussen flowcytometrie en immunofluorescentie studies zou toestaan.

Dit artikel zal het weefsel spijsvertering methode, cel kleuring en FACS instellingen die nodig zijn voor een succesvolle isolatie van CD34 ^Lage CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos LEC's evenals CD34 ^High CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos endotheelcellen van voorhuid en lymfatische misvorming beschrijven weefsel.

Protocol

Ethiek verklaring: ethische goedkeuring voor het verzamelen van lymfatische misvorming en voorhuid weefsel werd verkregen uit de Human Research ethische commissies in het Royal Children's Hospital, Melbourne, Australië. Ondertekend toestemming werd ontvangen van ouders van patiënten voorafgaand aan de operatie. Weefselmonsters werden verzameld van patiënten met LM ondergaan chirurgische procedures als onderdeel van hun klinische behandeling en patiënten die een electieve besnijdenis. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Health en Medical Research Council, Australië.

1. Voorbereiding van de Cell Suspension van Voorhuid en Lymfatische Misvorming Tissues

1. Buffers en Media Voorbereiding.
   1. Bereid volledige endotheelcellen media met behulp van commercieel beschikbare EGM-2 MV Bullet Kit met een warming EGM-2-media en zachtjes ontdooien de kit componenten in 37 ° C waterbad. In klasse II bioveiligheid kast, aseptischelke component toe te voegen aan de BAVA-2 media. Zodra alle componenten worden toegevoegd aan de media Raadpleeg deze media als "volledige endothelial cell media. Gebruik steriele 50 ml pipet om de inhoud vóór gebruik te mengen.
      LET OP: Alle stappen met betrekking tot celcultuur worden uitgevoerd in een klasse II biohazard kast. Alle oplossingen worden bewaard bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant en worden opgewarmd tot kamertemperatuur vóór gebruik. De volledige endotheelcel media, celkweek buffers en enzymoplossingen worden verwarmd bij 37 ° C gedurende 20 min vóór gebruik.
   2. Supplement volledige endotheelcel medium met 50 ng / ml VEGF-C. Aliquot de aangevulde endotheelcel-medium in 50 ml steriele buizen en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Het medium is stabiel gedurende tenminste 4 weken indien bewaard bij 4 ° C.
   3. Bereid calcium en magnesium vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het oplossen van 8,752 g NaCl, 1,416 g Na ₂ HPO .2H _{4 2} O en0,395 g KH ₂ PO ₄ in 1000 ml water. Pas de pH tot 7,4. Filter steriliseer PBS behulp 0,22 urn filter en bewaar bij 4 ° C. Voor gebruik toe antibiotica / antimycotische oplossing (gebruikt bij 1: 100).
   4. Om menselijk fibronectine te bereiden, los 1 mg van fibronectine in 10 ml steriel water. WINKEL oplossing in 100 gl aliquots bij -20 ° C. Op de dag van gebruik voeg 10 ml steriel PBS tot 100 ui aliquot fibronectine (tot een uiteindelijke werking concentratie van 10 ug / ml te verkrijgen).
   5. Voor het enzym media, een oplossing bevattende 0,04% Dispase II, 0,25% collagenase II en 0,01% DNase I in steriele PBS. Eerst weeg dispase en collagenase, plaats in een steriele 50 ml buis, voeg het benodigde volume PBS en incubeer gedurende 30 minuten onder schudden bij 37 ° C op te lossen. Eenmaal opgelost, filter steriliseren (0,22 pm filter) dispase / collagenase oplossing in bioveiligheid kap. Aseptisch de enzymatische oplossing toe de DNase I. Bewaren bij 37 ° C totgebruiken.
      OPMERKING: DNase I is een commerciële celkweekniveau reagens beschikbaar als steriel gevriesdroogd poeder.

