Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Summary

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Abstract

De incidentie van zowel esophageal adenocarcinoom en haar voorloper, Barrett's Metaplasie, snel stijgen in de westerse wereld. Verder esophageal adenocarcinoom in het algemeen een slechte prognose, met weinig verbetering in overleving afgelopen jaren. Dit zijn moeilijke omstandigheden te bestuderen en er is een gebrek aan geschikte experimentele platformen om aandoeningen van de slokdarm slijmvlies onderzoeken geweest.

Een model van de menselijke slokdarm slijmvlies is in de MacNeil laboratorium dat, in tegenstelling tot conventionele 2D celkweek systemen, recapituleert de cel-cel en cel-matrix interacties die in vivo en produceert een volwassen gestratificeerde epitheel vergelijkbaar met die van de normale menselijke ontwikkeling slokdarm. In het kort, het model maakt gebruik van niet-getransformeerde normale primaire menselijke esophagus fibroblasten en epitheelcellen gekweekt bij een-varken afgeleide acellulaire esophageal scaffold. Immunohistochemische karakterisering van dit modeldoor CK4, CK14, Ki67 en involucrine vlekken toont juiste herhaling van de histologie van het normale menselijke slokdarm slijmvlies.

Dit model verschaft een robuuste, biologisch relevant testmodel van het menselijke oesofageale slijmvlies. Het kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om een ​​aantal research vragen waarbij de effectiviteit van farmacologische middelen en het effect van blootstelling aan milieufactoren zoals alcohol, toxinen, hoge temperatuur of gastro-oesofageale refluxaat componenten onderzoeken. Het model maakt ook langere kweek niet worden bereikt met conventionele 2D celkweek, waardoor onder meer de studie van de effecten van herhaalde blootstelling van een volwassen epitheel aan het agens van belang tot 20 dagen. Verder zijn diverse cellijnen, zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett's metaplasie kan worden in het model opgenomen processen als tumorinvasie en drugs responsivene onderzoekenss in een biologisch relevante omgeving.

Introduction

Het oesofageale slijmvlies omvat een gelaagd, plaveiselepitheel boven een laag van bindweefsel, de lamina propria, en is één van de eerste locaties aan geconsumeerde milieustressoren tegenkomen. Blootstelling aan voedingstoxines is betrokken bij het ontstaan ​​van slokdarmkanker squameus carcinoom, terwijl duodenogastro-oesofageale reflux is een kritische factor in de pathogenese van Barrett's metaplasie die is geassocieerd met een verhoogd risico om esophageal adenocarcinoom. Oesofageale carcinomen zijn de ^8e meest voorkomende kwaadaardige tumor in het Verenigd Koninkrijk mannen en slokdarmkanker adenocarcinoom neemt snel toe in de westerse wereld ^1. Verder is er weinig verbetering in ziekteprognose, met een totale 5-jaars overlevingspercentage van ongeveer 15% geweest. Er is daarom behoefte experimenteerplatforms het effect van blootstelling aan milieustressoren deze esophagus epithelium en hun mogelijke betrokkenheid bij de ontwikke onderzoekenpment van metaplasia of neoplasie.

Hoewel geïmmortaliseerde of tumorcellijnen kunnen onderzoekers om de respons van epitheelcellen deze stressoren in vitro bestuderen, blijven ze proliferatieve en niet te differentiëren in de rijpe epitheelcellen op de bovenste lagen van de oesofageale slijmvlies. Voorts kunnen cellijnen die al tumorigenese hebben ondergaan slechts beperkte informatie over de eerste reacties van normale cellen in het epitheel milieufactoren verschaffen; en dit is de fase waarin de mogelijkheden voor therapeutische interventie hoogst kunnen zijn. Tenslotte conventionele celkweek systemen niet de potentieel belangrijke interacties tussen epitheliale en mesenchymale cellen en tussen cellen en de omringende matrix die binnen de weefsels in vivo te vangen.

Diermodellen een meer realistische micro-omgeving voor het bestuderen van de reacties van de slokdarm epithelium en kan de kunstmatige inductie van gastro-oesofageale refluxziekte ² op te nemen. Het kan echter een grotere uitdaging om de milieu stressoren in deze modellen te manipuleren zijn en ze kunnen niet volledig de reactie binnen het menselijke slokdarm vertegenwoordigen.

