Een enzymatische methode om mesenchymale stamcellen te redden van klonterde beenmergmonsters

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen worden meestal verkregen uit beenmerg en vereisen expansiekweek. Wanneer monsters stollen voordat ze worden verwerkt, kan een protocol met het (enzymatische) trombolytische medicijn urokinase worden toegepast om het stolsel af te breken. Zo worden cellen vrijgemaakt en beschikbaar voor expansiekweek. Dit protocol biedt een snelle en goedkope alternatief voor herbemonstering.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSC's) - meestal verkregen uit beenmerg - vereisen vaak expansiekweek. Ons protocol gebruikt urokinase van klinische kwaliteit om stolsels in het beenmerg af te breken en MSC's vrij te maken voor verder gebruik. Dit protocol biedt een snelle en goedkope alternatief voor beenmergresampling. Beenmerg is een belangrijke bron van MSC's, die interessant zijn voor weefselengineering en autologe stamceltherapieën. Bij onttrekking kan beenmerg stol, omdat het het hele hematopoëtische systeem omvat. De resulterende stolsels bevatten ook MSC's die verloren gaan voor expansiekweek of directe stamceltherapie. We hebben ervaren dat 74% van de hondenbotmergmonsters stolsels bevatte en minder dan de helft van het aantal stamcellen opleverde dat werd verwacht van ongestolde monsters. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld voor enzymatische vertering van die stolsels om arbeidsintensieve en kostbare beenmergresampling te vermijden. Urokinase - een klinisch goedgekeurd en gemakkelijk verkrijgbaar trombolytisch medicijn – verwijdert de beenmergstolsels bijna volledig. Als gevolg hiervan leveren behandelde beenmergaspiraten vergelijkbare aantallen MSC's op als ongestolde monsters. Ook na behandeling met urokinase behielden de cellen hun metabolische activiteit en het vermogen om te differentiëren in chondrogene, osteogene en adipogeene lijnen. Ons protocol redt gestolde bloed- en beenmergmonsters zonder de kwaliteit van de cellen te beïnvloeden. Dit maakt hersampling overbodig, vermindert de bemonsteringskosten aanzienlijk en maakt het gebruik van gestolde monsters voor onderzoek of therapie mogelijk.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Ze kunnen migreren, differentiëren in verschillende celtypes ¹ en inenten, waardoor ze de ideale kandidaten voor autologe therapieën ^2,3 maakt. De laatste tijd, klinische studies met behulp van MSC's voor bot en kraakbeen reparatie, graft-versus-host ziekte of hart-en vaatziekten werden gelanceerd ^4. Deze MSC's kunnen worden geoogst uit de navelstreng of vetweefsel maar veelbelovende resultaten werden verkregen uit beenmerg afgeleide stamcellen ^5.

De iliac crest maakt een aanzienlijke hoeveelheid beenmerg verzamelen en dient derhalve hoofdplaats aspiratie ^6. De kwaliteit van het aspiraat afneemt met toenemende hoeveelheid beenmerg ingetrokken. Terwijl de eerste 5 ml beenmergaspiraat bevatten MSC's van hoge kwaliteit, de intrekking van grotere volumes leidt tot verwatering van het aspireren met perifere bloed fROM De vaatrijke bot ^7. Door de onderhavige megakaryocyten en bloedplaatjes, beenmerg aspiraten zijn verklonteren, tenzij anticoagulantia gebruikt. Maar zelfs met anticoagulantia, kunnen stolsels voordoen.

In beenmerg MSCs slechts een klein deel van het totale celpool ⁸ en moet in kweek geëxpandeerd meeste tissue engineering of therapeutische toepassingen ^4. De kwaliteit van een dergelijke cultuur is grotendeels afhankelijk van de initiële cel zwembad, dwz., Diversiteit en een hoog startnummer ^9. Lage aantallen MSC's uit de markt nemen kan gedeeltelijk verklaard worden door donor variabiliteit. Aan de andere kant, MSC's van lage kwaliteit monsters vereisen een langere tijd in cultuur en uitgebreid passage naar het gewenste aantal cellen te bereiken. In beide gevallen verlengd passages is een bron van celsenescentie en kan leiden tot verlies van differentiatie potentieel ^10. Daarom geoptimaliseerde protocollen die cel y kunnen maximaliserenield en te voorkomen dat nadelige gevolgen moeten worden ontwikkeld ^11,12.