2. Voorbereiding van de Cell Suspension van Voorhuid en Lymfatische misvormingen

1. Weeg een 50 ml buis met 10 ml DMEM / 2% antibiotica-antimycotische oplossing. Deze buis wordt gebruikt voor weefselverzameling.
2. Na chirurgische verwijdering van lymfatische malformatie en voorhuid weefsels aseptisch weefselmonster aan de buis en overdracht op ijs aan de celkweek laboratorium.
3. Weeg de buis met het weefsel en bereken weefselgewicht. Met dit gewicht aan het volume van enzymatische dat is gebruikt om het weefsel te verteren berekenen.
4. In klasse II bioveiligheid kast, gebruik steriele tang om het weefsel en media over in een 100 mm kweekschaal tissue. Gebruik steriele schaar om fijn gehakt het weefsel in ~ 1 mm ³ stuks.
5. Transfer gehakt weefsel gemengd met media into een 50 ml buis met een additionele 10 ml steriel DMEM / 2% antibiotica-antimycotische oplossing. Meng door inversie om opnieuw op te schorten het weefsel. Centrifugeer het monster bij 300 xg gedurende 5 minuten.
6. Verwijder het supernatant. Op basis weefselgewicht, voeg 1 ml voorverwarmde (37 ° C) collagenase II / DNase I / Dispase II digestie oplossing per 100 mg gehakt weefsel. Algemeen gebruik 10 ml enzymoplossing ongeveer 1 gram gehakt weefsel.
7. Incubeer het weefsel in een 37 ° C incubator gedurende 20-90 min onder constant schudden bij 200 rpm. Na afloop van deze periode op toe dat bijna al het weefsel wordt gedigereerd tot kleine fragmenten.
   OPMERKING: Blootstelling van de cellen aan collagenase en dispase bij de isolatie van de primaire weefsels invloeden celoverleving. We hebben empirisch gevonden dat de meeste neonatale voorhuid monsters optimaal nodig 20-30 min van de spijsvertering, terwijl fibrotische lymfatische misvorming monsters 60-90 min van de spijsvertering kan vereisen. LM LEC yields worden beïnvloed door de hoeveelheid fibrose wordt meer fibreus weefsel waardoor minder cellen, mogelijk als gevolg van nadelige effecten van langdurige blootstelling aan collagenase en dispase II II.
8. Na de spijsvertering, de overdracht van de buis naar de bioveiligheid kast en laat de verteerde weefsel oplossing door een 70 urn zeef geplaatst in een steriele 50 ml buis. Met behulp van 3 ml spuit zuiger met rubber zuiger, slijpen de resterende weefsel tot slechts kleine sporen van extracellulaire matrix worden waargenomen.
9. Was de cel zeef met een volume van endotheelcellen medium gelijk aan het volume dissociëren enzyme medium om cellen vast te zeven en de enzymen te inactiveren herstellen. Bijvoorbeeld voor 2 ml dissociëren enzym medium aan gehakt weefsel verteren, voeg 2 ml endotheelcel medium om de enzymen te inactiveren.
10. Centrifugeer de cellen oplossing bij 300 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. R> e-schorsen de cellen in 10 ml PBS. Centrifugeer cellen bij 300 xg5 min, de bovenstaande vloeistof vervolgens tweemaal herhalen cel wassen. > Resuspendeer de celpellet in 20 ml van endotheliale celmedium. Tellen cellen met behulp van trypan blue vervolgens seed 2 x 10> ⁶ cellen in 150 cm> ² kolf vooraf bekleed met fibronectine in een eindvolume van 20 ml endotheelcel medium. Kweken bij 37 ° C in een 5% CO> ₂ in bevochtigde lucht incubator.>
    OPMERKING: De verwachting is dat 75% -90% kernhoudende cellen overleven weefsel digestie zoals geschat door trypan blauw exclusie. Het aanvankelijke aantal cellen betreft alle kernhoudende cellen in de celsuspensie (bijvoorbeeld keratinocyten, leukocyten, macrofagen, bindweefselcellen en bloedvaten cellen). Het aantal cellen bij 5-7 dagen weerspiegelt cellen die zijn aangesloten, overleefde en verspreid tijdens de celcultuur. Coating weefselkweek kolven met fibronectine verbetert ook de daaropvolgende LEC en LM LEC overleven.
11. Na een nacht incubatie, weg te wassen ongebonden cellen in drie wassingen met PBS / 1% antibiotica-antimycotische oplossing en voeg verse endotheelcellen medium. Voeren drie wasbeurten om effectief te verwijderen ongebonden cellen en rode bloedcellen aanwezig zijn in de kolf. Wijzig media elke tweede dag. Cellen wordt 80% confluent zijn ~ na 5-7 dagen.