Andere experimentele menselijke esophagus modellen ontwikkeld dat primaire cellen, geïmmortaliseerde cellen of tumorcellijnen gebruik op een collageen of gecombineerde collageen / Matrigel, scaffold met fibroblasten ^3,4. Het is minder arbeidsintensief deze scaffolds dan acellulaire esophageal scaffold in dit manuscript beschreven genereren en deze organotypische modellen verschaffen een nuttig hulpmiddel, met name in de studie van tumorinvasie ^5,6, waarbij tumorcelinfiltratie in de collageengel gemakkelijk kan worden waargenomen. Maar deze collageen gels hebben niet-inheemse mechanische eigenschappen en gebrek aan bepaalde kenmerken van het oorspronkelijke weefsel, met inbegrip van een specifiek basaal membraan en de appropriate oppervlaktetopografie. Dit kan het gedrag van cellen resulterend in beïnvloeden, bijvoorbeeld slechtere hechting tussen epitheel en scaffold bij gebruik van een collageengel scaffold ^7. Bijgevolg zijn de acellulaire varkens esophageal scaffold ontwikkeld met het voordeel dat een biologisch realistische scaffold en dus meer geschikt voor gebruik als experimenteel platform. Ook is gebleken dat het beter is om primaire cellen nemen in de esophagus constructen dan geïmmortaliseerde slokdarm epitheliale cellijnen zoals Het-1A, aangezien deze cellen vormen een gelaagd epitheel maar niet om stratificeren en differentiëren ^4,7,8 .

Bijgevolg is dit protocol werd aangepast van een methode die al in gebruik in de MacNeil laboratorium voor het maken van tissue engineered huid en het mondslijmvlies ^9,10 en bevat een de-cellularized varkens slokdarm steiger in combinatie met primaire menselijke slokdarm epitheliale cellen en fibroblasten. This protocol vormt een volwassen gestratificeerde epitheel, vergelijkbaar met die van de normale menselijke esophagus zoals blijkt uit CK4, CK14, Ki67 en involucrine kleuring. Het resulterende model biedt een experimenteel platform voor reacties op milieustressoren studeren, en daadwerkelijk is gebruikt om veranderingen in genexpressie te onderzoeken in de slokdarm epitheel in reactie op de onderdelen ¹¹ refluxaat.

Protocol

Menselijke slokdarm cellen worden verkregen van patiënten die maag of slokdarm operatie. Geïnformeerde toestemming is verkregen voor het weefsel te worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, en het weefsel anoniem gebruikt onder de juiste ethische goedkeuringen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179).

1. Isolatie van de Mens Slokdarmkanker epitheelcellen

1. Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek bereidt de epitheliale kweekmedium door menging Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en Ham's F12 in een 3: 1 verhouding (v: v). Voeg 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermale groeifactor, 0,4 ug / ml hydrocortison, 1,8 x 10 ^-4 M adenine, 5 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine, 2 x 10 ^-7 M triiodothyronine, 1 x 10 ^-10 M choleratoxine, 2 x 10 ^-3 M glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B.
2. Met behulp van standaardsteriele technieken, zet 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B in een T75 weefselkweek kolf. Voeg 1 x 10 ⁶ lethaal bestraalde 3T3 fibroblasten ¹² in 1 ml van hetzelfde medium en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer. Dit zal een voederlaag voor de volgende kweken van epitheliale cellen.
3. Met behulp van een scalpel en naar aanleiding van de aanbevelingen van een histopathologist, ontleden een ongeveer 2 cm ² monster van weefsel uit de ziektevrije achtergrond regio oesofageale plaveiselcelcarcinoom slijmvlies verkregen van patiënten die maag- of slokdarmkanker operatie. Transport naar het laboratorium in een 50 ml container steriel transportmedium (PBS 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,625 ug / ml amfotericine B) bij kamertemperatuur.
4. Op dit moment, bewaar het weefsel in de transportmedium tot 12 uur (overnacht) bij 4 ° C, gemakshalve; echter niet langer opslagfunctie gebruikt omdat zij leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cellen.
5. Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek steriliseren een scalpel door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Spoel in steriele PBS.
6. Plaats het weefsel in een steriele petrischaal en gebruik de scalpel te snijden in 0,5 cm strips. Voeg 5 ml 0,1% (gew / vol) trypsine in PBS om de petrischaal, plaats het deksel op de schaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
7. Voeg 5 ml FCS aan het weefsel in de petrischaal om het trypsine te remmen. Houd de strook van weefsel met een steriel pincet, voorzichtig schrapen de epitheliale oppervlak met de scalpel voor 1-2 min per strip aan de epitheliale cellen in het omringende medium te verwijderen. Verwijder de geschraapt weefsel en zet apart. Herhaal deze procedure voor alle weefselstrips.
8. Verzamel het medium dat het vrijstaande epitheliale cellen in een 15 ml centrifugebuisen centrifuge (5 min, 200 x g). Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 12 ml van epitheliale medium (beschreven in stap 1.1).
9. Giet af en het medium uit de feeder cellaag in de T75 fles bereid in stap 1.2 weggooien. Gebruik een steriele pipet om de celsuspensie die de vers geïsoleerde epitheelcellen aan de kolf en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer.
10. Na 24 uur giet af en gooi het kweekmedium, die ook de cel puin zal bevatten, en te vervangen door 12 ml vers epitheliale medium. Verder incuberen bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer. Kolonies zullen beginnen te verschijnen in de volgende 24 tot 48 uur en kan worden bekeken door het plaatsen van de kolf onder een standaard lichtmicroscoop. Giet het verbruikte kweekmedium en vervangen door een gelijk volume vers medium elke 2-3 dagen.
11. Zodra de kolf 80% confluentie, passage van de cellen ¹³ bereikt. Splits de cells in een verhouding van 1: 5 tot celaantallen te verhogen voor toepassing bij het model. Volg stap 1,2 tot voedingslagen van bestraalde 3T3 cellen vast in elke kolf die wordt ontvangen epitheelcellen 24 uur vóór passage van de cellen.
    Opmerking: Gebruik de epitheelcellen in de slokdarm model hieronder beschreven tussen passages 1 en slechts 4.

