Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwitsynthese is een fundamenteel proces om genexpressie beïnvloeden diverse biologische processen name aanpassing aan de omgevingsomstandigheden. De initiatiestap, waarbij het samenstel van de ribosomale subeenheden van het mRNA initiatiecodon, betrokken initiatiefactor inclusief eIF4G1 gaat. Defecten in deze snelheidsbeperkende stap van de vertaling zijn gekoppeld aan diverse stoornissen. Om de mogelijke gevolgen van een dergelijke deregulering studeren, Xenopus laevis oöcyten vormen een aantrekkelijk model met een hoge mate van bescherming van de essentiële cellulaire en moleculaire mechanismen met menselijke. Bovendien, tijdens de meiose rijping, eicellen worden transcriptioneel onderdrukt en alle benodigde eiwitten worden vertaald uit het reeds bestaande, maternale mRNA's. Deze goedkope model stelt exogeen mRNA perfect geïntegreerd met een effectieve vertaling geworden. Hier wordt beschreven een protocol voor de beoordeling van vertalingen met een factor van belang (hier eIF4G1) met behulp van stored maternale mRNA die het eerst worden gepolyadenyleerde en omgezet in eicelrijping als fysiologische uitlezing. Aanvankelijk mRNA gesynthetiseerd door in vitro transcriptie van plasmiden van belang (hier eIF4G1) geïnjecteerd in oöcyten en kinetiek van eicelrijping door kiemblaasje Breakdown detectie bepaald. De bestudeerde maternale mRNA doel de serine / threonine-proteïne-kinase mos. De polyadenylatie en de latere vertalingen worden onderzocht samen met de expressie en fosforylering van eiwitten van de mos signaleringscascade betrokken bij eicelrijping. Variaties van het huidige protocol naar voren translationeel defecten worden ook voorgesteld om de algemene toepasbaarheid benadrukken zetten. Gezien wordend bewijs dat afwijkende eiwitsynthese betrokken kan zijn bij de pathogenese van neurologische aandoeningen, zoals een model biedt de mogelijkheid om deze uitholling gemakkelijk evalueren en nieuwe targets.
Inleiding
Eiwitten zijn essentiële onderdelen van cellulaire leven en derhalve op grotere schaal van het organisme. Zij zorgen voor de meeste cellulaire functies waaronder de structuur, transport reactie katalyse, regulering, genexpressie etc. Hun expressie is het resultaat van een complex mechanisme van translatie voor de conversie van een mRNA in eiwit. De vertaling wordt onderworpen aan diverse controles aan te passen en om genexpressie te reguleren volgens de cel nodig, tijdens de ontwikkeling en differentiatie, veroudering, fysiologische stress of pathologische verschijnselen.
Vertaling is verdeeld in 3 fasen (initiatie, verlenging en beëindig....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle Xenopus experimenten werden uitgevoerd op het dier faciliteit van de Lille 1 universiteit volgens de regels van de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap van de Raad (86/609 / EEG) voor laboratorium dierproeven. Het dier protocol werd goedgekeurd door de lokale institutionele review board (Comité d'Ethique en Experimenteren Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).
1. Eicel Handling
- Bereid de verdoving oplossing: los 1 g tricaïne methaansulfonaat poeder in een 1 liter steriel water.
- Plunge vrouwelijke Xenopus laevis in deze oplossing, hebben betrekking op de beker om ontsnapping te voorko....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Kinetische rijping van Xenopus oöcyten en de bepaling van het percentage eicel GVBD na 24 uur van de PG stimulatie (Figuren 2B, 2C):
Om de gevolgen van het translationele eIF4G1-DN mutatie studie, de reactie op PG in Xenopus laevis oocyten micro-geïnjecteerd met cRNA eIF4G1-DN vergeleken met eIF4G1-WT en andere controle omstandigheden (H 2 O, GFP). De controles mogelijk om de incidentie van oöcyt micro-injectie beoordelen ongeacht de aar.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vertaling is een mechanisme betrokken bij de pathofysiologie van talrijke humane ziekten waaronder verscheidene neurodegeneratieve ziekten. Bijvoorbeeld in de ziekte van Parkinson verschillende rapporten stelde de bijzondere waardevermindering in de vertaling in verband met erfelijke mutaties 8,12,13.
Verschillende cellulaire modellen zijn beschikbaar voor taalstudie. Hier, teneinde de translatie gevolgen van een mutatie in eIF4G1 dat als dominant negatieve mutatie verminderen van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van INSERM, de Universiteit van Lille 1, de Universiteit van Lille 2, Regionaal Ziekenhuiscentrum van Lille (CHR de Lille). MCCH erkent de steun van de Fondation de France en wil IRCL, Pr. Sonenberg bedanken voor de gift van de V5-plasmiden, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) voor de gift van anti-GFP-antilichamen, UMS 3387 (Universiteit van Rennes) waar Xenopus eicellen worden gekocht en Dr Taymans (JPArc, Lille) voor het kritisch lezen van de manuscripttekst.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0.5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
Referenties
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