3. Antilichaam kleuring van cellen voor Lymfatische endotheelceloppervlak Markers flowcytometrie

1. Nadat de cellen 80% confluentie, aspireren medium en spoelen cellen met PBS bereikt.
2. Trek hechtende cellen door cellen te incuberen met 7 ml cel onthechting oplossing zoals Accutase per 150 ^cm2 kolf gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C.
3. Harvest vrijstaande cellen, inactiveren de cel detachement oplossing door het toevoegen van 3 volumes van endotheelcellen medium en breng de celsuspensie om een ​​nieuwe steriele buis.
4. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min.
5. Zuig supernatant en resuspendeer de cellen in 5 ml PBS. Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder de supernatant herhaal cel wassen. Resuspendeer de cellen in 5 ml PBS.
6. Tel het aantal levensvatbare cellen. Meng 10 pl celsuspensie met 90 gl 0,4% trypan blue. Overdracht 10 ul van deze suspensie hemocytometer voor het tellen.
   NB: De uiteindelijke celopbrengst is afhankelijk van de monstergrootte verwerkt. De gebruikelijke celopbrengst per 150 ^cm2 kolf varieert van 7 x 10 ^5-1,2 x 10 ⁶ levensvatbare cellen.
7. Bereid de antilichaamoplossingen voor celkleuring.
   Opmerking: De volgende verdunningen werden getitreerd voor het kleuren van 1 x 10 ⁶ in een kleuring volume van 100 pl.
   1. Verdun PE geconjugeerd muizen anti humaan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 geconjugeerd muizen anti-humaan CD34 geconjugeerd (1: 200); APC-geconjugeerd muizen anti-humaan CD31 (1: 100) en Alexa 488-geconjugeerd rat anti-humaan podoplanin (1: 200) in totaal volume van 100 pi steriel 5% FBS / PBS oplossing per weefselmonster. Na de voorbereiding van deantilichaamoplossing, houdt op ijs tot gebruik. Vergelijkbare wijze, bereid verdunde isotype controle antilichaam mengsel tot instelling van flowcytometrie poorten vergemakkelijken.
8. Om niet-specifieke binding van de antilichamen verminderen Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 2 minuten, verwijder supernatant daarna schorsen de cellen in 100 pi steriel 5% FBS / PBS oplossing per monster worden gekleurd. Incubeer cellen op ijs gedurende 20 min bij 4 ° C.
9. Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten, verwijder supernatant daarna resuspendeer cellen in het geconjugeerde antilichaam cocktail. Ook vlek een kleinere hoeveelheid cellen (1 x 10 ⁵⁾ in 100 gl isotype controle antilichaam mengsel. Incubeer cellen op ijs gedurende 20 min.
10. Om het ongebonden antilichaam te verwijderen Voeg 2 ml van 2% FBS / PBS oplossing en centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en herhaal het wassen.
11. Resuspendeer de celpellet de isotype controle en het antilichaam gekleurd monster worden opgelost in 300 pi 0,5 mg / ml propidium iodide / 2% FBS / PBS oplossing. Plaats de buizen op ijs tot het sorteren.

4. Cell Sorting

1. Gebruik de volgende materialen voor het opzetten van het instrument; alignment parels zoals commerciële fluorescerende deeltjes, fosfaatgebufferde zoutoplossing gebaseerd omhullingfluïdum and drop delay parels, zoals Accudrop fluorescerende kralen.
2. Isoleer het gezuiverde menselijke LEC op een multi-parameter fluorescentie geactiveerde celsortering instrument. Stel het instrument en lijn als per aanbevelingen van de fabrikant. Bovendien run single vlek compensatie controles elke soort de vergoeding matrix produceren en aldus aanzienlijke bloeding te elimineren door middel van de emissie van fluorochromen zoals PE in de PE-Cy channel.
   Opmerking: Een groter gedeelte van de FACS gesorteerde cellen overleven de isolatie wanneer een 100 urn mondstuk gebruikt waarbij cellen worden gesorteerd in endotheelcellen medium.