Toen we begonnen te werken met honden MSC's, we waren verbaasd om te zien dat ongeveer drie op de vier honden beenmerg monsters bevatte stolsels, terwijl gelukkig clotted menselijke stalen (één op de tien) waren minder frequent. Aan de andere kant was het geen verrassing, dat zagen we veel lagere opbrengst van MSC's uit gestolde monsters. Om de steeds terugkerende probleem van de gestolde monsters op te lossen, het protocol ontwikkelden we met behulp van de trombolyticum urokinase in plaats van resampling.

Trombolytische therapie kan levensbedreigende situaties als afsluiting van de bloedvaten hartaanval, beroerte of embolieën door ongewenste stolling tegengaan. Zij werken door afbraak van de stolsels door enzymatische splitsing van fibrine door plasmine en enzymatische plasminogeen activatoren. Ondanks het ruime gebruik voor de behandeling van patiënten, slechts zeer weinig publicaties bestaan ​​die gebruikt trombolytische activiteitenvoor laboratorium toepassingen gestolde monsters redden, vooral gericht op lymfocyten. In 1987, Niku et al. de toepassing beschreven van streptokinase voor het oplossen van bloedstolsels resulteert in functionele lymfocyten ¹³ en vier jaar later, De Vis et al. uitgebreid gebruik van streptokinase leukemiecellen isoleren uit bloed en beenmerg flowcytometrische toepassingen ^14. Een meer recente publicatie suggereert het gebruik van Alteplase voor de diagnostiek van kanker ^15. Tijdens het gebruik van de dezelfde enzymatische benadering, ons protocol richt zich op de isolatie van multipotente MSC vorm beenmerg om een ​​hulpmiddel voor onderzoekers op het gebied van stamcellen bieden.

Protocol

OPMERKING: Human beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld van toestemming donoren met goedkeuring van de ethische commissie van het kanton Luzern. Canine beenmergaspiraten uit het bekken werden verzameld hond eigenaar consent.Human (ong. 20 ml) en honden (ong. 10 ml) beenmergaspiraten waren anti-gecoaguleerd door toevoeging van 15 ml 3,8% natriumcitraat onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor verwerking op dezelfde dag als ingetrokken.

1. Bereiding van Urokinase (Vóór 1 ^st gebruik)

1. Reconstitueren urokinase met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de instructies van de fabrikant: Voeg 10 ml PBS aan het septum inlaat kolf met een injectiespuit 10 ml. Los de droge stof door werveling tot 50.000 injectie units (U) per ml te verkrijgen.
2. Bereid 500 ul porties (25.000 U elk) in sterile buizen. WINKEL aliquots -20 ° C en gebruiken wanneer vereist voor ten minste 6 maanden.

2. Preparatief Stappen (Voorafgaand aan iedere Bone Marrow Treatment)

1. Ontdooi een aliquot van urokinase (25,000 U) per geklonterd beenmergaspiraat (weggezogen volumes tot 25 ml met succes behandeld met een hoeveelheid van 25.000 U).
2. Verwarm een ​​waterbad of schudincubator tot 37 ° C.

3. Enzymatische Digest van het Clot

1. Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming bioveiligheid kast om microbiële besmetting van het beenmerg monsters tijdens de verwerking te voorkomen. Bij het werken met potentieel besmettelijk menselijk materiaal, is het gebruik van beschermende handschoenen en een zorgvuldige behandeling geadviseerd.
2. Plaats een 100 urn zeef cel op een steriele buis van 50 ml. Giet de beenmergaspiraat door de cel zeef, het kantelen van de zeef of bewegen rond het stolsel materiaal. Gebruik een steriele pipet tip voorbetere doorstroming door het filtergaas.
   OPMERKING: Vermijd elke verdunning van het stolsel, bijvoorbeeld door het wassen van het stolsel met PBS. Urokinase werkt indirect vereist componenten van het serum (bijv., Plasminogeen) van de biopsie doeltreffende digest. Terwijl de voortzetting van de procedure het stolsel materiaal, kan het filtraat bij kamertemperatuur bewaard tot gebruik in stap 3.6.
3. Transfer het beenmerg stolsel materiaal in een lege cel cultuur schotel met behulp van een steriel pincet. Snijd het vuil in kleine stukjes van ongeveer 2 mm ³ met een steriele scalpel.
4. Breng de kleine deeltjes van het stolsel in een 50 ml reageerbuis met de steriele pincet. Zorg ervoor dat het gehakt stolsel heeft een natte verschijning. Indien droog lijkt, gebruik van sommige van het filtraat uit stap 3.1 te bevochtigen.
5. Vermaal het stolsel door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml microtiter- pipet. Voeg 1 portie van urokinase aan het monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C ofwel in een waterbad ofeen schudden (zachtjes) incubator.
6. Vermaal door en neer te pipetteren voor 5 keer met behulp van een 5 ml pipet. Voer deze stap in een bioveiligheid kast. Incubeer nog eens 30 minuten bij 37 ° C. Na de incubatie, vermaal nogmaals 5 keer met een 5 ml pipet. Pass over een verse 100 micrometer cel zeef te bundelen met het filtraat uit stap 3.2.
7. Centrifugeer de celsuspensie bij omgevingstemperatuur gedurende 10 min bij 500 x g. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in media zoals hieronder beschreven of volgens de standaardprocedure van laboratorium MSC expansie cultuur.