2. Isolatie van Human Slokdarmkanker fibroblasten

1. Werken in een laminaire stroming kabinet en het gebruik van steriele techniek, neem de opzij gezet in stap 1.7 weefsel. Leg ze in een steriele petrischaal en gehakt fijn door te hakken met een steriele scalpel. Voeg 10 ml 0,5% (w / v) collagenase A oplossing en plaats het deksel op de petrischaal en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer.
2. Breng het digest op een 15 ml centrifugebuis en gecentrifugeerd (10 min, 200 x g), giet uit de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 10 ml van fibroblast kweekmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 ^-3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B).
3. Plaats de suspensie in een T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer. Na 24 uur giet het medium, dat puin zal bevatten en te vervangen door 12 ml vers fibroblast medium. Vervang het kweekmedium om de 2 tot 3 dagen en passage cellen eenmaal ze 80% confluentie ¹³ bereikt, splitsing van de cellen in een 1: 5 verhouding celaantallen stijgen.
   Opmerking: Gebruik de fibroblast cellen in de hieronder beschreven tussen passages 4 en slechts 10 model.

3. Voorbereiding van de De-cellularized Slokdarmkanker Steiger

1. Verkrijgen intact esophagi varkens in het slachthuis van vers geslachte Landrace varkens die worden gebruikt voor de productie van levensmiddelen. Een enkele slokdarm voldoende steigers voor ongeveer 30 afzonderlijke constructies.
   Let op: Als gevolg van de uitgebreide en tijd consuming sterilisatie protocol vereist, is het normaal de moeite waard het verkrijgen en verwerken van een minimum van 10 esophagi in een keer.
2. Onmiddellijk plaatsen van de vers uitgesneden slokdarm naar een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml 10% povidon-joodoplossing gedurende 5 min elke verontreinigende microbiële reduceren. Breng de slokdarm naar een tweede pot die ongeveer 100 ml steriel PBS bevattende 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, en 1,25 ug / ml amfotericine B.
   1. Plaats de deksel op de houder en transporteren esophagi naar het laboratorium bij kamertemperatuur. Twee of drie esophagi kan in elke container, afhankelijk van hun grootte.
3. Eenmaal in het laboratorium, het handvat van het weefsel in een laminaire stroming kap met behulp van een aseptische techniek om microbiële besmetting te minimaliseren. Steriliseer pincetten, scharen en scalpelbladen door onderdompeling gedurende 5 minuten in 70% ethanol, en spoelen in steriel PBS.
4. Behandel de esophagus met steriele pincet. Met behulp van de schaar, de lengte opengesneden de slokdarm. Spoel het weefsel door het plaatsen van de slokdarm naar een 180 ml steriele pot die ongeveer 100 ml steriel PBS en voorzichtig schudden om vuil te verwijderen.
5. Reinig een kurk dissectie board door te besproeien rijkelijk met 70% ethanol en laten drogen.
6. Verwijder de slokdarm van de PBS, en het gebruik van steriele naalden, pin uit de slokdarm op het bord, slijmvliesoppervlak bovenste. Pak het mucosale oppervlak aan één uiteinde van de slokdarm met steriele pincet en weg te trekken van het bord. Hierdoor wordt het slijmvlies te scheiden van de onderliggende submucosa.
   1. Vervolgens een steriele scalpel de slokdarm longitudinaal ontleden langs de lamina propria, verwijderen kunnen de dissectie vordert om de mucosa weg te heffen.
