Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52724

⸱

27 september 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

In dit artikel

Samenvatting

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Samenvatting

Eiwitsynthese is een fundamenteel proces om genexpressie beïnvloeden diverse biologische processen name aanpassing aan de omgevingsomstandigheden. De initiatiestap, waarbij het samenstel van de ribosomale subeenheden van het mRNA initiatiecodon, betrokken initiatiefactor inclusief eIF4G1 gaat. Defecten in deze snelheidsbeperkende stap van de vertaling zijn gekoppeld aan diverse stoornissen. Om de mogelijke gevolgen van een dergelijke deregulering studeren, Xenopus laevis oöcyten vormen een aantrekkelijk model met een hoge mate van bescherming van de essentiële cellulaire en moleculaire mechanismen met menselijke. Bovendien, tijdens de meiose rijping, eicellen worden transcriptioneel onderdrukt en alle benodigde eiwitten worden vertaald uit het reeds bestaande, maternale mRNA's. Deze goedkope model stelt exogeen mRNA perfect geïntegreerd met een effectieve vertaling geworden. Hier wordt beschreven een protocol voor de beoordeling van vertalingen met een factor van belang (hier eIF4G1) met behulp van stored maternale mRNA die het eerst worden gepolyadenyleerde en omgezet in eicelrijping als fysiologische uitlezing. Aanvankelijk mRNA gesynthetiseerd door in vitro transcriptie van plasmiden van belang (hier eIF4G1) geïnjecteerd in oöcyten en kinetiek van eicelrijping door kiemblaasje Breakdown detectie bepaald. De bestudeerde maternale mRNA doel de serine / threonine-proteïne-kinase mos. De polyadenylatie en de latere vertalingen worden onderzocht samen met de expressie en fosforylering van eiwitten van de mos signaleringscascade betrokken bij eicelrijping. Variaties van het huidige protocol naar voren translationeel defecten worden ook voorgesteld om de algemene toepasbaarheid benadrukken zetten. Gezien wordend bewijs dat afwijkende eiwitsynthese betrokken kan zijn bij de pathogenese van neurologische aandoeningen, zoals een model biedt de mogelijkheid om deze uitholling gemakkelijk evalueren en nieuwe targets.

Inleiding

Eiwitten zijn essentiële onderdelen van cellulaire leven en derhalve op grotere schaal van het organisme. Zij zorgen voor de meeste cellulaire functies waaronder de structuur, transport reactie katalyse, regulering, genexpressie etc. Hun expressie is het resultaat van een complex mechanisme van translatie voor de conversie van een mRNA in eiwit. De vertaling wordt onderworpen aan diverse controles aan te passen en om genexpressie te reguleren volgens de cel nodig, tijdens de ontwikkeling en differentiatie, veroudering, fysiologische stress of pathologische verschijnselen.

Vertaling is verdeeld in 3 fasen (initiatie, verlenging en beëindiging) en presenteert 3 initiatie vertaling systemen om in te spelen op deze behoeften: cap-afhankelijke, cap-onafhankelijke via interne Ribosoom Entry Segment (IRES) structuren en cap-onafhankelijke Vertaling Enhancers ( CITE).

De meeste eukaryote mRNA wordt vertaald in een cap-dependent wijze via de 7-methylguanosine 5'-trifosfaat cap die dient als een erkenning waarde tijdens eiwitsynthese. Deze kap eIF4E bindt aan een component van eIF4F complex met eIF4G1 en eIF4A. Geassocieerd met andere partners zoals poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met deze translatie initiatie factoren laten circulariseren mRNA en verbetering van de toegankelijkheid formulieren 43S complex tot augustus initiatiecodon erkenning 1. Deze gebeurtenis geeft het einde van de translatie initiatie dwz de eerste stap van de vertaling.

Cap-onafhankelijke translatie wordt door mRNA coderen voor essentiële proteïnen onder stressomstandigheden dat induceren bijvoorbeeld celproliferatie en apoptose. Het mechanisme omvat secundaire structuren in mRNA 5'-onvertaalde gebied (UTR) genoemd IRES, de carboxy-eindstandige uiteinde van eIF4G1 geassocieerd met eIF4A en 43S complex. De binding van deze 43S pre-initiatie complex aan IRES initieert de dop onafhankelijke vertaling zonder de noodzaak voor eIF4E factor 2,3.

