Methodenartikel

Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer

DOI:

10.3791/52716

⸱

29 april 2015

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het enterische zenuwstelsel wordt gevormd door neurale crestcellen die zich vermenigvuldigen, migreren en het darmkanaal koloniseren. Neurale crestcellen differentiëren zich in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitterfenotype. Dit protocol beschrijft een techniek voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van het muis embryonale gastro-intestinale kanaal om de expressie van enterische zenuwstelsel neurotransmitters te visualiseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het enterische zenuwstelsel wordt gevormd door neurale crestcellen die zich vermenigvuldigen, migreren en het darmkanaal koloniseren. Na kolonisatie moeten neurale crestcellen vervolgens differentiëren in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitterfenotype. Cholinerge neuronen, een belangrijk neurotransmitterfenotype in het enterische zenuwstelsel, worden geïdentificeerd door kleuring voor choline-acetyltransferase (ChAT), het synthese-enzym voor acetylcholine. Historische pogingen om cholinerge neuronen te visualiseren, zijn gehinderd door antilichamen met verschillende specificiteiten voor centraal zenuwstelsel versus perifeer zenuwstelsel ChAT. Wij en anderen hebben deze beperking overwonnen door een antilichaam te gebruiken tegen placentaal ChAT, dat zowel centraal als perifeer ChAT herkent, om met succes embryonale enterische cholinerge neuronen te visualiseren. Bovendien hebben we dit antilichaam vergeleken met genetische reporters voor ChAT en aangetoond dat het antilichaam betrouwbaarder is tijdens de embryogenese. Dit protocol beschrijft een techniek voor het dissekeren, fixeren en immunokleuring van het muis-embryonale gastro-intestinale kanaal om de expressie van neurotransmitters in het enterische zenuwstelsel te visualiseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een functionerende enterisch zenuwstelsel (ENS), die de beweeglijkheid, de opname van voedingsstoffen, en de lokale doorbloeding controleert, is essentieel voor het leven 1. De ENS wordt gevormd door neurale cellen (NCC) die prolifereren, te migreren en koloniseren de darm, waar ze differentiëren tot ganglia neuronen en gliacellen. De ziekte van Hirschsprung (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), een multigeneic aangeboren aandoening met een incidentie van 1 op 4000 levendgeborenen, kan worden beschouwd als de prototypische ziekte voor het bestuderen verstoord ENS formatie. In HSCR, NCC niet te migreren en koloniseren verschillende lengten van de distale dikke darm 2. Bovendien, andere veel voorkomende gastro-intestinale (GI) ontwikkelingsstoornissen gebreken in de pediatrische populatie, zoals anorectal misvormingen, intestinale atresias en motiliteitsstoornissen gepaard gaan met stoornissen in de basis ENS functies, en zijn waarschijnlijk geassocieerd met subtiele, ondergewaardeerde, anatomische veranderingen en functionele veranderingen inde ENS 3-6. Daarom kan technieken die ons toelaten om de ontwikkeling determinanten van ENS vorming begrijpen licht werpen op het ontstaan ​​en de mogelijke behandeling van pediatrische maagdarmstelsel aandoeningen.

Na migratie en kolonisatie, NCC differentieert in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitter fenotype. Cholinergische neuronen omvatten ongeveer 60% van enterische neuronen 7 en kan worden gedetecteerd door kleuring choline acetyltransferase (ChAT), het enzym synthetiserende de excitatoire neurotransmitter acetylcholine. Historisch gezien, probeert visualiseren cholinerge neuronen veroorzaakt werden door verschillende antigeenspecificiteit van antilichamen gericht tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) ChAT versus perifere zenuwstelsel (PNS) ChAT 8-10. Echter, antilichamen gericht tegen ChAT placenta herkennen zowel de centrale en perifere ChAT 11-13, en we hebben onlangs beschreven technieken die het mogelijk maken voor Visuabiliseren van ENS cholinergische neuronen met een hoge gevoeligheid eerder in ontwikkeling dan is bereikt met ChAT reporter lijnen 14.

