Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Summary

Dit protocol Gegevens methode extracellulaire blaasjes (EV), kleine membraneuze deeltjes vrijgemaakt uit cellen te isoleren, van slechts 10 pl serummonsters. Deze benadering omzeilt de noodzaak van ultracentrifugatie, vereist slechts enkele minuten testtijd en maakt de isolatie van EV uit monsters van beperkte omvang.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's), membraneuze deeltjes die vrijkomen uit verschillende soorten cellen, het bezit van een groot potentieel voor klinische toepassingen. Zij bevatten nucleïnezuur en eiwit lading en worden steeds meer erkend als een middel van intercellulaire communicatie gebruikt door zowel eukaryote en prokaryote cellen. Vanwege hun geringe omvang huidige protocollen voor isolatie van EV vaak tijdrovend, omslachtig en grote monstervolumes en dure apparatuur, zoals een ultracentrifuge nodig. Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we een papieren immunoaffiniteit platform voor het scheiden van subgroepen van EV's dat is gemakkelijk, efficiënt, en vereist monster volumes zo laag als 10 pi. Biologische monsters kunnen direct worden gepipetteerd op papier testzones die chemisch zijn gewijzigd met capture moleculen die een hoge affiniteit voor specifieke EV oppervlakte markers hebben. We valideren de test met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), op papier gebaseerde enzym-gekoppelde immunosorbent assays (P-ELISA), en transcriptoomanalyse. Deze papieren apparaten zal de studie van EV's in de kliniek en de instelling onderzoek mogelijk maken om te helpen tot een beter begrip van de EV-functies in gezondheid en ziekte.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn heterogene membraan-deeltjes met een grootte variërend van 40 nm tot 5.000 nm en worden actief afgescheiden door veel celtypen via verschillende biogeneseroutes^1-9. Ze bevatten unieke en geselecteerde subsets van DNA, RNA, eiwitten en oppervlaktemarkers van oudercellen. Hun betrokkenheid bij een verscheidenheid aan cellulaire processen, zoals intercellulaire communicatie¹⁰, immuunmodulatie¹¹, angiogenese¹², metastase¹², chemoresistentie¹³ en de ontwikkeling van oogziekten⁹, wordt steeds meer erkend en heeft een grote belangstelling gewekt voor hun nut bij diagnostische, prognostische, therapeutische en fundamentele biologische toepassingen.

EV's kunnen klassiek worden gecategoriseerd als exosomen, microvesikels, apoptotische lichamen, oncosomen, ectosomen, microdeeltjes, telerosomen, prostatosomen, cardiosomen en vexosomen, enz., op basis van hun biogenese of cellulaire oorsprong. Exosomen worden bijvoorbeeld gevormd in multivesiculair lichamen, terwijl microvesikels worden gegenereerd door uitknopingen rechtstreeks van het plasmamembraan en apoptotische vesikels zijn afkomstig van apoptotische of necrotische cellen. De nomenclatuur wordt echter nog steeds verfijnd, deels vanwege een gebrek aan grondig begrip en karakterisering van EV's. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om EV's te zuiveren, waaronder ultracentrifugatie¹⁴, ultrafiltratie¹⁵, magnetische kralen¹⁶, polymere precipitatie^17-19 en microfluïdische technieken^20-22. De meest gebruikelijke procedure om EV's te zuiveren omvat een reeks centrifugaties en/of filtratie om grote deeltjes en andere cellulaire verontreinigingen te verwijderen, gevolgd door een laatste ultracentrifugatie met hoge snelheid, een proces dat duur, tijdrovend en niet-specifiek is^14,23,24. Helaas is de technologische behoefte aan snelle en betrouwbare isolatie van EV's met voldoende zuiverheid en efficiëntie nog niet vervuld.

We hebben een op papier gebaseerd immunoaffiniteitsapparaat ontwikkeld dat een eenvoudige, tijd- en kostenbesparende, maar efficiënte manier biedt om subgroepen van EV's te isoleren en te karakteriseren²². Cellulosepapier gesneden in een gedefinieerde vorm kan worden gerangschikt en gelamineerd met behulp van twee plastic platen met geregistreerde doorgangsgaten. In tegenstelling tot de algemene strategie om de vloeistofbarrière in papiergebaseerde apparaten te definiëren door hydrofobe was of polymeren af te drukken^25-27, zijn deze gelamineerde papierpatronen bestand tegen veel organische vloeistoffen, inclusief ethanol. Papiertestzones worden chemisch gemodificeerd om een stabiele en dichte dekking van captuurmoleculen te bieden (bijv. doelspecifieke antilichamen) die een hoge affiniteit hebben voor specifieke oppervlaktemarkers op EV-subgroepen. Biologische monsters kunnen direct op de papiertestzones worden gepipetteerd en gezuiverde EV's worden vastgehouden na spoelstappen. Karakterisering van geïsoleerde EV's kan worden uitgevoerd door SEM, ELISA en transcriptoomanalyse.