Tot slot, een andere vertaling mechanisme nog niet goed begrepen ondersteunt deze cap-onafhankelijke vertaling activiteit onder benadrukt omstandigheden via CITE structuren zich binnen mRNA UTR 4.

Door deze verschillende wijzen van translatie verschillen hun initiatie stappen translatie speelt een cruciale rol in de cellulaire homeostase en een verandering in één van deze processen zou dus invloed het organisme met kleine tot grote gevolgen. Inderdaad, de initiatie is een snelheidsbeperkende stap voor de juiste vertaling processen van mRNA in eiwitten en is daarmee het doelwit van tal van controles en regelgeving 5 punten. Of het aan de laatste of onderdelen van deze processen, wanneer men blijkt vertoont, zal het vastgestelde evenwicht in de cel verstoren en aldus kunnen leiden tot pathologische condigen. In deze context hebben mutaties in vertaling factoren die betrokken zijn geweest bij verschillende aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen zoals `leuko-encefalopathie met vanishing white matter' (eIF2B1-5 subunit) 6, in Walcott-Rallison syndroom (EIF2AK3 gen dat codeert voor PERK) 7, potentieel in ziekte van Parkinson (eIF4G1 p.R1205H) 8. Het is daarom belangrijk om cellulaire en moleculaire studies van deze mutante proteïnen voeren om onze kennis te vergroten op ontwikkeling van de ziekte en de algemene werkwijze van translatie initiatie.

Om deze studies uit te voeren, is het noodzakelijk om de meest geschikte modellen kiezen om de gevolgen van deze mutaties in acht Xenopus laevis oöcyten zijn bijzonder geschikt vanwege hun fysiologische en biochemische eigenschappen. Fysiologische synchroniciteit (geblokkeerd in fase G2 van de celcyclus) , hoge capaciteit van de eiwitsynthese (200-400 ng / dag / eicel), hoog aantal gewonnen OOCYtes uit hetzelfde dier (800-1000 eicellen / vrouw) en de grootte cel (1,2-1,4 mm diameter), die hun manipulatie vergemakkelijkt. Micro-injectie van Xenopus oöcyten met gesynthetiseerde mRNA kan gemakkelijk worden uitgevoerd om vertalingsstappen ontleden. In deze visie presenteert andere voordelen. Gezien de snelheid van de meiose en progressie van de vertaling na mRNA micro-injectie (~ 24 uur), Xenopus eicel is een snel systeem in vergelijking met opgeloste cellulaire systemen (gewonnen uit E. coli, tarwekiemen of konijn reticulocyten ...) waarin een mRNA is vertaald met een verminderde vertaling tarief en op een lagere snelheid. Zo zullen de effecten van een mutatie geïntroduceerd in een mRNA snel en gemakkelijk waarneembaar bestudeerd in verschillende oöcyten. Een ander voordeel van Xenopus oöcyten is dat moeders mRNA's zijn latent en eiwit vertaling wordt geblokkeerd voordat progesteron stimulatie. Toevoeging van progesteron is dus een goede manier van reguleren van de translatie inductie. Cytoplasmatische polyadenylation niet optreden tijdens oögenese. Het begint tijdens maturatie van progesteron-gestimuleerde oöcyten in een tijdsvolgorde en blijft gedurende de vroege ontwikkeling en kan worden gebruikt om de verschillende stappen van taalstudie.

De polyadenylatie van mos mRNA is een van de eerste die zich voordoen en het behoort met Aurora A / EG2, Histon-Like B4 mRNA tot de klasse van de "vroege rijping" genen, zoals gedefinieerd in Charlesworth et al. (2004) 9. De translationele inductie van "late" mRNA zoals Cycline A1 en cycline B1 optreedt ten tijde van germinal vesicle afbraak (GVBD). Mos mRNA codeert voor een serine / threonine-proteïne kinase. De vertaling is van cruciaal belang, omdat het leidt tot het MAP-kinase cascade die indirect activeert de eicel rijping. Inderdaad, in reactie op progesteron, polyadenylatie van mos mRNA versterkt via werkwijzen waarbij Aurora A / EG2 regulerende eiwitten en andere RNA-bindende eiwitten met the 3'UTR van mos mRNA. Deze verhoogde polyadenylatie van mRNA mos leidt tot een toename van mos eiwitgehalte, dat op zijn beurt activeert MEK1. Dit proces medieert de activering van het extracellulaire signalen gereguleerde kinase 2 (ERK2) (Figuur 1). Deze signalerende cascade kan dan leiden tot de maturatie M-fase-bevorderende factoren, een complex gevormd door Cycline B Cdc2 kinase, en resulteert uiteindelijk in meiotische hervatting.

