Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Samenvatting

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch huid of doorlaatbaar gemaakt, skeletspier vezels een krachtig middel om spierfunctie beoordeeld op het niveau van de interne spiercel. In dit artikel schetsen we een valide en betrouwbare techniek bereid en getest doorlaatbaar skeletspier vezels in vitro.

Samenvatting

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch ontdaan, of gepermeabiliseerde, skeletspiervezels biedt een krachtig middel om spierfunctie op het niveau van de enkele spiercel te beoordelen. Onderzoeken van enkele spiervezels zijn nuttig in zowel fundamentele wetenschap als klinische studies. Voor fundamentele studies maken contractiliteitsmetingen van enkele spiervezels onderzoek naar fundamentele mechanismen van krachtproductie mogelijk, en analyse van spierfunctie in de context van genetische manipulaties. Klinisch gezien bieden studies van enkele spiervezels nuttige inzichten in de impact van letsel en ziekte op spierfunctie, en kunnen ze worden gebruikt om het begrip van spierpathologieën te begeleiden. In dit videoartikel zetten we de stappen uiteen die nodig zijn om een individueel segment van een skeletspiervezel voor te bereiden en te isoleren, het te bevestigen aan een krachtmeetapparaat, het te activeren om maximale isometrische kracht te produceren, en de doorsnede ervan te schatten voor het normaliseren van de geproduceerde kracht.

Inleiding

De primaire functie van skeletspier te dwingen te genereren. Spierkracht wordt opgewekt in vivo door middel van een complexe opeenvolging van gebeurtenissen die motorische zenuw actiepotentialen, neuromusculaire transmissie, spiervezels actiepotentialen, vrijkomen van intracellulaire calcium, en activering van het systeem van regelgeving en contractiele eiwitten bevat. Omdat force generation is het eindresultaat van deze sequentie kan een tekort kracht veroorzaakt door het falen van een of meer van de stappen. Een belangrijk kenmerk van de gepermeabiliseerde vezel voorbereiding is dat het elimineert de meeste van de stappen die nodig zijn voor de troepenmacht in vivo, met alleen de regelgeving en contractiele functies in verband met de myofibrillaire apparaat resterende. De onderzoeker neemt controle over de levering van het activeren van calcium en energie (ATP), en wordt beloond met een vereenvoudigd systeem dat de beoordeling van de geïsoleerde regulerende en contractiele structuren mogelijk in hun eigen configuration. Metingen van kracht met behulp van gepermeabiliseerde skeletspieren vezels zijn dus waardevol bij de beoordeling van veranderingen in spierfunctie waargenomen in vivo. Zo hebben we deze techniek gebruikt om de kracht vermogen van vezels karakteriseren van myostatine deficiënte muizen ¹ en de oorzaak van aanhoudende spierzwakte vertoonden na chronische rotator cuff ^2,3 beoordelen.

Modern gepermeabiliseerd fiber methodologie kan worden herleid tot de vroege invloedrijke studies ^4,5 en is momenteel in gebruik door een aantal onderzoeksgroepen. Hoewel de technieken beschreven in de literatuur, maar nog niet voorgesteld als video. Het doel van dit artikel is een bijgewerkte, valide en betrouwbare techniek illustreren voor het meten van de maximale kracht genererende capaciteit van enkele vezels van chemisch gepermeabiliseerde skeletspieren monsters. Om deze, een individuele vezels segment (hierin als aangeduid bereiken ̶0, fiber ') wordt gewonnen uit een pre-gepermeabiliseerde bundel vezels en in een experimentele kamer die een ontspannen oplossing te kenmerken waarvan een calciumconcentratie die <10 nM. De vezel wordt dan aan één einde aan een kracht-transducer en aan het andere uiteinde een lengte-controller bevestigd. Met de vezel gehouden op een optimale sarcomeerlengte, wordt overgebracht naar een activerende oplossing die een calciumconcentratie voldoende is om een ​​maximale activatie en hiermee maximale isometrische contractie kracht opwekken heeft. Force gegevens worden verkregen, opgeslagen en met behulp van een personal computer geanalyseerd.

Protocol

Alle procedures waarbij dierlijke of menselijke proefpersonen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en regelgeving, en regelgevende instanties. De Universiteit van Michigan Comité over het gebruik en onderhoud van de Dieren (UCUCA) en de Universiteit van Michigan Medical Center Institutional Review Board goedgekeurd alle dierlijke en menselijke procedures beschreven in dit artikel.

1. Zorg ontleden en opslag Stock Solution

Opmerking: De laatste volumes die in de volgende instructies kan worden opgeschaald of omlaag als gewenst.

1. In een bekerglas van 1000 ml voeg 800 ml gedeïoniseerd water (ASTM type 1). Handhaving van een zachte roer, voeg alle in tabel 1 opgesomde verbindingen tot het gedeïoniseerde water en laat ze lossen.

   Samenstelling	Gewenste Conc. (M)	Formula Gewicht (g / mol)	Voeg toe aan 1 L (g)
   K-propionaat	0.250	112,17	28,040
   Imidazool	0,040	68.08	2.720
   EGTA	0,010	380,40	3.800
   MgCl 2 • 6H 2 O	0,004	203,31	0,813

Tabel 1: Opheldering en opslag stock oplossing componenten.

2. Breng een eindvolume van 1000 ml met gedeïoniseerd water. Merk op dat het niet noodzakelijk om de oplossing op dit moment pH. Bewaar de stock oplossing bij 4 ° C.

2. Maak Storage Solution

1. Aan 200 ml van opslagoplossing, begin dan met 100 ml ontleden en opslag voorraadoplossing in een bekerglas van 250 ml. Voeg voldoende Na ₂ H ₂ ATP tot de uiteindelijke adenosine brengentrifosfaat (ATP) concentratie 2 mM. Breng aan een uiteindelijk volume van 200 ml met glycerol. Op pH 7,00 met kaliumhydroxide (KOH). Bewaar de opslagoplossing bij -20 ° C.
   Let op: Als gevolg van de visceuze aard van glycerol het moeilijk kan zijn om nauwkeurig afzien door volume. Hierdoor voegen we meestal de glycerol gewichtsdelen (100 ml glycerol weegt ongeveer 126 g).