5. Cell Culture Bericht FACS sorterening

1. Na het sorteren, centrifuge cellen bij 300 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 5-10 ml medium (afhankelijk van de kolf gebruikt om de cel zaad). Indien minder dan 50.000 cellen gesorteerd, de cellen gekweekt in fibronectine gecoate 25 ^cm2 kolf.
2. Verder kweken van de cellen in 75 cm ^{2-fibronectine} beklede kolf bij 37 ° C in een 5% CO _2, air bevochtigde incubator. Wijzig media na 2 dagen.
   OPMERKING: Cell media wordt elke tweede dag veranderd, omdat het verlengen van de tijd tussen media veranderingen lijkt te overleven van de niet-endotheelcellen bevoordelen. We valideren de lymfatische endotheelcellen fenotype met behulp van immunohistochemische detectie van markers: PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 en CD31 wanneer de cellen zijn in de eerste split voor verdere expansie ^15.

Results

Na de eerste digestie weefsel na 24 uur in kweek van niet-gefractioneerde monsters onderscheiden endotheelcel kolonies worden waargenomen (Figuur 2A) met fibroblast-achtige cellen en gladde spiercellen. Na het sorteren en na 24 uur in celkweek, de CD34 ^Lage CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos podoplanin ^Pos cellen hechten en laten typische geplaveide morfologie (figuur 2B en C). De FACS hierboven beschreven, zijn we in staat om cellen te zui...

Discussion

LEC's spelen een belangrijke rol bij het handhaven van homeostase fluïdum, immuunrespons tegen vreemde antigenen en opname en het transport van bepaalde nutriënten. LEC homeostase kan worden beïnvloed door ziekteprocessen zoals bacteriële infecties en tumormetastase, maar LEC ook somatische mutaties die resulteren in de vorming van disfunctionele lymfevaten en significante morbiditeit voor de getroffen patiënten. Om meer inzicht in de lymfatische misvorming etiologie te krijgen door middel van in vivo impla...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Gebazigd voor het verzamelen van weefselmonsters uit de operatiekamer.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit bevat 500 ml EBM-2 media en humane EGF, hydrocortison, gentamycine (GA-1000), foetaal bovien serum (FBS), VEGF, humane FGF-b, R3-IGF-1 en ascorbinezuur.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Volledige endotheelcel media wordt aangevuld met 50 ng/ml VEGF-C
Antibioticum-antimycoticum oplossing (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	Deze oplossing bevat 10.000 U/ml penicilline, 10.000 mg/ml streptomycine en 25 mg/ml Fungizone antimycoticum. Gebruik bij 1:100 verdunning.
Fibronectine uit menselijk plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Gebazigd bij 10 mg/ml concentraties. Het kan tot 1 maand worden hergebruikt indien op 4 °C bewaard en steriel gehouden. Gebruik 7 ml om 150 cm2 flesjes te coaten.
StemPro Accutase Celdissociatie reagens	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® wordt gebruikt op 0,05 ml per cm2 om het gehele oppervlak van de fles te bedekken. Het gebruik van kleinere volumes kan resulteren in onvolledige celafscheiding.
0,4% Trypan Blauw kleurstof	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Gebazigd als een levensvatbaarheidskleurstof.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Gebazigd op 0,04%
Collageenase II	Worthington Lab	4176	Gebazigd op 0,25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Gebazigd op 0,01%
70 mm nylon cel zeefjes	BD Falcon	352350
[header]
PE-geconjugeerd VEGFR-3 klon 9D9F9, klon WM59	BioLegend	356204	Gebazigd op 1:50 verdunning
PE-Cy7-geconjugeerd CD34, klon 581	BioLegend	343516	Gebazigd op 1:200 verdunning
APC-geconjugeerd muis anti menselijk CD31, klon WM59	BioLegend	303116,	Gebazigd op 1:100 verdunning
Alexa 488-geconjugeerd rat anti menselijk Podoplanin, klon NC-80.	BioLegend	337006	Gebazigd op 1:200 verdunning
PE-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21	BioLegend	400112	Gebazigd op 1:50 verdunning
PE-Cy7-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21	BioLegend	400126	Gebazigd op 1:200 verdunning
APC-geconjugeerd muis IgG1, k isotype, klon MOPC-21	BioLegend	400120	Gebazigd op 1:100 verdunning
Alexa 488-geconjugeerd muis IgG2a, k isotype, klon RATK2758	BioLegend	400525	Gebazigd op 1:200 verdunning