Daarom in Xenopus laevis oocyten, kan het onderzoek van maternale mRNA zoals mos gemakkelijk worden gebruikt om de vertaalbaarheid testen met verscheidene eindpunten van de efficiënte polyadenylatie translatie van verscheidene MOS signaleringscomponenten, waaronder ook het bepalen van de GVBD rate. Dit systeem is dus interessant om de eerste gevolgen van mutaties in translatie initiatie elementen te beoordelen zonder tussenkomst van nieuw getranscribeerde mRNA of transfectie efficiëntie problemen vaak optreedt bij eukaryotic cel studies.

Hier wordt een protocol opgesteld waarin eIF4G1 mutant mRNA's micro-injectie in Xenopus laevis oocyten De vertaling van maternale mRNA getest. In de aanwezigheid van een defect in GVBD progressie, MOS mRNA polyadenylatie die essentieel is voor voortgang door de oöcyt meiose celcyclus en de daaropvolgende omzetting van de vroege en late klasse mRNA wordt vastgesteld. De fosforylatie Aurora A / EG2 en ERK is eveneens bestudeerd om de gevolgen van mos deregulation.Thus bevestigen Xenopus oöcyten vormen een eenvoudige manier om verschillende stappen van mRNA translatie te analyseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle Xenopus experimenten werden uitgevoerd op het dier faciliteit van de Lille 1 universiteit volgens de regels van de richtsnoeren van de Europese Gemeenschap van de Raad (86/609 / EEG) voor laboratorium dierproeven. Het dier protocol werd goedgekeurd door de lokale institutionele review board (Comité d'Ethique en Experimenteren Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).

1. Eicel Handling

  1. Bereid de verdoving oplossing: los 1 g tricaïne methaansulfonaat poeder in een 1 liter steriel water.
  2. Plunge vrouwelijke Xenopus laevis in deze oplossing, hebben betrekking op de beker om ontsnapping te voorkomen en te wachten ongeveer 45 minuten voor het dier volledig verdoofd te worden (zonder enige reactie op een been knijpen).
  3. Was de kikker met zeep en spoel af met leidingwater en plaats het dier op zijn rug op schone aluminiumfolie.
  4. Klem de huid van de zijkant van de buik en de eierstokken niveau tang.Maak een incisie van ongeveer 1 cm met een schaar vooraf gereinigd met ethanol 70%. Zorg ervoor dat het deel diep genoeg is en de onderliggende buikwand excisie van ovariële weefsel waarin meerdere eicellen in verschillende stadia van ontwikkeling bevinden kon plaatsvinden.
  5. Ontleden eierstok lobben, was ze 4 keer in een petrischaal (50 mm) met een ND96 medium (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,4 met NaOH, aangevuld met 50 ug / ml streptomycine / penicilline, 225 ug / ml natriumpyruvaat, 30 pg / ml sojaboontrypsineremmer, 1 ul / ml tetracycline) om alle sporen van bloed en vuil te verwijderen.
    Opmerking: Tetracycline kan een optimaal behoud en een goed herstel na micro-injectie behandeling.
  6. Bewaar ze in een overdekte petrischaal ondergedompeld in het medium bij 14 ° C, waardoor de bewaring voor een week.
  7. Steek de buikwand en de huid met dierenarts absorbeerbare thread en een hechten naald (3 of 4 hechtingen nodig zal zijn).
  8. Plaats het dier in een bekerglas zonder water en vochtiger de huid met kraanwater totdat de kikker weer beweegt. Dek het bekerglas om ontsnapping te voorkomen.
  9. Scheid voorzichtig de eierstok lobben in het medium in groepen van 5-10 oöcyten met 2 paren pincetten onder een stereomicroscoop met een 10-voudige vergroting. Kies eicellen in fase VI. Ze kunnen worden herkend door i) hun vorm en kleur met een bruine gepigmenteerde animale pool en gele vegetatieve paal gescheiden door een duidelijke band ii) de grootte beter dan 1,2 mm in diameter 10.
  10. Incubeer de geselecteerde eicellen in een collagenase oplossing (1 mg / ml collagenase A van Clostridium histolyticum, opgelost in ND96 zonder tetracycline) in een petrischaal onder voorzichtig roeren gedurende 45 min aan de eicel defolliculation vergemakkelijken (collagenase verteert oöcyt / folliculaire verbindingen). Spoel de eicellen 3 of 4 maal met ND96 medium bij 14 bewaard° C.
    Let op: niet de eicellen minder of meer dan 45 min vanwege het risico van de eicel oppervlakte-eiwitten te vernietigen en het veroorzaken van een slechte levensvatbaarheid uitbroeden. Collagenase behandeling kan spontaan GVBD induceren.
  11. Incubeer eicellen in het medium voor 3-4 uur. Verwijder folliculaire cellen met fijne pincet onder verrekijker vergrootglas en houd ze bij 19 ° C in ND96 medium.