3. Maak Dissecting Solution

1. Aan 200 ml oplossing te ontleden, te beginnen met 100 ml van het ontleden en opslag voorraadoplossing in een bekerglas van 250 ml.
2. Voeg voldoende Na ₂ H ₂ ATP ATP uiteindelijke concentratie 2 mM te brengen. Pas de pH op 7,00 met KOH. Breng het uiteindelijke volume aan met gedemineraliseerd water 200 ml. Aliquot in volumina van 2,5 ml en bewaar bij -80 ° C.

4. Maak Opheldering Solution met Brij 58

Opmerking: Brij 58 is een niet-ionisch detergent dat (permeabilizes) lipide bilagen verstoort.

1. Aan 200 ml ontleden oplossing Brij 58, begin dan met 200 ml van het ontleden oplossing in een bekerglas van 250 ml. Handhaving van een zachte roer, voeg 1 g Brij 58 (0,5% w / v) aan de oplossing ontleden en laten lossen. Aliquot in volumina van 2,5 ml en bewaar bij -80 ° C.

5. Zorg Testing Solutions

Opmerking: De volgende is een bewerking van Moisescu en Thieleczek 1978 (6). Zie Discussie voor aanvullende opmerkingen op de voorbereiding van het testen van oplossingen.

1. Bereid drie afzonderlijke 1000 ml bekers label "Relaxing", "Pre-activerende" en "activeren". Voeg 400 ml gedeïoniseerd water toe bekerglas.
2. Voeg de verbindingen weergegeven in tabel 2 om de juiste bekerglas en vervolgens verhit de oplossing tot tussen 70 ° C en 80 ° C. Handhaaf een oplossingstemperatuur van 70-80 ° C gedurende 30 minuten onder voortdurend roeren.
   Opmerking: Een temperatuur van 70-80 ° C helpt bij de Eliminatie koolzuur gevormd door de reactie van calciumcarbonaat met EGTA in de activerende oplossing. De ontspannende oplossing en pre-activerende oplossingen worden behandeld op dezelfde wijze als de activerende oplossing van consistentie.

		ONTSPANNEN OPLOSSING		PRE-ACTIVEREN OPLOSSING		ACTIVEREN OPLOSSING
Samenstelling	Formula Gewicht (g / mol)	Gewenste concentratie (mM)	Verplichte Massa (g)	Gewenste concentratie (mM)	Verplichte Massa (g)	Gewenste concentratie (mM)	Verplichte Massa (g)
HEPES (acid)	238,30	90.0	10,724	90.0	10,724	90.00	10,724
MgO	40.31	10.3	0,208	8.5	0,171	8.12	0,164
EGTA (acid)	380,40	52.0	9,890			52.00	9,890
HDTA (acid)	348,36			50.0	8,709
CaCO 3	100.10					50.00	2.503

Tabel 2: Relaxing, pre-activerende en activerende oplossing componenten.

3. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en voeg voldoende NaN ₃ / KOH tot de uiteindelijke NaN ₃ concentratie 1 mM te brengen.
   LET OP: _NaN3 (natriumazide) is giftig. Raadpleeg de chemische MSDS voorafgaand aan de behandeling van deze chemische stof.
   1. Aan 100 ml van 100 mM natrium- azide oplossing, voeg 0,65 g _NaN3 aan 10 ml 1 N KOH. Stel een eindvolume van met gedeïoniseerd water 100 ml.
4. Stel de pH tot ongeveer 7.10 met KOH.
5. Volgende stap 5.4 vul dan voldoende Na ₂ H ₂ ATP om de laatste ATP concentratie tot 8 mm en voldoende Na ₂ CrP brengen naar de uiteindelijke creatine phosophate (CRP) concentratie tot 10 mm te brengen.
6. Breng elke oplossing op het eindvolume van 500 ml gedeïoniseerd water gebruikt. Chill of verhitten oplossingen voor de temperatuur waarbij experimenten zullen worden uitgevoerd, vervolgens KOH brengende pH op 7,10 onder handhaving van deze temperatuur.
7. Toevoegen ontspannen oplossing van het bekerglas met pre-activerende oplossing zodat de uiteindelijke pre-activerende oplossing 1 deel ontspannen oplossing 500 pre-activerende oplossing. Aliquot in volumina van 2,5 ml en bewaar bij -80 ° C.

6. Zorg Suture Loops

1. Begin met een bundel van niet-steriele USP 10-0 monofilament nylon hechtdraad.
2. Gebruik de tang om een ​​lus met de streng met behulp van de dubbele halve knoop techniek te creëren. Verminder de knoop in grootte van ongeveer 750 micrometer diameter. Loop diameter kunnen worden beoordeeld onder de microscoop met oculairgraticule markeringen.
3. Gebruik microdissecting schaar om het overtollige hechtdraad waardoor alleen de lus en kleine (500 pm) staarten aan beide zijden verwijderen. Een voorbeeld van een voltooide lus is weergegeven in figuur 1.
4. Herhaal stap 6,2-6,3 tot 4 bruikbare loops zijn gemaakt. Store lussen in een silicone-elastomeer vergulde petri schotel voor toekomstig gebruik.
   Opmerking: vier hechtingen lussen vereist voor iedere vezel getest.

7. Bundle Sample

Opmerking: De volgende stappen beschrijven de procedure voor het ontleden van het oorspronkelijke monster in kleinere experimenteel 'bundels' van waaruit enkele vezels uiteindelijk zal worden gewonnen en getest. Te allen tijde het monster moet met zorg worden behandeld. Ten behoeve van deze beschrijving worden er aanwijzingen gegeven alsof de onderzoeker rechtshandig.