7. Bewaar de ontleed slijmvlies en de onderliggende submucosa weggooien.
8. Knip en gooi de meest proximale en distale 2 cm van tHij mucosa aangezien er een groter aantal submucosale klieren en een dikkere lamina propria in die gebieden, respectievelijk ^7.
9. Met een scalpel om de resterende weefsel in 5 ^cm2 gesneden. Plaats alle de cut weefsel in een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml steriele PBS en schud voorzichtig om het weefsel te spoelen. Indien voor meer dan vijf esophagi tegelijk kan het noodzakelijk zijn om meerdere potten daarvan en de drie daaropvolgende stappen gebruikt.
10. Met steriele pincet, breng de gesneden weefsel in een 180 ml pot met 150 ml steriel 1 M NaCl, 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine en 1,25 ug / ml amfotericine B. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C.
11. Plaats het weefsel in een frisse 180 ml pot met 150 ml steriel PBS. Het epitheel is begonnen zichtbaar te scheiden van het onderliggende weefsel. Zachtjes schil de los epitheel van het varken slokdarm met steriele pincet en weggooien.
    1. Overgebleven tkwestie in een frisse 180 ml pot en voeg 150 ml steriele PBS. Schud zachtjes gedurende 5 min te wassen. Giet het PBS en herhaal nog tweemaal met verse PBS.
12. Doe alle weefsel in een 500 ml glazen flesje met 400 ml steriel 80% (v / v) glycerol oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Breng 400 ml van steriele 90% (v / v) glycerol oplossing gedurende nog eens 24 uur.
13. Bewaren in 400 ml steriele 100% glycerol oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4 maanden uitdrogen en steriliseren weefsel terwijl de integriteit van de basaalmembraan.

4. De productie van de Cultuur Media

1. Bereid gechelateerde pasgeboren kalfsserum voor toepassing in het kweekmedium.
   1. Giet 100 g Chelex 100 in een glazen 1 liter fles en voeg gedeïoniseerd water. Het exacte volume is niet kritisch, maar voldoende water worden toegevoegd aan de Chelex poeder bedekken. Voeg een magnetische roerder en steriliseren in de autoclaaf (121 ° C gedurende15 min).
   2. Laat de fles af te koelen en de Chelex om zich te vestigen. In een laminaire flowkast giet het overtollige water, voeg 500 ml pasgeboren kalverserum (NCS) en laat een nacht roeren bij 4 ° C.
   3. Stop met roeren en laat het Chelex om zich te vestigen, dit kan tot 30 min. In een laminaire flowkast decanteer het gechelateerde serum met een steriele pipet, verzorgen de Chelex en opslag niet te verstoren in 10 ml porties bij -20 ° C.
2. Bereid drie verschillende media in een laminaire stroming kast, te beginnen met de pro-proliferatieve en eindigend met pro-differentiatieve formuleringen.
   1. Bereid Composite Medium I bestaat uit DMEM en Ham F12 in een 3: 1 verhouding (v: v), 4 x 10 ^-3 M L-glutamine, 0,5 ug / ml hydrocortison, 1 x 10 ^-4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 ^-12 M triiodothyronine, 1,8 x 10 ^-4 M adenine, 1,88 x 10 ^-3 M CaCl _2, 4 x 10 ^-12 M progesteron, 10 ug / ml inSulin, 10 gg / ml transferrine, 10 ng / ml seleen, 1 x 10 ^-3 M ethanolamine en 0,1% (v / v) gecheleerd NCS.
   2. Bereid Composite Medium II Composite Medium I dan vervangen gechelateerde serum met 0,1% (v / v) niet-gechelateerde NCS.
   3. Bereid Composite Medium III Composite Medium II welaten progesteron en verhoging serum 2% (v / v) niet-gechelateerde NCS.