2. Bereiding van mRNA synthese

  1. Lineariseren 5 pg van de volgende plasmiden door enzymatische digestie behulp Pmel enzym.
    OPMERKING: pcDNA6.2 / V5-DEST met daarin een 1599 aminozuren eIF4G1 cDNA wild-type (eIF4G1-WT, NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST daarin een eIF4G1 dominant negatieve cDNA (eIF4G1-DN) met mutaties c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - en c.2126T> G regio interactie tussen eIF4G1 en eIF4E op positie 612-618 van de overeenkomstige proteïne storen interactie betwenl eIF4G1 en eIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP bevatten chlooramfenicolacetyltransferase (GFP). Bereid 2 mengsels van elk van de plasmiden 3: namelijk enerzijds Pmel enzym en de tweede zonder enzym als controle.
  2. Precipiteren van plasmide-DNA met een klassieke procedure ethanol en opnieuw in suspensie in 20 ul nuclease-vrij H2O
  3. Bepaal de concentratie met behulp van een spectrofotometer. De concentratie moet superieur aan 150 ng / ul transcriberen cRNA.
  4. Run 1 pl monsters en hun controles met 5 gl laadbuffer op een 0,8% agarose gel om het plasmide linearisatie controleren.
  5. Gebruik van een kit voor in vitro transcriptie en cRNA zuivering volgens de instructies van de fabrikant. De getranscribeerde cRNA worden opnieuw gesuspendeerd in 20 ul nuclease-vrij H2O Monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C indien nodig.
  6. Bereid de 10X MOPS migratie buffer met 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM natriumacetaat en 10 mM EDTA (pH 8,0). Steriliseer oplossing met een 0,45 urn filter. Voorraad van de oplossing beschermd tegen het licht aan RT oplossing oxidatie te voorkomen.
  7. Reinig de elektroforese tank achtereenvolgens met NaOH, HCl en grondig gespoeld met dubbel gefilterd water voor een O / N om RNase te vermijden en te voorkomen dat RNA degradatie.
  8. Zet een 1,5% agarosegel met MOPS en formaldehyde. Warm tot volledige agarose oplossing en laat het afkoelen tot 55 ° C. Onder zuurkast, voeg 0,1 volume van 10X MOPS, 6,6% formaldehyde en 4 ug ethidiumbromide (10 mg / ml). Giet de gel onder de zuurkast en wacht ongeveer 1 uur voor de gel uit te harden.
    Opmerking: Formaldehyde en ethidiumbromide zijn giftig.
  9. Bereid monsters voor migratie in een 0,2 ml buis met 1 pl cRNA, 8,8% formaldehyde, 60% formamide en 0,1 volume van 10X MOPS. Incubeer 3 min bij 70 ° C en zet de buizen op ijs gedurende 10 min. Centrifuge monsters enkele seconden op5000 x g. Voeg 2 pl gelbeladingsbuffer.
    Opmerking: Formamide is giftig.
  10. Run monsters gedurende 20 minuten bij 90V. Week de gel in nuclease-vrij H 2 OO / N om de gel destain voordat analyseren aan de cRNA kwaliteit te controleren.
  11. Bepaal cRNA concentratie met behulp van een spectrofotometer en bewaar ze bij -80 ° C.