1. Het verkrijgen van het monster van belang en overbrengen naar de faciliteit waar de dissectie zal plaatsvinden.
   Opmerking: Methoden van het weefsel biopsie zal variëren afhankelijk van experimenteel model en studie design. Waar mogelijk moet de spieren perfusie worden gehandhaafd tot het moment van de biopsie.
2. Als het monster over te brengen tussen de oogstgebied en ontleden site te transporteren in een injectieflacon die ontleden gekoelde oplossing toegevoegd terwijl op ijs.
3. Bereid een 5 cm siliconenelastomeer uitgeplaat petrischaal met gekoelde oplossing ontleden en 02:58 insecten bevestigingspennen (100 urn diameter, roestvrij staal).
4. Breng het monster aan het gerecht. Zorg ervoor dat het monster blijft overspoeld door het toevoegen van meer ontleden oplossing indien nodig.
5. Inspecteer het monster onder de microscoop en manipuleren van de longitudinale assen van de vezels uitgelijnd naar de rechterschouder van de onderzoeker (figuur 2). Anker vervolgens het monster op de schaal van pinning op de hoeken.
   Opmerking: Maak gebruik van de resterende bindweefsel als ankerpunten in deze tijd, omdat deze steekproef gebruik te maximaliseren en de instandhouding van de integriteit van vezels. De bundel kan worden vastgemaakt in lichte spanning helpt bij het definiëren tussen de vezels marges.
6. Met de tang in de linkerhand en de microdissecting schaar in de juiste, beginnen voorzichtig ontleden een bundel langs de longitudinale marges tussen de vezels
   Opmerking: Afhankelijk van detotale lengte, verder ontleden de bundel in talrijke kleinere bundels.
7. Zorg ervoor dat de bundel afmetingen zijn ongeveer 0,5-1 mm in de breedte en ≥3 mm in lengte. Beoordeel de afmetingen met behulp van een microscoop met graticule markeringen in het oculair, of door het plaatsen van een heerser onder de schotel.
8. Verwijder elk weefsel dat beschadigd door de forceps of pennen ten gevolge van het ontleden proces annuleren.
9. Herhaal dit proces tot een voldoende aantal bundels zijn ontleed of totdat het monster is uitgeput.
   Opmerking: Het aantal bundels die worden verkregen hangen af ​​van verschillende factoren waaronder de grootte en de conditie van het oorspronkelijke monster, de morfologie van de spier en de vaardigheid van de onderzoeker.

8. permeabilize Vezels

1. Breng de bundels van het ontleden oplossing in een flacon met 2,5 ml vers, gekoeld, ontleden oplossing met het niet-ionische detergens "Brij 58 'toegevoegd(0,5%, w / v). Incubeer op ijs gedurende 30 minuten met af en toe, zacht schudden. Zorg ervoor dat de bundels blijven ondergedompeld gedurende incubatie.
2. Na afloop van de 30 min incubatie, breng de bundels een flesje met vers ontleden oplossing (zonder Brij 58) en schud voorzichtig en kort resterende reinigingsmiddel te verwijderen.

9. Bereid Bundels voor opslag

1. Breng de bundels een flesje dat gekoelde opslagcapaciteit en incubeer overnacht bij 4 ° C.

10. Store Bundels

1. De volgende dag stelt een opbergdoos kan weerstaan ​​-80 ° C, met voldoende afzonderlijke 0,5 ml schroefdop conisch alle bundels verkregen tijdens de dissectie proces (één bundel per buisje) huisvesten. Elke conische buis moet worden gevuld met 200-400 ul van verse storage-oplossing.
2. Breng de bundels in de individueel gelabelde conische buizen. Zorg ervoor dat de bundel niet vast aande kant van het conische buis of drijven op het oppervlak van de oplossing. Cap de conische buizen en bewaar de monsters bij -80 ° C tot de testdag.

11. Bereid Experimental Apparatus

Opmerking: De aangepaste inrichting bestaat uit een fase die een lengte controller en krachtopnemer, een bewegend kamersysteem en een 10X dissectie microscoop herbergt. Micrometer schijf installaties zorgen voor een nauwkeurige manipulatie van vezels bevestiging oppervlakken. Laser diffractiepatronen worden gebruikt voor het schatten sarcomeerlengte. Data binnen experimenteren opgenomen op een personal computer. Zie Figuur 3 voor geannoteerde beelden van de experimentele set-up.

1. Dooi een flacon elk van de ontspannende, pre-activerende en het activeren van oplossingen en op ijs te behouden. Merk op dat ATP en CRP labiele verbindingen die bij lage temperaturen te handhaven.
2. Bereid de microscoop, testapparatuur en bijbehorende computer voor gebruik.
3. Vul het eerste experimentele kamer met ontspannende oplossing. In onze apparaten, de eerste kamer bevat prisma waarmee de onderzoeker de vezel vanaf de zijkant te fotograferen. Vul het tweede experimentele kamer met pre-activerende oplossing en de derde met activerende oplossing.
4. Regel de temperatuur, zodat de in-kamer thermometer display verschijnt 15 ° C. Draad twee voorbereide hechtdraad lussen op de roestvrijstalen bevestiging oppervlakken uitstrekt van zowel de kracht-transducer en de lengte-controller (Figuur 5A).

12. Extract gepermeabiliseerd Single Fiber

1. Ontdooi een vezel bundel van belang, en over te dragen aan een siliconenelastomeer-plated petrischaal met verse, gekoelde ontspannen oplossing. Zet de bundel met spelden aan beide uiteinden en ervoor te zorgen dat het wordt ondergedompeld.
2. Met behulp van de tang, pakt een vezel aan één einde en begin soepel extraheren langs zijn lengteas.
   Opmerking: Druksterkte schade aan deuiteinde van de vezel veroorzaakt door de tang geen probleem is momenteel, omdat de contractiele eigenschappen van dit gebied zullen worden beproefd. Er moet echter worden bij het extraheren vezels van de bundel daar adhesie tussen vezels en de extracellulaire matrix kan resulteren in overmatige spanning, wat uiteindelijk leidt tot stretch-geïnduceerde schade. Merk op dat een aanzienlijke variabiliteit bestaat tussen spieren in de mate waarin de vezels zich aan de omliggende extracellulaire matrix. Vezels die worden verdacht te zijn beschadigd door een dergelijk traject moet worden weggegooid.
3. Gebruik een scheermesje of scalpel een pipet tip te wijzigen zoals in (figuur 4). Introduceren van de vezel in het uiteinde samen met een kleine hoeveelheid oplossing ontspannen. Breng de enkele vezel van de siliconen elastomeer-plated petrischaal aan de experimentele kamer die de ontspannen oplossing bevat.