5. De productie van de Human Esophageal Mucosa Model

1. Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming kap, met behulp van aseptische techniek om een ​​steriele omgeving te behouden. Steriliseer alle gereedschappen door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten, voor het spoelen in steriel PBS.
2. De dag voordat het nodig is, hydrateren de acellulaire varkens esophageal scaffold. Een stuk van scaffold vereist voor elke construct wordt bereid.
   1. Om het weefsel plaats voldoende stukken van varkens steiger hydrateren in een pot met 100 ml steriel PBS, ageren en genieten voor de 10 min. Decant de PBS en te vervangen door verse PBS. Herhaal het wasproces vijfmaal verwijdering van alle sporen glycerol te verzekeren.
3. Test de steiger steriliteit door het incuberen van het weefsel overnacht gerehydrateerd in 100 ml DMEM bij 37 ° C. Als er geen verandering in de kleur of troebelheid van het kweekmedium aan het eind van de incubatieperiode het skelet wordt verondersteld steriel zijn. Zodra steriliteit is bevestigd, plaatst de 5 cm ² acellulaire scaffold in een 6 wei-plaat, submucosale kant naar boven.
4. Plaats een steriele chirurgisch stalen ring (inwendige diameter 10 mm, uitwendige diameter 20 mm) op het midden van elke steiger en voorzichtig aandrukken met steriele forceps, een voldoende afdichting met het weefsel te verzekeren.
5. Oogst de fibroblasten via trypsine-EDTA ¹³ om een celsuspensie te produceren. Tel de cellen met een hemocytometer ^14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de celpellet in een Aangepast decorte volume van fibroblast medium tot een uiteindelijke celgetal van 2,5 x 10 ⁶ cellen per ml produceren.
6. Voeg 0,2 ml van fibroblast medium, dat 5 x 10 ⁵ mens slokdarm fibroblasten, in elke ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van fibroblast medium. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer.
7. Na 24 uur verwijdert de ringen en fibroblast medium en voeg ten minste 5 ml vers fibroblast medium aan elk putje zodat de steiger zich geheel in medium. Kweek gedurende 1 week bij 37 ° C in een 5% _CO2 bevochtigde atmosfeer vervangen van het medium elke 2 tot 3 dagen.
8. Na 1 week verwijder de 6 goed platen met de steigers om een ​​laminaire overstroming kap, verwijder het medium en keer elke steiger met behulp van een steriel pincet, het plaatsen van het mucosale oppervlak bovenste. Dit tijdstip is aangeduid als dag 0.
9. Plaats de stalen ringen aan het slijmvliesoppervlak in het midden vanhet weefsel in stap 5.4.
10. Bereid de T75 kolven van epitheelcellen van ¹³ trypsine. Nadat de PBS te wassen en voorafgaand aan het toevoegen van trypsine-EDTA-oplossing, voeg 2 ml steriel 0,02% (w / v) EDTA-oplossing aan elke kolf. Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C. Tik op de kolf voorzichtig om selectief los de i3T3 feeder laag terwijl de epitheelcellen bevestigd.
    Opmerking: Het is meestal niet praktisch of nodig patiënt overeenkomen met de epitheelcellen van de reeds opgenomen in het model de voorafgaande week fibroblasten.
11. Giet de EDTA-oplossing die het voederlaag toevoegen trypsine-EDTA-oplossing om de epitheelcellen ¹³ oogsten. Tel de cellen met een hemocytometer ^14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de cel pellet in een geschikt volume van Composite Medium 1 tot een uiteindelijke celgetal van 5 x 10 ⁶ cellen per ml produceren.
12. Voeg 0,2 ml van Composite Medium I, met 1 x 10 ⁶ epitheelcellen in de ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van Composite Medium I en plaats de constructen in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO _2, vochtige atmosfeer.
13. Na 24 uur (dag 1) verwijder de ringen en medium en voeg ten minste 5 ml vers Composite Medium I, zodat de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator. Na nog eens 24 uur (dag 2) Verwijder het medium en vervangen door ten minste 5 ml Composite Medium II en zorgt op de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator.
14. Op dag 4 place steriele medische kwaliteit roestvrij staal gaas roosters (2 cm breed x 2 cm lang x 0,5 cm hoog), in de frisse 6 well platen, één per construct. Gebruik steriele pincet om de constructen te brengen op de bovenzijde van de stalen roosters, slijmvliesoppervlak boven.
    1. Voeg voldoende Composite Medium III zodat de vloeistof bereikt de onderzijde van de samengestelde, maar het oppervlakblootgesteld aan de lucht, zorgt dit ervoor dat het monster wordt op een lucht-vloeistof grensvlak. Het juiste volume medium gevraagd, zal variëren afhankelijk van de dikte van het skelet, het volume van de put en de precieze hoogte van de roestvrij stalen rooster.
15. Handhaaf de samenstellingen bij een lucht-water grensvlak gedurende tussen 10 en 20 dagen (dag 14 tot dag 24), afhankelijk van de vereisten van het experiment. Vervang de Composite Medium III met vers medium elke 2 tot 3 dagen (maandag, woensdag, vrijdag is een gebruiksvriendelijke regime).
    Let op: Na 5 dagen bij een lucht-vloeistof interface (Dag 9) de constructen hebben een voldoende rijp oesofageale epitheel worden gebruikt in experimenten van de invloed van omgevingsfactoren op de slokdarm epitheel.
16. Aan het eind van het experiment, bevestig de constructen voor histologische analyse en immunohistochemische kleuring ⁷ of extract eiwit ¹⁵ of RNA ^11,16 van het epitheel voor verdere analysis. Desgewenst behoudt het geconditioneerde kweekmedium voor analyse van extracellulaire signaalmoleculen ^17.