3. Micro-injectie gesynthetiseerde RNA en Eicellen rijping Stimulatie

  1. Bereid de benodigde apparatuur voor eicellen micro-injectie. Gebruik een micropipet trekker om kleine glazen capillaire trekken. Onder stereomicroscoop, breek het uiteinde van de capillair met de pincet om een ​​stomp uiteinde te maken. Vul het capillair micropipet met minerale olie met behulp van een injectiespuit 1 ml met een Millipore 0,45 urn filter aan het tegenoverliggende uiteinde. Monteer de micropipet op de micro-injectie pipet. Kies een accurate micropipet gekalibreerd door de fabrikant om een ​​goede nauwkeurigheid te geven in combinatie met de juiste glazen capillaire.
  2. Voer microinjectie 1-2 uur na defolliculation noodzakelijk vertraging eicel terugwinning van oöcyten bij 14 ° C gehouden. Gebruik Petri gerechten met de bodem geschraapt met een tang op een zelfklevende oppervlak voor eicellen te creëren en vul ze met ND96 medium.
  3. Regelen oöcyten langs een geschraapt laan in een petrischaal zodat een opeenvolgende injectie van oöcyten met de capillaire micropipet onder een hoek van 45 ° C.
  4. Injecteer in de eicel equatoriale zone onder het gepigmenteerde dier gebied voor een optimale verspreiding van monsters in het cytoplasma. Steek alleen het dunste deel van capillaire tip over ongeveer 150-200 urn van diepte.
  5. Injecteer 30 ng cRNA respectievelijk verkregen uit de verschillende plasmiden in een volume van 60 nl in een eerste eicel. Na injectie, wacht 5-10 seconden voordat u de capillaire tip om het monster te ontsnappen (Figuur 2A) te vermijden.
    Opmerking: Niet meer dan 120 nl. Injecteren zo langzaam als je kunt. Een regeling met gedestilleerd water aanbevolen.
  6. Verplaats handmatig de petrischaal naar de volgende eicel te injecteren.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de punt niet verstopt is door het genereren van een kleine puls uit het bad oplossing na 2-3 micro-injecties.
  7. Transfer geïnjecteerde eicellen in 24 wells kweekplaten (10 eicellen / putje) gevuld met 3 ml vers medium ND96 en laat ze bij 19 ° C.
  8. Incubeer de eicellen in ND96 met progesteron (PG) (2 ug / ml) tot meiotische rijping (GVBD) veroorzaken bij 19 ° C, 15 uur of 4 uur na micro-injectie van gepolyadenyleerde cRNA's respectievelijk verkregen uit pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 en pcDNA6 0,2 / C-EmGFP gebruikt als controle (figuur 2A).
    Opmerking: Co-injectie van fluorescente merker met cRNA is een handig hulpmiddel opdat de cRNA werd geïnjecteerd en bleef in de eicel. Het uitvoeren van een dergelijke voorlopige experimenten met behulp van een cRNA van belang met een GFP-tag.
  9. Microinject volgens # 3,5 verschillende verhoudingen (1: 3, 2: 2, 3: 1) van gepolyadenyleerde eIF4G1-WT en eIF4G1 DN-cRNA's om Tést het translatie-effect van eIF4G1-WT cRNA op de mutant fenotype (Figuur 2D).

4. Germinal Vesicle Breakdown Bepaling

  1. Tel het aantal rijpe oöcyten PG na stimulatie door het observeren van de aanwezigheid van een witte vlek op zwart dier paal met een stereomicroscoop. Herhaal het tellen elk uur tot vierentwintig uur (Figuur 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Analyse