13. Mount Single Fiber

Opmerking: Een stap-voor-stap depiction kan worden gezien in figuur 5.

1. Het begeleiden zachtjes met de tang, verwijder de vezel van de pipet tip en te verankeren aan de lengte-controller (links) met de eerste hechting lus.
   1. Gebruik een enkele, vloeiende beweging bij het aanspannen van de lus met de tang. Controleer of er een gelijke en tegengestelde spanning wordt aangebracht op elk uiteinde van de hechtdraad.
   2. De eerste lus te koppelen ongeveer 1 mm tot 2 mm vanaf het einde van de lengte-controller bevestigingsvlak.
2. Manipuleren het andere uiteinde van de vezel tegen de kracht-transducer (rechts) en zet de vezel volgens dezelfde procedure. Verwijder overtollige hechtdraad met behulp van de microdissecting schaar (figuur 5C).
3. Plaats de vezel onder een kleine hoeveelheid spanning door de afstand tussen de lengte-controller geforceerd transducer armen met behulp van x-coördinaat micrometer aandrijving (Figuur 3A).
4. Rijg de tweede lus over de eerste en verankeren de vezelzich ten hoogste 0,2 mm van het uiteinde van de kracht-transducer bevestigingsvlak (Figuur 5D).
   1. Verwijder overtollige hechtdraad met behulp van de microdissecting schaar.
5. De vezel hechtingsproces kunnen leiden tot verlies van de oplossing uit de kamer. Voeg eventueel meer ontspannen oplossing van het oppervlak van de oplossing te waarborgen vlak (niet concaaf of convex). Een vlakke ondergrond is van belang bij de beoordeling van sarcomeer lengte met behulp van laser diffractie.
6. Lijn de vezels parallel aan de zijwanden van de experimentele kamer door de positie van de lengte-controller in de richting van de y-as.
7. Onderzoeken de vezel via het prisma zijaanzicht en pas de positie van de lengte-controller in de richting van de z-as naar de vezel parallel aan de vloer van de kamer.
   Opmerking: Plaatsing van de vezels parallel aan de vloer van de kamer worden uitgevoerd zonder kamer prisma door zich eerst aan één uiteinde van de vezel en tkip, zonder aanpassing van de microscoop focus, waardoor het andere uiteinde van de vezel in focus met de z-as micrometer drive.
8. Indien de vezel op enigerlei wijze verwrongen, verdraaid of beschadigd ten gevolge van het montageproces, moeten de vezel verwijderd en een nieuwe vezel gehecht.

14. Set Optimale sarcomeer Lengte

1. Wanneer de vezel is correct in de kamer uitgelijnd, plaatst u de geijkte doelgroep scherm op de voorste aspect van de microscoop en leg het over de eerste experimentele kamer.
   Opmerking: Het doelstation wordt gekalibreerd met standaard raster vergelijking λ = SL sinθ, waarbij SL is sarcomeerlengte, θ is de afbuighoek tussen de 0 ° en 1 ° gebogen bundels en λ de golflengte van de laser.
2. Zet de laser en stel de positie van de trap zo kiest dat de laser door het middelpunt van de vezel.
   LET OP: Geconcentreerde laserlicht kan beschadigen to gezichtsvermogen. Probeer nooit om de vezel te visualiseren door de microscoop wanneer de laser is ingeschakeld.
3. Plaats de vezel met betrekking tot de laserstraal op het laserlicht te buigen en te observeren een inmenging babbel op het geijkte doelgroep scherm (figuur 6). Schakel de lichten om dit patroon duidelijker zichtbaar.
   Opmerking: Als het juist positioneren van de laserbundel, wordt geen interferentiepatroon waargenomen, suggereert dit dat het myofibrillar componenten van de vezel abnormale / beschadigde dat de vezel te vervangen door een nieuwe.
4. Om het sarcomeer lengte verhoging stellen of de spanning op de vezel met de lengte-controller x-as micrometer schijf totdat de gewenste afstand van het afgebogen licht wordt waargenomen op het doelscherm verlagen.
   Opmerking: De optimale sarcomeer lengte van de vezel zal afhankelijk zijn van de diersoort waarvan het monster werd verkregen. Een sarcomeer lengte van 2,7 urn wordt algemeen aangenomen optimaal wanneer ezelszingen vezels van menselijk weefsel ^7,8.
5. Na optimale sarcomeerlengte is ingesteld, meet de afstand tussen de twee binnenste hechtingen. Dit wordt het gemakkelijkst bewerkstelligd met behulp van de digitale uitlezing op de micrometer station met de x-as beweging van de kamer regelt. Plaats de kamer zodanig dat de verticale kruis haar van het oculair is afgestemd op de binnenste rand van de binnenste hechtdraad en nul de digitale uitlezing op de micrometer rijden.
6. Vertaalt de fase langs de x-as ten opzichte van de microscoop tot aan de andere binnenste hechting. De digitale display zal de lengte van de vezel aan te geven. Deze waarde moet worden geregistreerd als vezellengte, L _f.
   Opmerking: Het zal duidelijk zijn dat de afstand tussen de twee binnenste hechtingen bepaalt de functionele lengte van de contractiele weefsel dat wordt onderzocht. De onderzoeker moet streven naar consistentie in deze dimensie (dwz L _f) binnen eenreeks experimenten.