Hier presenteren we een techniek voor het ontleden, fixeren en immunokleuring van het murine embryonale spijsverteringskanaal aan ENS neurotransmitter expressie in neuronen te visualiseren. FloxSTOP:: tdTomato dieren produceren Chat Cre; R26R: Voor deze studies hebben we ChAT-Cre muizen gekruist met R26R benut floxSTOP: tdTomato muizen (gedefinieerd als ChAT-Cre tdTomato het hele manuscript). Deze dieren werden vervolgens gekruist met homozygote ChAT-GFP reporter muizen, muizen die zowel fluorescerende verslaggevers dat ChAT expressie 14 te detecteren verkrijgen. Deze twee reporter dieren zijn op een C57BL / 6J achtergrond en zijn commercieel verkrijgbaar (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik goedgekeurd van alle procedures.

1. Voorbereiding van de Solutions

  1. Gebruik 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als dissectie buffer en spoeloplossing.
  2. Bereid 30% sucrose door weging van 30 g sucrose en plaats in een fles. Voeg 99 ml 1x PBS en voeg 1 ml 10% natriumazide. Grondig mengen totdat alle sucrose opgelost. Bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
  3. Bereid blockingbuffer door mengen 1x PBS, 3% bovine serum albumine (BSA) en 0,1% Triton-X-100. Meng goed en bewaar in de koelkast totdat het nodig is.
  4. Bereid 8% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1 x PBS door weging van de juiste hoeveelheid PFA in 1x PBS en vervolgens geïncubeerd bij 65 ° C totdat deze volledig is opgelost. Bewaren in 25 ml porties in de -20 ° C vriezer totdat het nodig is. Verdun tot 4% PFA in 1x PBS op de dag van gebruik.

2. Embryo en Gut Dissection

  1. In overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd protocollen, euthanaseren getimede zwangere muis en de overdracht van de baarmoeder in een 60 mm petrischaal met ijskoude 1x PBS.
  2. Onder een dissectie microscoop met een scherpe schaar, knip de baarmoederwand open voor de embryo's bloot te leggen. Verwijder het embryo uit de baarmoeder en plaats in een schone 60 mm petrischaal met ijskoude 1x PBS.
  3. Euthanaseren elk embryo door onthoofding in ijskoud 1x PBS. Als u gebruik maakt van transgene muizen met fluorescerende eiwitten, onder fluorescentie verlichting, het identificeren van de positieve transgene embryo's.
  4. Ontleden het maagdarmkanaal van elk embryo met behulp van een dissectie microscoop. Met behulp van fijne tang, oriënteren het embryo zodanig dat de linkerkant naar boven is gericht en de rechterkant tegen de onderkant van de petrischaal. Verwijder de bovenste lichaamswand van het embryo naar de interne organen bloot. Plaats fijne tang tussen de dorsale lichaamswand en de inwendige organen. Cross de tang tegen elkaar in een schaarachtige snijwerking de interne organen van het embryo verwijderd.
  5. Verdere sub-ontleden het spijsverteringskanaal van het omliggende organen en plaats elk maagdarmkanaal in een 1,5 ml microcentrifugebuis met ijskoud 1x PBS.

3. Fixatie van GI Tracts

  1. Spoel elke maagdarmkanaal 3 maal met ijskoude 1x PBS en daarna vervangen door 4% PFA. Bevestig de GI traktaten in de 1,5 ml microcentrifuge buizen op een schommelende platform bij kamertemperatuur 1,5 uur. Spoel de GI stukken 3 maal gedurende 5 min bij kamertemperatuur en vervolgens gedurende 1 uur op het schudplatform. In dit stadium, bewaar de GI stukken bij 4 ° C in 30% sucrose in 1 x PBS bevattende 0,1% natrium- azide tot gebruik.
    OPMERKING: U bewaar het embryo in 30% sucrose gedurende één jaar zonder dat dit de integriteit van de weefsels. Opslag van de monsters in 30% sucrose maakt latere verwerking van de monsters hetzij voor immunokleuring en in oktober voor cryo-sectioning. Als alternatief gaan met de immunokleuring protocol hieronder beschreven.