  1. Homogeniseer de groep van 10 eicellen per heen en weer bewegingen met een micropipet tip, bij 4 ° C in 200 gl in de volgende buffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg / ml runderserumalbumine, 10 mg / ml leupeptine, 10 mg / ml aprotinine, 10 mg / ml sojaboon trypsine inhibitor, 10 mg / ml benzamidine, 1 mM PMSF, 1 mM natriumvanadaat.
  2. Centrifugeer monsters 15 min bij 10.000 xg het lipide (bovenste fase) en het membraan (onderste fase) f verwijderractions. Verzamel de cytoplasmatische fractie, slaan een hoeveelheid aan eiwitconcentratie te bepalen en voltooi de resterende met Laemmli of Bis-Tris-monsterbuffer (1: 1).
    Opmerking: Bis-Tris gels en beladingsbuffer een meer neutrale pH dat eiwitten beschermt tegen hydrolyse
  3. Verwarm 20 ug monster bij 95 ° C gedurende 10 min. Plaats elk monster in de putjes van de acrylamide gel. Plaats de gel in een tank met geschikte buffer.
  4. Uitvoeren van een elektroforese gedurende 1 uur bij 200 V.
  5. Realiseer een WB in TBS pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, bevattende 10% runderserumalbumine) met een geit anti-Aurora A / EG2 (1: 3000, 2 uur) of met een konijn anti -Aurora A / EG2-P (1: 1000, O / N bij 4 ° C), muis anti-ERK2 (1: 3000, 2 uur), geit anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 hr ), konijn anti-mos (1: 5000, 4 uur), konijn anti-GFP (1: 3000, 2 uur) antibodies.Use antilichamen muizen anti-V5 (1: 10.000, 2 uur) en konijn anti-Rsk (1 : 1000, 2 uur) (het laden controles).
  6. Wassenhet membraan 3 maal gedurende 10 minuten in TBS-Tween en incubeer 1 uur met ofwel een anti-muis of anti-konijn of anti-geit (IgM) mierikswortel-peroxidase gemerkt secundair antilichaam bij verdunningen van 1: 5000, 1: 7500 en 1 : 5000 respectievelijk.
  7. Het uitvoeren van 3 wasbeurten van 10 min in TBS-Tween en opsporen van het antigeen-antilichamen complexen met de Advanced ECL Detection systeem.

6. Polyadenylatie Assay

  1. Steekproef 5 eicellen per aandoening in een 1,5 ml. Was ze met 1 ml Nuclease-vrij PBS 1X (pH 7,4). De volgende stappen zullen worden gemaakt onder zuurkast.
  2. Extraheren RNA met behulp van een klassieke biologische procedure (zie de instructies van de fabrikant).
  3. Herstel RNA door centrifugatie (10.000 x g) gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en de lucht drogen RNA gedurende 10 min.
  4. Resuspendeer RNA pellet in 30 ul nuclease-vrij H2O
  5. Neem 15 pi van de monsters in een nieuwe buis en voeg 85 ul Nuclease-vrij H 2 O. Het schoonmaken van dese monsters om hun kwaliteit te verbeteren silica kolom volgens de instructies van de fabrikant. Elueer het RNA via 30 ul nuclease-vrij H2O
  6. Run 1 ui monsters met 5 gl laadbuffer op een 0,8% agarose gel om het RNA integriteit controleren.
  7. Bepaal de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
  8. Bereid 2 ligatiemengsels per conditie (dwz eIF4G1-WT, eIF4G1-DN en H 2 O controle) met de volgende reagentia: 10 U RNA-ligase, 0,1 volume van 10X buffer, 1 mM ATP, 10% van PEG8000 50% , 0,1 ug primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3) 11 en breng het uiteindelijke volume op 10 ui met Nuclease-vrij H2O Voeg in de eerste mengsel RNA verkregen uit oöcyten zonder PG stimulatie en in het tweede mengsel RNA verkregen uit gestimuleerde PG oöcyten.
  9. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C daarna gedurende 20 minuten bij 65 ° C om het enzym te inactiveren.
  10. Onsea cDNA reverse transcriptie (RT) kit. Bereid de RT mengsel per buis: 0,1 volume 10X RT buffer, 0,1 ug primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP mengsel, 50 U van reverse transcriptase en compleet met Nuclease-vrij H 2 O tot de uiteindelijke volume van 10 pl. Voeg 10 ul van ligatiereactie eerder verkregen. Voer de kamertemperatuur onder door de fabrikant beschreven omstandigheden.
  11. Bereid Polymerase Chain Reaction (PCR) mengsel per buis: 0,1 volume buffer 10X, 1,5 mM MgCl2, 133 uM dNTP mengsel, 0,2 pM specifieke primer, 0,2 uM primer P2, 0,025 U Taq polymerase, 1 ui cDNA en voorzien nuclease-vrij H2O eindvolume van 50 pl. Voer de PCR onder de volgende omstandigheden: 50 ° C gedurende 2 min, 95 ° C gedurende 10 min, [95 ° C gedurende 1 min, 56 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 30 sec] * 40 cycli, 72 ° C gedurende 10 min 9. De specifieke primers zijn: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon-achtige B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cycline A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cycline B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
  12. Bereid een 3% agarosegel. Voeg in elke PCR producten 10 gl laadbuffer. Voer de gel met 10 pl monsters bij 110 V voor een optimale migratie. Analyse van de gel na 10 en 20 minuten om een ​​verandering van maat die de lengte van de staart poly (A) RNA en daarmee de rijping hetgeen een eerste vereiste voor de vertaling observeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kinetische rijping van Xenopus oöcyten en de bepaling van het percentage eicel GVBD na 24 uur van de PG stimulatie (Figuren 2B, 2C):