15. Estimate dwarsdoorsnede (CSA)

1. Handhaaf de vezel bij _Lf en gebruik de microscoop gemonteerde camera een hoge vergroting beeld van het centrale deel van de vezel te vangen vanaf de boven- en zijaanzichten. Zijaanzicht beelden kunnen worden vastgelegd met het prisma ingebed in de zijde van de kamer.
   Opmerking: Wanneer ineens tussen boven- en zijaanzichten het is belangrijk om de microscoop alleen verplaatsen in de y-richting zodat de beide beelden zijn "in register" en daarom tonen twee verschillende weergaven van dezelfde sectie van de vezel.
2. Verkrijgen metingen op dit moment om absolute kracht later normaliseren in de studie. De technieken voor het verkrijgen van deze metingen worden later beschreven en geïllustreerd in figuren 7A en 7B.

16. Elicit isometrische contractie

Opmerking: Terwijl de gegevens die tijdens deze experiments kunnen worden verzameld en geïnterpreteerd zonder gebruik van een computer, software waarmee de verwerving, weergave, opslag en analyse van de kracht responsen gunstig. De aangepaste LabVIEW software door ons laboratorium kunnen deze functies en de mogelijkheid om "treinen beweging" dat de werking van de lengte-controller regelen tijdens een proefopzet.

1. Controleer of de temperatuur van het ontspannen, pre-activering en activerende oplossingen zijn stabiel bij 15 ° C.
2. Met de kamer besturingssoftware om de vezel naar de kamer die de pre-activerende oplossing en incubeer gedurende 3 min daar.
   Opmerking: Het pre-activerende oplossing zwak gebufferd Ca2 ^+, resulterend in een zeer snelle activering en krachtontwikkeling bij inbrengen van de vezel de activerende oplossing.
3. Met 10 sec nog in de pre-activerende oplossing en de vezellengte gehandhaafd op _Lf heeft, een zero foRCE niveau in de experimentele record.
   Opmerking: De 'laten Force Zero beweging van de lengte-controller onthult de kracht-transducer niveau dat overeenkomt met nul kracht (dat wil zeggen de vezel wordt kort slap ten gevolge van de beweging). Passieve kracht het verschil tussen die nul en krachtniveau vlak voor de transducer nulstelling beweging.
4. Aan het einde van de 3 min, bewegen de vezels aan de kamer die de activerende oplossing en laat maximale isometrische kracht te ontwikkelen zoals blijkt uit een plateau in kracht die wordt voorafgegaan door een snelle stijging.
5. Na het bereiken van de maximale isometrische kracht, gebruiken de lengte-controller om de kracht-transducer uitgang die overeenkomt met nul kracht in de kamer met de activerende oplossing te identificeren.
   Opmerking: Dit is noodzakelijk omdat de kracht-transducer uitgang die correspondeert met nul kracht, in het algemeen verschillend voor elke oplossing gevulde kamer.
6. Na het bereiken van een tweede kracht plateau, terug de vezel naar de kamer met de ontspannen oplossing. Testen is nu voltooid. Om meerdere vezels te testen tijdens één sessie aspireren alle oplossingen en voeg nieuwe, gekoeld oplossingen.
   Opmerking: Brenner cycling protocollen te worden overwogen bij het opwekken maximale contracties gedurende een langere tijdsperiode. Is aangetoond dat dit protocol om structurele en mechanische eigenschappen te behouden in de maximaal geactiveerde vezels ^9.

Resultaten

Gezond, chemisch gepermeabiliseerd enkele vezels moet uniform verschijnen in vorm en hebben consistente strepen tussenruimte wanneer bekeken onder hoge vergroting. Vezels die niet flexibel zijn wanneer gemanipuleerd met de tang of hebben duidelijke structurele schade moet worden weggegooid.

Sterke vergroting digitale beelden die in stap 15 geanalyseerd op 5 gepaarde metingen diameter over de buik van de vezel. Fiber CSA wordt geschat uitgaande van een elliptische dwarsdoorsnede en gemiddeld 5 afzonderlijke CSA metingen zoals in figuur 7A. Figuur 7B dient ook om te illustreren hoe vezels afmetingen in één oog significant verschillend kunnen zijn in vergelijking met gekoppelde afmetingen in de andere weergave (bijvoorbeeld, cross secties zijn in het algemeen niet, ronde).

Representatieve force sporen van menselijk langzame en snelle vezels worden getoond in Figuren 8A en 8B respectievelijk. Voltage uitgang van de kracht- transducer wordt verkregen tijdens een test en omgezet kracht (mN) via data acquisitie en analyse software (LabVIEW). Figuur 9 illustreert de aanpak om maximale actieve kracht _(Fo) bepalen, die wordt berekend door de kracht die nodig is om de vezel op optimale sarcomeer lengte te handhaven, terwijl in een ontspannen toestand (passieve kracht, F _P), van de grootste isometrische kracht ontwikkeld tijdens maximale fiber activering (totale kracht, F _T). Aangezien de uitgang van de kracht-transducer die overeenkomt met nul kracht, in het algemeen verschillend voor elk van de verschillende baden kamers we kort draai de vezel zowel in de pre-activering en activerende oplossingen voor de nul-krachtniveau in het vangen experimentele record. Normalisatie van maximale werkelijke kracht door CSA vezel wordt gebruikt om de meer informatieve waarde van de specifieke werking (SF _o) te genereren. Omdat het rekening houdt met de CSA van de vezel, sF _o een maat voor de kracht intrinsieke vermogen van de vezel contractiele apparaat, waardoor functionele vergelijkingen tussen vezels van uiteenlopende afmetingen. Er zij evenwel op gewezen dat SMK metingen niet in staat de verhouding van de vezel bezet door contractiele filamenten versus het aandeel ingenomen door andere subcellulaire structuren onderscheiden.

Typische kenmerken van gezonde volwassen vezels uit Claflin et al. 2011 ¹⁰ menselijke, Mendias et al. 2011 ¹ voor muizen en Gumucio et al. 2012 ² van rat worden aangegeven in tabel 3. Alle gegevens in Tabel 3 werden gegenereerd door het gebruik technieken beschreven in dit artikel.