4. Zaaien voor uitbreiding van de Cel Cultuur en CFU Platen

1. Resuspendeer de cellen (bestaande uit erythrocyten en mononucleaire cellen) in 50 ml basismedium: alfa-MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2,5 mg / ml amfotericine B . Tel de cellen 1:10 verdund in trypaanblauw oplossing met behulp van een Neubauer chamber.
2. Plaat de cellen in celkweek kolven bij de dichtheid van 5 x 10 ⁷ cellen / ^cm2 en geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C. Indien beschikbaar, gebruik hypoxische (5% zuurstof) voorwaarden. Voor de CFU assay controle plaat 10 ⁹ cellen in een celkweek schaal van 10 cm diameter.
3. Na 3 dagen kweken worden mesenchymale stamcellen aan de celkweek schotel bevestigd terwijl andere cellen in suspensie blijven. Verander het medium met basaal medium aangevuld met 5 ng / ml basische fibroblast groeifactor (bFGF). Voor de CFU-test controle, behandel de celkweekschaaltje evenzo.
4. Verder celkweek voor een totaal van 2 weken uitwisseling media drie keer per week. Als cellen meer dan 80% samenvloeiing, gesplitst door behandeling met trypsine. Voor de CFU assay controle wisselen de media eveneens, maar de cellen niet opgesplitst tijdens de twee weken.

5. Giemsa Stain voor CFU Assay

1. Bereid 10 ml van Giemsa-oplossing per gerecht: dilute de stockoplossing (7,6 g / l Giemsa in glycerol: methanol) 1:10 in steriel water (altijd voor te bereiden een frisse werkende verdunning).
2. Verwijder de media uit de cel cultuur schotel en was de cellen met PBS. Wees zeer voorzorg bij de toepassing van vloeistof aan de petrischaal en te voorkomen dat het wassen uit de cellen.
3. Fix cellen in pure methanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de Methanol. Voeg de Giemsa-oplossing en incubeer gedurende 60 min in een bevochtigde incubator bij 37 ° C.
4. Was tweemaal met PBS. Lucht droog de plaat hoofd eerst op een stuk keukenpapier. Tel de kolonies handmatig. Dit wordt het best bereikt door een markeerstift op de achterkant van de plaat.

6. MSC Differentiatie

1. Canine MSC differentiatie
   OPMERKING: Canine MSC's werden in chondrogene en osteogene adipogenic lineages gedifferentieerd door stimulatie met de juiste media voor vier weken.
2. Voor Adipogenic differentiatie, cultuur MSC's in monolaag op 4 x 10 ⁵ ceLLS / ^cm2 afwisselend twee verschillende kweekomstandigheden als volgt;
   1. Cultuur in adipogenese onderhoudsmedium DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B en 170 mM insuline.
   2. Cultuur in vetcel- inducerende media met het onderhoud medium aangevuld met 3% FBS, 5% konijnenserum, 1 uM dexamethason, 500uM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 33 uM biotine, 5 uM rosiglitazon en 17 uM pantothenaat ^16.
   3. Revel de vetdruppels door kleuring met Oil Red-O. In het kort, fix cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlekken met 0,35% Olie rode O in isopropanol.
3. Voor osteogene differentiatie cultuur MSCs in monolaag 7 x 10 ³ cellen / ^cm2 en stimuleren het volgende:
   1. Geavanceerde DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 501, M L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 10 mM ß-glycerofosfaat en 100 nM dexamethason.
   2. Identificeer de mineralisatie deposito's van Von Kossa vlek (5% AgNO _3). Kort vast de cellen met 10% formaldehyde, wassen met PBS en vlek met 5% _AgNO3 in gedestilleerd water.
4. Chondrogene differentiatie
   1. Cut blokjes (3 mm per zijde) van een spons gevormde medische inrichting, gevormd uit gevriesdroogde collageen type I, en als dragermateriaal voor cel ¹⁷ te ondersteunen.
   2. Zaad MSCs op de bovenkant van de kubussen bij een concentratie van 4 x 10 ⁶ cellen / ml (~ 70.000 cellen / cube).
   3. Vóór de toevoeging van media, zodat de cellen hechten aan de kubussen voor 30 min.
   4. Handhaaf MSC-collageen constructen chondrogene media bestaande uit DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 pg / ml amfotericine B, 40 ng / ml dexamethason, 50 ug / ml ascorbinezuur -2-fosfaat,50 ug / ml L-proline, 1x insuline-transferrine-Seleen X, en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1.
   5. Gebruik alcianblauwkleuring om ophoping van proteoglycanen visualiseren in constructies secties. In het kort, vlekken de secties O / N met 0,4% alcianblauw opgelost in 0,01% H ₂ SO ₄ en 0,5 M guanidinehydrochloride. Vervolgens werden was de secties gedurende 30 min gewassen in 40% DMSO en 0,05 M _MgCl2. Cellen werden tegengekleurd met nucleaire snel rood.