Protocol

Een algemeen schema van de operatie procedure wordt gegeven in figuur 1. Met behulp van ethische praktijken, we verzamelde bloedmonsters van gezonde proefpersonen, en verkregen waterige humor monsters van patiënten via de Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan onder IRB goedgekeurde protocollen ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Fabrication papier Devices

1. Snijd chromatografie papier in kringen van 5 mm in diameter dezelfde opstelling als een 96-well microtiter plate. Sandwich deze papieren stukken met twee polystyreen platen met maatschappelijke doorgaande gaten, en laminaat.
2. Wijzigen papier apparaten die gebruik maken van de chemische conjugatie methode in de volgende stappen ²⁸ beschreven.
   1. Behandel papier apparaten met zuurstofplasma (100 mW, 1% zuurstof, 30 sec) in een plasmakamer.
      LET OP: Speciale voorzichtigheid moeten worden genomen bij het ​​werken met 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan en N -γ-maleimidobutyryloxy succinimideester (GMBS), aangezien ze allebei vochtgevoelig en toxisch. Draag beschermende handschoenen en inademing vermijden of contact met de huid en ogen. Houd het flesje goed gesloten en laat het in evenwicht te RT voor de opening om condensatie van water te voorkomen. Als alternatief opent u het flesje in een met stikstof gevulde handschoen zak of doos. Aliquot in kleine flesjes te frequent openen van het flesje te vermijden.
   2. Onmiddellijk Incubeer behandelde papier inrichtingen in een 4% (v / v) oplossing van 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol (200 proof) gedurende 30 min.
   3. Spoel papier apparaten met ethanol en incubeer ze met 0,01 umol / ml GMBS in ethanol gedurende 15 min.
   4. Spoelen met ethanol (200 proof) en incubeer papier apparaten met 10 ug / ml avidine oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Bewaar bij 4 ° C indien nodig, en binnen 4 weken.
3. Bevochtig elk document beproevingszones met 10 pl PBS dat 1% (w / v) runderserumalbumine (BSA) Gedurende 3 x 10 min voor spotting 10 pl gebiotinyleerd vangende moleculen gedurende 3 x 10 min. Met anti-CD63 antilichaam (20 ug / ml in PBS bevattende 1% (w / v) BSA en 0,09% (w / v) natriumazide) en annexine V (01:20, v / v in annexine V binding buffer) als capture moleculen.
4. Spoel ongebonden anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min, respectievelijk.

2. Serum en kamerwater Sample verzamelen en verwerken

1. Serum collectie.
   1. Verzamel 10 ml van perifeer bloed door venapunctie in serumafscheiding buizen en voorzichtig omkeren van de buis vijf keer. Zet de buis verticaal en wacht 30 minuten.
   2. Centrifugeer bij 1200 xg gedurende 15 min. Breng het serum van de toplaag naar een schone buis en centrifugeer opnieuw bij 3000 xg gedurende 30 min.
   3. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,8 micrometer filter. Laat het monster bij -80 ° C tot gebruik.
2. Kamerwater collectie: verzamel kamerwater monsters van patiënten gediagnosticeerd door een oftalmoloog rechtstreeks via invasieve procedures en bewaar monsters bij -80 ° C tot gebruik.

3. Isolatie van extracellulaire blaasjes

1. Schepmonsters op elk papier testzone met een snelheid van 5 pl / min.
2. Spoel ongebonden EV met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min voor papier apparaten gefunctionaliseerd met anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen resp. Voer de volgende stroomafwaarts assays.

4. Downstream Assay Voorbeeld 1: Scannen Electromicrographs

1. Fix EV's vastgelegd op gefunctionaliseerde papier testzone met behulp van 10 pi 0,5 × Karnovsky's fixatief gedurende 10 min.
2. Spoel de monsters met ruime PBS gedurende 2 x 5 min.
3. Dehydrateer demonsters latere 35% ethanol gedurende 10 min, 50% ethanol gedurende 2 x 10 min, 70% ethanol gedurende 2 x 10 min, 95% ethanol gedurende 2 x 10 minuten, en 100% ethanol gedurende 4 x 10 min.
4. Kritische droog en sputteren vacht van de monsters met palladium / goud, en te onderzoeken met behulp van een scanning elektronenmicroscoop werkte bij lage elektron versnelling spanning (~ 5 kV).

5. Downstream Assay Voorbeeld 2: Papier-gebaseerde ELISA

1. Voeg een 5 ul oplossing met anti-CD9 primair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS aan elke test zone met gevangen EV's. Wacht 1 min.
2. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
3. Voeg een 5 ul oplossing met mierikswortel peroxidase (HRP) -gebonden secundair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS en wacht 1 min.
4. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
5. Voeg 5 ul colorimetrisch substraat met 1: 1 volumeverhouding van waterstofperoxide eend 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) en scannen met behulp van een desktop scanner.