	Menselijk (Vastus lateralis)				Muis (EDL)	Rat (Infraspinatus)
	Mannelijk		Vrouwelijk		Mannelijk	Mannelijk
	Type 1	Type 2a	Type 1	Type 2a	(Niet getypt)	(Niet getypt)
CSA (2 pm)	4880 - 6900	5270 - 8380	3870 - 5470	4010 - 5610	1850 - 3080	5290 - 8010
F o (MN)	0,79-1,17	1,02-1,54	0,64-0,97	0,71-1,07	0,14-0,25	0,55-0,97
sF o (kPa)	142-182	165-210	156-193	172-214	67-94	102-131
n	129	160	149	207	37	94

Tabel 3. Typische kenmerken van een gezonde, volwassen vezels uit menselijke vastus lateralis ^10, muis extensor digitorum longus ¹ en rat infraspinatus ² spieren. Optimal sarcomeer lengtes werden vastgesteld op 2,7 micrometer voor menselijke vezels ^7,8 en 2,5 micrometer voor zowel de muis (36, 37) en rat vezels (38). Experimentele L _f reeksen (25 ^ste en 75 ^ste kwartielen) waren 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm en 1,32-1,59 mm voor respectievelijk mens, muis en rat. Ranges getoond wijzen op de 25 de ^en 75 ^ste kwartiel en n is het aantal geteste vezels.

De meest voorkomende problemen tijdens de test omvatten een hechtdraadlus slip, waardoor een kracht response een "vangen", zoals afgebeeld in figuur 10A, en een gedeeltelijke of volledige dikte scheuren van de vezels, hetgeen resulteert in een kracht die terugkeert reactie abrupt naar of om (break) nul, terwijl de vezel wordt gedompeld in nog activerende oplossing (Figuur 10B). Als er tijdens een experiment een slip, scheur of breuk optreedt, moet de vezel worden weggegooid en uitgesloten van de gegevens, hoewel het handhaven van een record van vezels mislukkingen kunnen ook informatieve ¹¹ zijn. Een andere negatieve uitkomst kunnen doorstaan ​​is de voortijdige activering van de vezel terwijl de pre-activerende oplossing (figuur 10C). Gedeeltelijke activering in de pre-activerende oplossing suggereert significante kruis-well contaminatie (dwz een onbedoelde toename van de calciumconcentratie in het pre-activerende well). In dit geval moeten alle baden worden opgezogen en goed gespoeld met gedemineraliseerd water. Het drogen van de delen oppervlakken tussen de kamers is ook recommended vocht of condens in deze gebieden kan leiden tot opzuigen van de oplossing tussen de baden. De beslissing te nemen of uit te sluiten data zal uiteindelijk afhangen van de experimentele focus en moet dus rekening worden gehouden bij het ontwerpen van de studie.

Figuur 1: Hechting lus (10-0 monofilament nylon hechtdraad).

Figuur 2:. Bundle dissectie Forceps zijn in de linkerhand, microdissectie schaar zijn rechterhand. Rode lijn geeft de gunstige richting van de pols en schaar met de lengteassen van de vezels.

Figuur 3: (A) Testing apparaat met gelabelde onderdelen. (A) Experimentele kamers met transparante bodems. (B) Lengte-controller. (C) Force-transducer. (D) Lichtbron. (E) Lengte-controller xyz micrometer rijden met digitaal display. (F) Stage micrometer rijden met digitaal display. (G) Force-transducer xyz micrometer rijden. (H) Platform voor gekalibreerde laser-diffractie doelwit scherm. (I) Trillingsisolatie tafel. (B) Close-up van de experimentele kamers. (J) RVS bevestiging oppervlak dat zich uitstrekt van de lengte-controller. (K) Edelstaal bevestigingsoppervlak uitstrekt vanaf de kracht-transducer. (L) Side-view prisma. (M) Behuizing voor thermo-elektrische koeling modules. (N) thermokoppel voor het melden van kamer temperature.

Figuur 4: Gewijzigde 100 ul pipet tip gebruikt om vezels uit dissectie gerecht over te dragen aan de experimentele kamer.

Figuur 5:. Montage enkele vezel op experimentele apparaten (A) Prepared hechtdraad lussen geregen op roestvrij stalen bevestiging oppervlakken. (B) Fiber overgebracht naar experimentele kamer. (C) Fiber verankerd roestvaststalen bevestigingsvlakken door eerste paar hechtdraad lussen met overmaat hechtingen verwijderd. (D) Tweede paar lussen hechtdraad geregen over de bovenkant van eerste hechting loops en bond plaats.

Figuur 6: sarcomeer lengte wordt bepaald door de projectie van een laser interferentiepatroon op een geijkte doelwit scherm (a) Laser bron.. (B) Spiegel. (C) Target scherm. (D) Laser interferentiepatroon.

Figuur 7: (A) Bepaling van de vezel dwarsdoorsnede met optimale sarcomeerlengte (humaan = 2,7 pm). Uitgaande van een elliptische doorsnede, CSA wordt berekend voor elke vijf plaatsen langs de vezel middensectie en het gemiddelde van de vijf individuele metingen wordt gerapporteerd als vezel CSA. 2a vertegenwoordigt bovenaanzicht diameter en is een as van de ellips, 2b zijaanzicht diameter en de andere as van de ellips. (B) Representatieve vezel beelden illustreren elk van de vijf genoemde metingen diameter die in de boven- en zijaanzicht.

Figuur 8: Vertegenwoordiger van kracht sporen uit gezonde menselijke vastus lateralis spiervezels (A) Type 1 vezel (CSA: 5710 um ^2, F _o: 0,89 mN en SF _o: 156 kPa).. (B) Type 2a vezel (CSA: 9510 um ^2, F _o: 1,66 mN en SF _o: 174 kPa). Fiber myosine zware keten soort werd bepaald door middel van elektroforetische scheiding en zilver-kleuring technieken ^22.

OAD / 52.695 / 52695fig9.jpg "/>
Figuur 9: Berekening van maximale actieve kracht (F _o) (a) uitgebreide weergave van vezels kracht respons tijdens slappe-inducerende beweging van lengte-controller gestart in pre-activerende oplossing.. F _P is de vereiste kracht sarcomeer lengte van 2,7 urn met de vezel in rust houden. (B) uitgebreide weergave van de lengte-controller-slap inducerende beweging. Merk op dat F _o = F _T - F _P.

