Methodenartikel

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

DOI:

10.3791/52722

⸱

3 april 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol Gegevens methode extracellulaire blaasjes (EV), kleine membraneuze deeltjes vrijgemaakt uit cellen te isoleren, van slechts 10 pl serummonsters. Deze benadering omzeilt de noodzaak van ultracentrifugatie, vereist slechts enkele minuten testtijd en maakt de isolatie van EV uit monsters van beperkte omvang.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's), membraneuze deeltjes die vrijkomen uit verschillende soorten cellen, het bezit van een groot potentieel voor klinische toepassingen. Zij bevatten nucleïnezuur en eiwit lading en worden steeds meer erkend als een middel van intercellulaire communicatie gebruikt door zowel eukaryote en prokaryote cellen. Vanwege hun geringe omvang huidige protocollen voor isolatie van EV vaak tijdrovend, omslachtig en grote monstervolumes en dure apparatuur, zoals een ultracentrifuge nodig. Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we een papieren immunoaffiniteit platform voor het scheiden van subgroepen van EV's dat is gemakkelijk, efficiënt, en vereist monster volumes zo laag als 10 pi. Biologische monsters kunnen direct worden gepipetteerd op papier testzones die chemisch zijn gewijzigd met capture moleculen die een hoge affiniteit voor specifieke EV oppervlakte markers hebben. We valideren de test met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), op papier gebaseerde enzym-gekoppelde immunosorbent assays (P-ELISA), en transcriptoomanalyse. Deze papieren apparaten zal de studie van EV's in de kliniek en de instelling onderzoek mogelijk maken om te helpen tot een beter begrip van de EV-functies in gezondheid en ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn heterogene membraan-deeltjes met een grootte variërend van 40 nm tot 5.000 nm en worden actief afgescheiden door veel celtypen via verschillende biogeneseroutes1-9. Ze bevatten unieke en geselecteerde subsets van DNA, RNA, eiwitten en oppervlaktemarkers van oudercellen. Hun betrokkenheid bij een verscheidenheid aan cellulaire processen, zoals intercellulaire communicatie10, immuunmodulatie11, angiogenese12, metastase12, chemoresistentie13 en de ontwikkeling van oogziekten9, wordt steeds meer erkend en heeft een grote belangstelling gewekt voor hun nut bij diagnostische, prognostische, therapeutische en fundamentele biologische toepassingen.

EV's kunnen klassiek worden gecategoriseerd als exosomen, microvesikels, apoptotische lichamen, oncosomen, ectosomen, microdeeltjes, telerosomen, prostatosomen, cardiosomen en vexosomen, enz., op basis van hun biogenese of cellulaire oorsprong. Exosomen worden bijvoorbeeld gevormd in multivesiculair lichamen, terwijl microvesikels worden gegenereerd door uitknopingen rechtstreeks van het plasmamembraan en apoptotische vesikels zijn afkomstig van apoptotische of necrotische cellen. De nomenclatuur wordt echter nog steeds verfijnd, deels vanwege een gebrek aan grondig begrip en karakterisering van EV's. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om EV's te zuiveren, waaronder ultracentrifugatie14, ultrafiltratie15, magnetische kralen16, polymere precipitatie17-19 en microfluïdische technieken20-22. De meest gebruikelijke procedure om EV's te zuiveren omvat een reeks centrifugaties en/of filtratie om grote deeltjes en andere cellulaire verontreinigingen te verwijderen, gevolgd door een laatste ultracentrifugatie met hoge snelheid, een proces dat duur, tijdrovend en niet-specifiek is14,23,24. Helaas is de technologische behoefte aan snelle en betrouwbare isolatie van EV's met voldoende zuiverheid en efficiëntie nog niet vervuld.

We hebben een op papier gebaseerd immunoaffiniteitsapparaat ontwikkeld dat een eenvoudige, tijd- en kostenbesparende, maar efficiënte manier biedt om subgroepen van EV's te isoleren en te karakteriseren22. Cellulosepapier gesneden in een gedefinieerde vorm kan worden gerangschikt en gelamineerd met behulp van twee plastic platen met geregistreerde doorgangsgaten. In tegenstelling tot de algemene strategie om de vloeistofbarrière in papiergebaseerde apparaten te definiëren door hydrofobe was of polymeren af te drukken25-27, zijn deze gelamineerde papierpatronen bestand tegen veel organische vloeistoffen, inclusief ethanol. Papiertestzones worden chemisch gemodificeerd om een stabiele en dichte dekking van captuurmoleculen te bieden (bijv. doelspecifieke antilichamen) die een hoge affiniteit hebben voor specifieke oppervlaktemarkers op EV-subgroepen. Biologische monsters kunnen direct op de papiertestzones worden gepipetteerd en gezuiverde EV's worden vastgehouden na spoelstappen. Karakterisering van geïsoleerde EV's kan worden uitgevoerd door SEM, ELISA en transcriptoomanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een algemeen schema van de operatie procedure wordt gegeven in figuur 1. Met behulp van ethische praktijken, we verzamelde bloedmonsters van gezonde proefpersonen, en verkregen waterige humor monsters van patiënten via de Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan onder IRB goedgekeurde protocollen ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Fabrication papier Devices