Om de gevolgen van het translationele eIF4G1-DN mutatie studie, de reactie op PG in Xenopus laevis oocyten micro-geïnjecteerd met cRNA eIF4G1-DN vergeleken met eIF4G1-WT en andere controle omstandigheden (H 2 O, GFP). De controles mogelijk om de incidentie van oöcyt micro-injectie beoordelen ongeacht de aar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vertaling is een mechanisme betrokken bij de pathofysiologie van talrijke humane ziekten waaronder verscheidene neurodegeneratieve ziekten. Bijvoorbeeld in de ziekte van Parkinson verschillende rapporten stelde de bijzondere waardevermindering in de vertaling in verband met erfelijke mutaties 8,12,13.

Verschillende cellulaire modellen zijn beschikbaar voor taalstudie. Hier, teneinde de translatie gevolgen van een mutatie in eIF4G1 dat als dominant negatieve mutatie verminderen van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van INSERM, de Universiteit van Lille 1, de Universiteit van Lille 2, Regionaal Ziekenhuiscentrum van Lille (CHR de Lille). MCCH erkent de steun van de Fondation de France en wil IRCL, Pr. Sonenberg bedanken voor de gift van de V5-plasmiden, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) voor de gift van anti-GFP-antilichamen, UMS 3387 (Universiteit van Rennes) waar Xenopus eicellen worden gekocht en Dr Taymans (JPArc, Lille) voor het kritisch lezen van de manuscripttekst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tricaine methane sulphonateSandozMS-222oocytes handling
ForcepsMoriaDumont MC40
Streptomycin/penicillinSigma781
Sodium pyruvateSigmaP2256
Soybean trypsin inhibitorSigmaT9128
TetracyclinSigmaT7660
Veterinarian absorbable Vicryl threadJohnson&Johson IntlJV1205
Collagenase ARoche diagnostics10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SPreparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2OLife Technologies10977
Sodium AcetateMerck6268
Absolute ethanolSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/mlLife Technologies15585-011
mMESSAGE mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
Formaldehyde 37%Merck1.04003.1000
FormamideFluka47671
Gel Doc ImagerBiorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass CapillariesDrummond Scientific Company3-000-510-Xmicroinjection
Replacement Glass 8"Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0.45 µm filterMilliporeSLHA025NB
ProgesteroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Bovine serum albuminSigmaA4612
leupeptinSigmaL8511
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
sodium vanadateSigmaS6508
Laemmli bufferBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 wellLife TechnologiesNP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGXBiorad456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting systemW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL MembraneAmersham Life Science10401180
MethanolVWR20846-292
Ponceau Red (0.5%)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Santa Cruz Biotechnologysc-27884
anti-Eg2-PCell SignalingC39D8
anti-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anti-RskSanta Cruz Biotechnologysc-231
anti-mosSanta Cruz Biotechnologysc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2378
Advanced ECL Detection SystemAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)Qiagen79306
ChloroformSigma31998-8
IsopropanolSigma278475-1L
RNeasy mini kitQiagen74106
RTL buffer Qiagen79216
RNAse free DNAse setQiagen79254
PrimersEurogentec
T4 RNA ligase 1 New England BiolabsM0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kitApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Taq polymeraseLife Technologies10342020

Referenties

  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
  3. Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
  4. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
  5. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  6. Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
  7. Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
  8. Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
  9. Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
  10. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
  11. Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
  12. Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
  13. Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
  14. Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
  15. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449(2012).
  16. Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
  17. Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
  18. Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
  19. Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
  20. Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
  21. Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
  22. Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
  23. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  24. Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138(2013).
  25. Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
  26. Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Translatie-initiatieoocytenrijpingafbraak van de kiemblaasjeWestern blotmRNA-polyadenyleringMos-signaleringscascadeprogesteronstimulatieeIF4G1-mutatiecapillaire micro-injectie
Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.