Figuur 10: (A) hechtdraadlus slip, blijkt uit een "vangen" van kracht trace tijdens de opkomst van geweld. Controleer of loops veilig zijn voor het activeren van de vezel. (B) Fiber pauze tijdens activering. Kan als gevolg van slechte fiber integriteit of agressieve vezels behandeling tijdens hechtdraadlus plaatsment. (C) Premature partiële vezels geactiveerd door een besmetting van pre-activeringskamer met Ca2 ^+.

Discussie

Evaluaties van de contractiele eigenschappen van gepermeabiliseerde enkele skeletspier vezels worden gebruikt om spierfunctie onderzoeken een zeer verschillende omstandigheden. Voorbeelden zijn studies die de gevolgen van de vergrijzing ¹² geëvalueerd, oefenen ^10,13,14, ruimtevaart ^15, letsel ^2,3,16, medicamenteuze behandelingen ^17,18, de ziekte van ¹⁹ en genetische manipulatie ^20,21 op glasvezel structuur en functie. Door de mogelijkheid om de contractiliteit van myofibrillen rechtstreeks beoordelen hun eigen configuratie, verschaft deze techniek een aantrekkelijk platform om een ​​begrip van myofibrillaire functie afwezigheid van potentieel verstorende effecten die aanwezig zijn vormen wanneer neuromusculaire signaaloverdracht en excitatie-geïnduceerde calciumafgifte zijn in het bestudeerde systeem. Bovendien kunnen functionele testen van afzonderlijke vezels worden gebruikt om contractiele eiwitten identificatie results zoals aanvullingverkregen door middel van immunohistochemie of gelelectroforese + western blot ^22.

Een van de belangrijkste functies van skeletspier te dwingen te genereren. Bijgevolg sF _o, een maat voor de intrinsieke kracht genererende capaciteit van een contractiele systeem, is van groot belang voor de spieren fysiologen. Betrouwbare schattingen van sF _o vereisen nauwkeurige metingen van zowel vezels CSA en F _o. Sinds vezels zijn, in het algemeen, noch cirkelvormig in doorsnede, noch uniform in CSA langs hun lengte, grote zorg moeten worden genomen bij de schatting van CSA. Hiertoe zijn metingen op verschillende plaatsen over de lengte van de vezel en op elke locatie, vanuit twee perspectieven gescheiden door 90 °. Betrouwbare maatregelen van F _o vereisen aandacht voor verschillende gegevens, waaronder boekhouding voor passieve kracht, het aanpassen van sarcomeer lengte overlap van dikke en dunne filamenten te maximaliseren, het gebruik van een activerende oplossing met een calciumconcentratie that resulteert in maximale activering, het handhaven van de gewenste experimentele temperatuur, altijd optimaal opslagomstandigheden (temperatuur en duur) van de vezels voorafgaande aan de dag van het experiment.

Terwijl de hier geschetste stappen beschreven procedure voor het evalueren maximale isometrische kracht, is het vaak wenselijk om andere belangrijke functionele eigenschappen van de skeletspier vezels evalueren. Dit kan worden bereikt door uitbreiding van het experimentele protocol om extra mechanische manipulaties van de vezel omvatten. Bijvoorbeeld, het meten van de snelheid waarmee de vezel verkort tegen een reeks van verschillende ladingen basis hiervan kunnen de kracht-lengte relatie, waaruit kracht-snelheid-vermogen en vermogen relaties kunnen worden berekend ^10,23,24. Bovendien kan de snelheid van verkorting onbelaste worden vastgesteld met behulp van de "slack test" ^25, die bestaan ​​uit het aanbrengen van een reeks van speling inducerende verkorting stappen en measuring van de tijd die de fiber to the strak te trekken. Een andere kinetische parameter die vaak wordt gemeld is k _tr, de snelheidsconstante voor kracht herontwikkeling na een mechanische storing die tijdelijk alles los crossbridges ^26. Ten slotte is de relatie tussen calciumconcentratie en werkzame kracht genereren (de "force-pCa verhouding") vaak plaats ¹⁸ en kan worden bepaald door het blootstellen van de vezel een aantal oplossingen met calcium concentraties van beneden de drempel voor de contractiele systeem die voldoende is om een maximale activatie en bijgevolg maximumkracht _(Fo) wekken.

Hoewel veel van de genoemde apparatuur nodig voor het beoordelen enkele vezel contractiliteit, andere uitrusting is niet absoluut noodzakelijk. De lengte-controller, bijvoorbeeld, is onmisbaar voor de experimentele protocol dat snelle en exacte verlenging of verkorting van de vezels vereist,maar is niet absoluut noodzakelijk voor het evalueren maximale isometrische kracht (hoewel een zero-krachtniveau van de kracht stilstaande worden geïdentificeerd met een middel). De prisma's de waarneming van de vezels van opzij toe, hoewel nuttig voor de beoordeling doorsnede, niet absoluut noodzakelijk zijn bij het positioneren van de vezel in de experimentele kamer. Verder alternatief middel voor het belichten van de vezel over de verschillende experimentele oplossingen kunnen worden gebruikt, waaronder ontwerpen een handbediende stelsel van kamers of een enkele kamer die het mogelijk maakt om snel vullen en legen van oplossingen. Tenslotte, terwijl de sub-fysiologische experimentele temperaturen zoals 15 ° C gewoonlijk gebruikt om de reproduceerbaarheid van de mechanische metingen ^{1,2,3,5,8,12,17,27} verbeteren, is het mogelijk om geldige gegevens bij andere temperaturen ²³ genereren ^{, 28} zolang de effecten van temperatuur op oplossingseigenschappen (calciumconcentratie, pH, etc.) worden in aanmerking genomen.