Resultaten

Het feit dat 74% van canine beenmerg monsters (n = 54) die stolsels bij hun aankomst in ons laboratorium (Figuur 1A) met verminderde MSC opbrengsten uit deze monsters, maakte ons geloven dat een aanzienlijk aantal MSC's werd gevangen in de stolsels . Inderdaad, een eenvoudige DAPI-kleuring van coupes stollen materiaal bevestigt de aanwezigheid van kernhoudende cellen in hoge dichtheid (Figuur 1B). Dit leidt uiteindelijk tot lage aantallen MSC's beschikbaar voor uitbreiding van d...

Discussie

Routinematig proeven we beenmerg terwijl de patiënt ondergaat een operatie (in ons geval vooral wervelkolom chirurgie), met het voordeel dat slechts weinig extra werk heeft verricht door het personeel in de operatiekamer te voeren. Hoewel de monsters onmiddellijk na verwijdering worden gemengd met natriumcitraat, vele monsters werden gedeeltelijk gestold bij hun aankomst in het laboratorium voor verwerking. In dit stadium zou resampling om clotted exemplaren te vervangen afzonderlijke extra ingreep weer noodzakelijk pla...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Basal Medium Components
PenStrep 100X	Gibco	15140122
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine	Amimed	1-23S50-I
FBS Heat Inactivated	Amimed	2-01F36-I
Amphotericin B	Applichem	A1907
Adipogenic Medium Components
DMEM-HAM F12 + GlutaMAX	Amimed	1-26F09-I
Insulin	Sigma	I5500
Rabbit serum	Gibco	16120099
Dexamethasone	Applichem	D4902
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma	I5879
Biotin	Sigma	B4639
Rosiglitazone	Sigma	R2408
Pantothenate	Sigma	P5155
Oil Red-O	Sigma	O0625
Osteogenic Medium Components
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
ß-glycerophosphate	Sigma	G9422
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma	S6506
Chondrogenic Medium Components
Biopad - sponge shaped medical device	Euroresearch
L-proline	Sigma	P5607
Insulin-Transferrin-Selenium X	Gibco	51500056
Human transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21
Alcian Blue 8GX	Sigma	A3157
Nuclear fast red	Sigma	N8002
Generic
Tri-Sodium citrate dihydrate	Applichem	A3901
PBS	Applichem	964.9100
Urokinase	Medac	1976826
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Giemsa stain	Applichem	A0885
Formaldehyde	Applichem	A0877
Sulfuric acid (H2SO4)	Applichem	A0655
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Applichem	A1584
Magnesium chloride (MgCl2)	Applichem	A3618
Guanidine hydrochloride	Applichem	A1499
Consumables
50 ml reaction tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
10 ml syringe	Braun	4606108V
Sterican needle (22G)	Braun	4657624
1.7 ml Microtubes	Brunschwig	MCT-175-C
100 μm cell strainer	Falcon	6.05935
sterile forceps	Bastos Viegas, SA	489-001
sterile scalpel	Braun	5518059
Primaria cell cuture dish	Falcon	353803
C-Chip Neubauer Improved	Bioswisstech	505050
cell culture flask - Flask T300	TPP	90301
Equipment
Microbiological biosafety cabinet class II	Skan	82011500
water bath	Memmert	1305.0377
Stripettes Serological Pipette 5ml	Corning	4487-200ea
microscope	Olympus	CKX41
humidified incubator Heracells 240	Thermo scientific	51026331
Heraeus Multifuge 1S-R	Thermo scientific	75004331

```