  1. Snijd chromatografie papier in kringen van 5 mm in diameter dezelfde opstelling als een 96-well microtiter plate. Sandwich deze papieren stukken met twee polystyreen platen met maatschappelijke doorgaande gaten, en laminaat.
  2. Wijzigen papier apparaten die gebruik maken van de chemische conjugatie methode in de volgende stappen 28 beschreven.
    1. Behandel papier apparaten met zuurstofplasma (100 mW, 1% zuurstof, 30 sec) in een plasmakamer.
      LET OP: Speciale voorzichtigheid moeten worden genomen bij het ​​werken met 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan en N -γ-maleimidobutyryloxy succinimideester (GMBS), aangezien ze allebei vochtgevoelig en toxisch. Draag beschermende handschoenen en inademing vermijden of contact met de huid en ogen. Houd het flesje goed gesloten en laat het in evenwicht te RT voor de opening om condensatie van water te voorkomen. Als alternatief opent u het flesje in een met stikstof gevulde handschoen zak of doos. Aliquot in kleine flesjes te frequent openen van het flesje te vermijden.
    2. Onmiddellijk Incubeer behandelde papier inrichtingen in een 4% (v / v) oplossing van 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol (200 proof) gedurende 30 min.
    3. Spoel papier apparaten met ethanol en incubeer ze met 0,01 umol / ml GMBS in ethanol gedurende 15 min.
    4. Spoelen met ethanol (200 proof) en incubeer papier apparaten met 10 ug / ml avidine oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Bewaar bij 4 ° C indien nodig, en binnen 4 weken.
  3. Bevochtig elk document beproevingszones met 10 pl PBS dat 1% (w / v) runderserumalbumine (BSA) Gedurende 3 x 10 min voor spotting 10 pl gebiotinyleerd vangende moleculen gedurende 3 x 10 min. Met anti-CD63 antilichaam (20 ug / ml in PBS bevattende 1% (w / v) BSA en 0,09% (w / v) natriumazide) en annexine V (01:20, v / v in annexine V binding buffer) als capture moleculen.
  4. Spoel ongebonden anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min, respectievelijk.

2. Serum en kamerwater Sample verzamelen en verwerken

  1. Serum collectie.
    1. Verzamel 10 ml van perifeer bloed door venapunctie in serumafscheiding buizen en voorzichtig omkeren van de buis vijf keer. Zet de buis verticaal en wacht 30 minuten.
    2. Centrifugeer bij 1200 xg gedurende 15 min. Breng het serum van de toplaag naar een schone buis en centrifugeer opnieuw bij 3000 xg gedurende 30 min.
    3. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,8 micrometer filter. Laat het monster bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Kamerwater collectie: verzamel kamerwater monsters van patiënten gediagnosticeerd door een oftalmoloog rechtstreeks via invasieve procedures en bewaar monsters bij -80 ° C tot gebruik.

3. Isolatie van extracellulaire blaasjes

  1. Schepmonsters op elk papier testzone met een snelheid van 5 pl / min.
  2. Spoel ongebonden EV met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min voor papier apparaten gefunctionaliseerd met anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen resp. Voer de volgende stroomafwaarts assays.

4. Downstream Assay Voorbeeld 1: Scannen Electromicrographs

  1. Fix EV's vastgelegd op gefunctionaliseerde papier testzone met behulp van 10 pi 0,5 × Karnovsky's fixatief gedurende 10 min.
  2. Spoel de monsters met ruime PBS gedurende 2 x 5 min.
  3. Dehydrateer demonsters latere 35% ethanol gedurende 10 min, 50% ethanol gedurende 2 x 10 min, 70% ethanol gedurende 2 x 10 min, 95% ethanol gedurende 2 x 10 minuten, en 100% ethanol gedurende 4 x 10 min.
  4. Kritische droog en sputteren vacht van de monsters met palladium / goud, en te onderzoeken met behulp van een scanning elektronenmicroscoop werkte bij lage elektron versnelling spanning (~ 5 kV).

5. Downstream Assay Voorbeeld 2: Papier-gebaseerde ELISA

  1. Voeg een 5 ul oplossing met anti-CD9 primair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS aan elke test zone met gevangen EV's. Wacht 1 min.
  2. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
  3. Voeg een 5 ul oplossing met mierikswortel peroxidase (HRP) -gebonden secundair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS en wacht 1 min.
  4. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
  5. Voeg 5 ul colorimetrisch substraat met 1: 1 volumeverhouding van waterstofperoxide eend 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) en scannen met behulp van een desktop scanner.