6. Stroomafwaarts Test Voorbeeld 3: RNA Isolation

1. Dompel de monsters in 35 ul-polyvinylpyrrolidone gebaseerde RNA-isolatie hulp en 265 ul van lysis / binding buffer om EV's gevangen lyseren. Vortex krachtig.
2. Voeg 30 ul homogenaat verschaft in de isolatiekit het lysaat. Vortex krachtig en zet op ijs gedurende 10 min.
3. Extraheer het RNA met zuur fenol-chloroform scheiding in de volgende stappen beschreven.
   1. Neem 330 ui fenol-chloroform van de onderste laag van de fles en aan het homogenaat / lysaat. Vortex krachtig.
   2. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de waterige (bovenste) fase naar een schone buis en noteer het volume verwijderd.
4. Neerslag het totale RNA met 100% ethanol van het volume dat is 1,25 maal het volume van de waterfase verwijderd in de vorige stap en collect het RNA in de elutie-oplossing voorverwarmd tot 95 ° C.
5. Concentreren en verder te zuiveren het RNA met een RNA cleanup kit volgens het protocol van de fabrikant.

Results

Het vermogen van het papier apparaat om subgroepen van EV's te isoleren efficiënt vertrouwt op haar gevoelige en specifieke erkenning van EV oppervlakte markers. De stabiele modificatie van papiervezels aan vangende moleculen is mogelijk door avidine-biotine chemie zoals elders ^28-30 beschreven. De effectiviteit van chemische conjugatie en dat van de fysisorptie werkwijze wordt beoordeeld op basis fluorescentie gebaseerde uitlezingen. Het papier testzones worden bereid volgens het protocol stap 1), behalv...

Discussion

De meest kritische stappen voor een succesvolle isolatie van subgroepen van extracellulaire blaasjes zijn: 1) een goede keuze van papier; 2) stabiele en hoge dekking van vangende moleculen aan het oppervlak van de vezels; 3) de goede behandeling van monsters; en 4) de algemene hygiëne in laboratoria praktijk.

Poreuze materialen zijn gebruikt in vele goedkope en apparatuur vrij assays. Zij kunnen afstembare poriegrootte veelzijdige toepassing, lage kosten en hoge oppervlakte-volume verhouding...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatography Paper	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane	Sigma Aldrich	175617	Deze chemische stof reageert met water en vocht en moet worden toegepast in een met stikstof gevulde handschoenzak. Vermijd contact met ogen en huid. Adem geen dampen in of inadem van dampen.
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818	Absoluut, 200 Proof, moleculair biologie kwaliteit
Bovine serum albumine (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	Vaak aangeduid als Cohn-fractie V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS is een amine-naar-sulfhydryl crosslinker. GMBS is gevoelig voor vocht.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAvidin heeft 4 bindingsplaatsen voor biotine en de pI-waarde is 6,3, wat neutraler is dan natieve avidine
Biotinyleerde muis anti-menselijke anti-CD63	Ancell	215-030	clone AHN16.1/46-4-5
biotinyleerde annexin V	BD Biosciences	556418	Annxin V heeft een hoge affiniteit voor fosfatidyl-serine (PS)
Primaire anti-CD9 en secundaire antilichaam	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	Het secundaire antilichaam is geconjugeerd met paardenradijs-peroxidase
Serumscheidingsbuizen	BD Biosciences	367991	Stollingsactivator en gel voor serumscheiding
Annexin V binding buffer	BD Biosciences	556454	10x; verdun tot 1x voor gebruik.
TMB substraatreagens set	BD Biosciences	555214	De set bevat waterstofperoxide en 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolatie kit	Life Technologies	AM1560	MirVana RNA isolatie kit
Polyvinylpyrrolidon-gebaseerde RNA isolatie hulpmiddel	Life Technologies	AM9690	Plant RNA isolatie hulpmiddel bevat polyvinylpyrrolidon (PVP) dat bindt aan polysacchariden.
RNA opruiming kit	Qiagen Inc.	74004	MinElute RNA opruiming kit is ontworpen voor zuivering van maximaal 45 μg RNA.
Plasma kamer	March Instruments	PX-250
Scanning elektronenmicroscoop	Hitachi Ltd.	S-4300
Desktop scanner	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	8-bit kleurenafbeeldingen werden vastgelegd. Camera's en smartphones kunnen ook worden gebruikt.
Beeldrecordersysteem	J&H Technology Co	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	16-bits fluorescerende beelden werden vastgelegd. Fluorescerende microscopen kunnen ook worden gebruikt.