4. Immunokleuring Protocol

  1. Indien monsters zijn opgeslagen in 30% sucrose, spoel ze 3 keer voor 20 min in 1x PBS op een schommelende platform.
  2. Plaats de GI traktaten in het blokkeren van oplossing op een schommelende platform voor 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de GI stukken met de juiste hoeveelheid van primaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing hetzij 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C op een schudplatform. Met 1: 1000 verdunning van humaan anti-Hu-antilichaam (verkregen serum van patiënt), 1: 1000 verdunning van anti-chicken green fluorescent protein (GFP) antilichaam en 1: 100 verdunning van geit anti-ChAT antilichaam.
    OPMERKING: We gebruiken een humaan anti-Hu antilichaam dat lokaal is verkregen van een patiënt, maar anti-Hu antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar, bijvoorbeeld, muis anti-Hu, (gebruik bij 1: 500 verdunning).
  4. Spoel de GI traktaten in 1x PBS3 maal gedurende 5 min en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
  5. Vervang 1x PBS met secundaire antilichamen verdund 1: 500 in blokkerende oplossing op een schudplatform voor of 4 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Gebruik ezel anti-humaan amine-reactieve kleurstof zoals Dylight, ezel anti-kip Cy2 en ezel anti-geit Cy5. Bij gebruik van de muis anti-Hu antilichaam gebruik dan een 1: 500 verdunning van ezel anti-muis amine-reactieve kleurstof 405.
    Opmerking: De intensiteit van de endogene GFP en tdTomato expressie en de helderheid van immunokleuring stijging met ontwikkelingsleeftijd. Wij doorgaans immunostain embryonale ingewanden afzonderlijk in 0,2 ml buizen met 150 gl kleuroplossing om de hoeveelheid gebruikte antilichaam verminderen en ook om efficiënte kleuring van het weefsel te verzekeren.
  6. Spoel de GI stukken in 1x PBS 3 maal gedurende 5 min en vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een schudplatform.
  7. Plaats een paar druppels fixeermiddel fluorescentie met DAPI op een glasplaatje. Dompel de GI tract in de fluorescentie fixeermiddel en voeg een afdekglas direct op het weefsel. De fluorescentie fixeermiddel -G is een in water oplosbare verbinding die een semi-permanente afdichting zorgt.
    OPMERKING: Gebruik fluorescentie montage medium zoals Vectashield dat is een glycerol gebaseerde montage medium dat verkleuring en fotobleken van antilichamen voorkomt. Beide producten kunnen weefsels worden opgeslagen gedurende lange tijd bij 4 ° C.
  8. Beelden vastleggen van elk fluorofoor met een confocale microscoop. Gebruik excitatie golflengten fluoroforen en filters gebruikt in tabel 3.
  9. Voer computergestuurde beeldanalyse behulp van geschikte software, afhankelijk van het type gebruikt voor confocale beelden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben eerder beschreven het genereren van muizen die zowel GFP en tdTomato fluorescerende verslaggevers dat ChAT expressie 14 te detecteren. In het kort werden Chat Cre muizen gekruist met R26R: floxSTOP: tdTomato dieren produceren Chat Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato muizen (de zogenaamde ChAT-Cre tdTomato). Deze dieren werden vervolgens gekruist met homozygote ChAT-GFP reporter muizen. Embryo's werden geïsoleerd en weefsels voorafgaand aan vast ontleed en i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat intestinale afwijkingen in HSCR niet worden beperkt tot de aganglionic colon maar proximaal uitgebreid, zelfs tot in de ganglionated dunne darm 5,15,16. Deze veranderingen omvatten veranderingen in ENS neuronale dichtheid en neurotransmitter fenotype en kan goed zijn voor dysmotiliteit die is waargenomen bij patiënten met HSCR. We hebben de bovenstaande technieken gebruikt in onze inspanningen om de determinanten van ENS formatie te begrijpen. Specifiek zijn d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund byThe American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) en de National Institutes of Health K08DK098271 (AG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Phosphate buffered salineOxoidBR0014G
SucroseFisherS2
Sodium azideFisherBP9221
Bovine serum albuminFisherBP1605
Triton X-100SigmaX100
ParaformaldehydeSigma158127
60 mm Petri dishesFisherFB0875713A
Fluorescence microscopeNikonSMZ-18 stereoscope
Dissection microscopeNikonSMZ-18 stereoscope
Fine forcepsFine science tools11252-20
1.5 ml Eppendorf tubesVWR20170-038
Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, AL0100-01
Glass slidesFisher12-550-15
Cover glassVWR16004-330
Confocal microscopeNikonNikon A1
Nikon ElementsNikon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Enteric Nervous SystemMurine Embryonic GutCholine AcetyltransferaseImmunostaining TechniquePlacental ChAT AntibodyNeural Crest CellsCholinergic NeuronsGastrointestinal Tract DissectionEmbryonic DevelopmentNeurotransmitter Phenotype

Gerelateerde artikelen