Results

Dit manuscript beschrijft het proces benodigde getoond in schematische vorm in figuur 1, de cultuur 3D-modellen van de menselijke esophagus epithelium succes. Om de geschiktheid van het model te bevestigen als experimenteel platform histologische en immunohistochemische studies uitgevoerd vergelijken van de gekweekte normale humane weefsels esophageal squameuze slijmvlies.

Histologische evaluatie van het epitheel door de beschreven werkwijze wordt een volwassen, multi-layere...

Discussion

Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een biologisch relevante menselijke esophagus mucosale model geschikt voor gebruik als een experimenteel platform om het effect van blootstelling aan milieustressoren op de esophagus epithelium bestuderen.

De belangrijkste stappen voor de succesvolle productie van een humaan oesofageale slijmvlies model zijn: ervoor zorgen dat de meeste epitheelcellen proliferatieve blijven zitten en nog niet begonnen te differentiëren voordat ze ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsine	BD Biosciences	215240	Bereid 0,1% w/v oplossing in PBS en filter steriliseer. Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
Foetaal Kalfs Serum	Labtech	FB-1090
Epidermale Groeifactor	R+D Systems	236-EG-200	Bereid 200 µg/ml stockoplossing in 10 mM azijnzuur, 1% FCS
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0396	Bereid stockoplossing in PBS en filter steriliseer voor gebruik
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Bereid stockoplossing in PBS en filter steriliseer voor gebruik
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Bereid 10 mg/ml oplossing in 0,01 M HCl, verdun 1:10 in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik
Transferrine	Sigma-Aldrich	T2036	Bereid stockoplossing in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Bereid stockoplossing in gedestilleerd water en filter steriliseer voor gebruik
Cholera toxine	Sigma-Aldrich	C8052	Bereid stockoplossing in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Merknaam Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Los 1 tablet op in 100 ml water en autoclaveer om te steriliseren
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidon-jodium oplossing	Ecolab	10830E	Merknaam Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Nieuwgeboorte kalfs serum	Gibco	26010074
Progesteron	Sigma-Aldrich	P8783	Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik
O-fosforylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Bereid stockoplossing in DMEM en filter steriliseer voor gebruik
ITS (insuline, transferrine, selenium)	Lonza	17-838Z	Wordt gebruikt voor de bereiding van samengesteld medium
Trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
EDTA 0,02% oplossing	Sigma-Aldrich	E8008	Verwarm in 37 °C waterbad voor gebruik
T75 kweekflacon	VWR	734-2313
50 ml centrifugeerbuis	Fisher	11819650
15 ml universele buis	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petrischaal	SLS	150350
6 welbewerkte plaat	VWR	734-2323
roestvrij stalen ringen			Gefabriceerd in huis - medisch graad roestvrij staal, binnendiameter 10 mm, buitendiameter 20 mm
staalgaasroosters			Gefabriceerd in huis - vellen hebben gaten met een diameter van 0,3 cm, gebogen om rooster 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0,5 cm (h) te produceren
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Kloon MM1. Gebruik bij 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Kloon 6B10. Gebruik bij 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Kloon LL002. Gebruik bij 1:200.
Involucrine	Novocastra	INV	Kloon SY5. Gebruik bij 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Muis 3T3 fibroblasten	ATCC-LGC	CRL-1658	eerder groeiachterstand veroorzaakt door bestraling (60 Gy)