6. Stroomafwaarts Test Voorbeeld 3: RNA Isolation

  1. Dompel de monsters in 35 ul-polyvinylpyrrolidone gebaseerde RNA-isolatie hulp en 265 ul van lysis / binding buffer om EV's gevangen lyseren. Vortex krachtig.
  2. Voeg 30 ul homogenaat verschaft in de isolatiekit het lysaat. Vortex krachtig en zet op ijs gedurende 10 min.
  3. Extraheer het RNA met zuur fenol-chloroform scheiding in de volgende stappen beschreven.
    1. Neem 330 ui fenol-chloroform van de onderste laag van de fles en aan het homogenaat / lysaat. Vortex krachtig.
    2. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de waterige (bovenste) fase naar een schone buis en noteer het volume verwijderd.
  4. Neerslag het totale RNA met 100% ethanol van het volume dat is 1,25 maal het volume van de waterfase verwijderd in de vorige stap en collect het RNA in de elutie-oplossing voorverwarmd tot 95 ° C.
  5. Concentreren en verder te zuiveren het RNA met een RNA cleanup kit volgens het protocol van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van het papier apparaat om subgroepen van EV's te isoleren efficiënt vertrouwt op haar gevoelige en specifieke erkenning van EV oppervlakte markers. De stabiele modificatie van papiervezels aan vangende moleculen is mogelijk door avidine-biotine chemie zoals elders 28-30 beschreven. De effectiviteit van chemische conjugatie en dat van de fysisorptie werkwijze wordt beoordeeld op basis fluorescentie gebaseerde uitlezingen. Het papier testzones worden bereid volgens het protocol stap 1), behalv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stappen voor een succesvolle isolatie van subgroepen van extracellulaire blaasjes zijn: 1) een goede keuze van papier; 2) stabiele en hoge dekking van vangende moleculen aan het oppervlak van de vezels; 3) de goede behandeling van monsters; en 4) de algemene hygiëne in laboratoria praktijk.

Poreuze materialen zijn gebruikt in vele goedkope en apparatuur vrij assays. Zij kunnen afstembare poriegrootte veelzijdige toepassing, lage kosten en hoge oppervlakte-volume verhouding...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd mede ondersteund door de Taiwan National Science Council grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) en NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), en de Veterans General ziekenhuizen en Universiteit Systeem van Taiwan Joint Research Program (CC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617Deze chemische stof reageert met water en vocht en moet worden toegepast in een met stikstof gevulde handschoenzak. Vermijd contact met ogen en huid. Adem geen dampen in of inadem van dampen.
EthanolFisher ScientificBP2818Absoluut, 200 Proof, moleculair biologie kwaliteit
Bovine serum albumine (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Vaak aangeduid als Cohn-fractie V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is een amine-naar-sulfhydryl crosslinker. GMBS is gevoelig voor vocht.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin heeft 4 bindingsplaatsen voor biotine en de pI-waarde is 6,3, wat neutraler is dan natieve avidine
Biotinyleerde muis anti-menselijke anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinyleerde annexin VBD Biosciences556418Annxin V heeft een hoge affiniteit voor fosfatidyl-serine (PS)
Primaire anti-CD9 en secundaire antilichaamSystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1Het secundaire antilichaam is geconjugeerd met paardenradijs-peroxidase
SerumscheidingsbuizenBD Biosciences367991Stollingsactivator en gel voor serumscheiding
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; verdun tot 1x voor gebruik.
TMB substraatreagens setBD Biosciences555214De set bevat waterstofperoxide en 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolatie kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolatie kit
Polyvinylpyrrolidon-gebaseerde RNA isolatie hulpmiddelLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolatie hulpmiddel bevat polyvinylpyrrolidon (PVP) dat bindt aan polysacchariden.
RNA opruiming kitQiagen Inc.74004MinElute RNA opruiming kit is ontworpen voor zuivering van maximaal 45 μg RNA.
Plasma kamerMarch InstrumentsPX-250
Scanning elektronenmicroscoopHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit kleurenafbeeldingen werden vastgelegd. Camera's en smartphones kunnen ook worden gebruikt.
BeeldrecordersysteemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bits fluorescerende beelden werden vastgelegd. Fluorescerende microscopen kunnen ook worden gebruikt.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellular VesiclesPaper based DeviceImmunoaffinity IsolationScanning Electron MicroscopyP ELISATranscriptome AnalysisCD63 AntibodyAqueous HumorSerum ProcessingRNA Extraction

Gerelateerde artikelen