De samenstellingen van de testoplossingen tot de meest kritische aspecten van de gepermeabiliseerde glasvezeltechnieken beschreven. Overwegingen met betrekking tot oplossing samenstelling zijn complex en buiten het bestek van dit artikel. De in stap 5 van het gedeelte protocol beschreven oplossingen zijn ontwikkeld met de nadruk op snelle activering van de gepermeabiliseerde vezel bij de overdracht van pre-activerende activerende oplossingen terwijl een constante ionsterkte, kationische samenstelling en osmolariteit ^6,29. Andere benaderingen om de oplossing samenstelling zijn gebruikt met opmerkelijk succes door andere onderzoeksgroepen en maken doorgaans gebruik van gepubliceerde bindingsconstanten en computationele gereedschappen ^27,30,31. De concentratie van calciumionen in de verschillende activerende oplossing is bijzonder belangrijk in studies met submaximale activatie zoals geforceerd pCa evaluaties. Voor experimenten waarbij vezels volledig zijn geactiveerd, zoals beschrevend hier, de calciumconcentratie in de activerende oplossing meestal overschrijdt door een comfortabele marge die nodig zijn om maximale kracht te bereiken, waardoor de precieze kennis minder kritisch. Toevoeging van creatinefosfaat is belangrijk voor het bufferen van de intramyofibrillar ATP en ADP schommelingen die anders zouden worden gekoppeld contractiele activiteit. Creatine kinase is vereist om de overdracht van fosfaat creatinefosfaat ADP tot katalyseren. Onder experimentele omstandigheden die leiden tot hoge turnover ATP, waaronder het werken bij hoge temperaturen of meten high-speed verkorting in snelle vezels ³² moeten creatine kinase worden toegevoegd aan de oplossing van het endogene creatine kinase die gebonden aan de vezel blijft vullen. Voor minder veeleisende experimentele omstandigheden, de ATP regeneratiesysteem minder kritisch ^27.

Beperkingen van de gepermeabiliseerde enkele vezel techniek zijn de volgende. De door deze testen data hier decontractiele eigenschappen van de specifieke myofibrillar gedeelte dat is bevestigd aan de experimentele apparatuur. Bijgevolg is dit slechts een relatief klein deel van de gehele veelkernige vezel waaruit het segment werd verkregen die op zijn beurt slechts een klein deel van het totale aantal vezels in de spier. Onderzoekers moeten dus zorgvuldig overwegen de vereiste bemonstering om conclusies getrokken uit de experimenten te ondersteunen. Bovendien, het evalueren van de impact van een oefening training tussenkomst fiber functie veronderstelt dat de geëvalueerde vezels inderdaad werden geworven tijdens de training. Hoewel het protocol probeert de natuurlijke intracellulaire milieu van de vezels na te bootsen, het sarcolemma permeabilisatie werkwijze non-specifiek en noodzakelijk maakt oplosbare intracellulaire bestanddelen vrij diffunderen in de badende oplossing. Een ander gevolg van het membraan permeabiliteit is een verandering in de osmotische balans blijkt uit een zwelling vezelvolume ^33. Defiber zwelling vergroot de afstand tussen actine en myosine filamenten resulteert in verminderde calcium gevoeligheid van het systeem myofilament ^34,35, maar kan door de invoering van grote, osmotisch actieve verbindingen ^34. Een laatste beperking te onderzoeken is het gevolg van de gebruikte techniek om vezels hechten aan de experimentele apparatuur. Dit vereist steevast verstoring van de ruimtelijke relatie binnen het filament systeem en in de buurt van de bevestigingspunten, met het bijwonen van functionele tekorten. Specifiek worden de gebieden van de vezel op en nabij de bevestigingspunten functioneel aangetast en daardoor bijdragen kunstmatig series elasticiteit van het meetsysteem.

Samengevat, hebben we een middel om de kracht genererende capaciteit van chemisch permeabel skeletspier vezels in vitro evalueren beschreven. Hoewel de focus van dit artikel is op de beoordeling van de maximale isometrische kracht generating capaciteit van humane skeletspier vezels, kan de experimentele benadering worden aangepast en uitgebreid tot verschillende kinetische parameters en relaties vaststellen tussen verschillende species, zoogdier- of anderszins.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polystyreen kweekbuisje met dop	Fisher Scientific	14-956-3D
0,5 ml microcentrifuge met schroefdop	Fisher Scientific	02-681-334
0,5 ml microcentrifuge doppen met o-ring	Fisher Scientific	02-681-358
Cryobox voor microcentrifuge	Fisher Scientific	5055-5005
pH-meter	Mettler-Toledo	FE20
Petrischaal	Fisher Scientific	08-757-11YZ
Niet-steriele hechtdraad 10-0 monofilament	Ashaway Line Twine	S30002
Insectenpins	Fine Science Tools	26002-10
Forceps - Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20
Microdissectie schaar	Fine Science Tools	15000-08
Stereomicroscoop	Leica Microsystems	MZ8
Micrometeraandrijvingen	Parker Hannifin	3936M
Thermometer	Physitemp	BAT-12
Waterbadcirculator	Neslab Instruments	RTE-111
Temperatuurregelaar	Aplha Omega Instruments	Series 800
LabVIEW-software	National Instruments	-
Computer	Gevarieerd	-
Kamersysteem	Aurora Scientific	802D
Lengte-regelaar	Aurora Scientific	312C
Kracht-transducer	Aurora Scientific	403A
Reagentia
K-proprionaat	TCI America	P0510
Imidazool	Sigma-Aldrich	I0125
MgCl2•6H20	Sigma-Aldrich	M2670
Brij 58	Sigma-Aldrich	P5884
EGTA (zuur)	Sigma-Aldrich	E0396
Na2H2ATP•0.56H2O	Sigma-Aldrich	A7699
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
HEPES (zuur)	Sigma-Aldrich	H7523
MgO	Sigma-Aldrich	529699
HDTA (zuur)	TCI America	D2019
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830
NaN3	Sigma-Aldrich	S8032
KOH (1 N)	Sigma-Aldrich	35113
HCl (1 N)	Sigma-Aldrich	318949
Na2CrP•4H2O	Sigma-Aldrich	P7936
pH 10 standaard	Fisher Scientific	SB115
pH 7 standaard	Fisher Scientific	SB107