Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Samenvatting

We ontwikkelden een gen-chimerische voorbereiding van de ventrale hippocampale - accumbens-circuit in vitro die direct live beeldvorming mogelijk maakt om presynaptische mechanismen van nicotinische acetylcholine receptoren (nAChR's) gemedieerde synaptische transmissie te analyseren. Deze voorbereiding biedt ook een informatieve aanpak om de pre- en post-sygnatische mechanismen van synaptische plasticiteit te bestuderen.

Samenvatting

Aanhoudende verbetering van axonale signalering en verhoogde neurotransmitterafgifte door de activering van presynaptische nicotinerge acetylcholinereceptoren (nAChR's) is een belangrijk mechanisme voor neuromodulatie door acetylcholine (ACh). De moeilijkheid met toegang tot het onderzoeken van de signaalmechanismen binnen intacte axonen en op zenuwuiteinden zowel in vitro als in vivo heeft de voortgang in de studie van de presynaptische componenten van synaptische plasticiteit beperkt. Hier introduceren we een gen-chimère bereiding van ventrale hippocampale (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro die directe live beeldvorming mogelijk maakt om zowel de pre- als postsynaptische componenten van transmissie te analyseren terwijl selectief de genetische profielen van de pre- versus postsynaptische neuronen worden gevarieerd. We demonstreren dat projecties van vHipp-microslices, als presynaptische axonale input, meerdere, betrouwbare glutamaterge synapsen vormen met postsynaptische doelen, de verspreide neuronen uit nAcc. De presynaptische lokalisatie van verschillende subtypes van nAChR's wordt gedetecteerd en de presynaptische nicotinerge signaaloverdracht gemedieerde synaptische transmissie wordt gemonitord door gelijktijdige elektrofysiologische registratie en live celbeeldvorming. Deze bereiding biedt ook een informatieve aanpak om de pre- en postsynaptische mechanismen van glutamaterge synaptische plasticiteit in vitro te bestuderen.

Inleiding

Cholinerge modulatie circuit exciteerbaarheid bij aan fundamentele aspecten van cognitie en veranderde cholinerge modulatie is een kenmerk van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische stoornissen, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, schizofrenie en verslaving ^1-4. Een gevestigde mechanisme cholinerge vergemakkelijking van synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel is via directe activatie van nAChRs gelokaliseerd op pre-synaptische plaatsen. Activatie van deze pre-synaptische receptoren leidt tot intracellulaire Ca2 ⁺ ([Ca2 ^+] _i) in presynaptische terminals verhoogd - zowel direct, door de relatief hoge geleiding door calcium bepaalde nAChR subtypes en indirect via intracellulaire signalering cascades ^5, en zodoende neurotransmitter release. In feite is de activatie van presynaptische nAChRs in verband met veranderingen in afgifte van diverse neurotransmitters zoals glutamaat, GABA, ACh, eennd dopamine ^6-10. Hoewel deze werkwijze is onderzocht Indirect door elektrofysiologische werkwijzen op diverse synapsen, optische reporters van [Ca2 ^+] _i en synaptische vesicles recycling mogelijk directer en tijdelijk nauwkeurige meting van presynaptische verschijnselen.

Pre-synaptische lokalisatie van nAChRs is overtuigend aangetoond met directe immuno-goud etikettering van nAChRs bij het ​​elektron microscopische (EM) niveau ^11,12. Verscheidene andere technieken zijn ook gebruikt voor de nAChR lokalisatie indirect pakken, onder detectielocaties van nAChRs subunit- fluorescerend eiwit chimaera in gekweekte neuronen ^13,14, elektrofysiologische registratie van nAChR stromen in synaptische terminals ^15,16, bewaken nicotine geïnduceerde veranderingen in [Ca ^2+] _i in synaptische zenuwuiteinden door live cell imaging ^17, en indirecte controle van de neurotransmitters in de synaptische terminal doorlive cell imaging technieken fluorescente indicatoren, waaronder exocytose van synaptische blaasjes bekeken styrylkleurstoffen amfipatische FM kleurstoffen (FM1-43 en FM4-64) en / of synapto-pHluorin en specifieke neurotransmitter fluorescente reporters, zoals CNiFERs van ACh en iGluSnFr voor glutamaat ^18-20. Kortom, deze de huidige benaderingen voor de identificatie van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs zijn ingewikkeld en vereisen speciale systemen en technieken voor betrouwbare identificatie en fysiologische bewaking van pre-synaptische activiteit mogelijk.

Hier beschrijven we protocollen en apparatuur voor een in vitro co-kweeksysteem van een ventrale hippocampus (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) schakeling die directe toegang tot het identificeren en zowel pre- en postsynaptische elementen van synaptische transmissie analyse verschaft. We tonen voorbeelden van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs en de live-cell imaging van nAChR gemedieerde Ca ²⁺ signalering en neurotransmitter vrijlating along vHipp axonen. Een natuurlijke (en eenvoudige) uitbreiding van het protocol hier gepresenteerde is de bereiding van pre- en post-synaptische contacten omvat neuronen van verschillende genotypen. Op deze wijze wordt de bijdrage van een bepaald genproduct aan de pre- en / of postsynaptische mechanismen van modulatie kan direct worden bepaald.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren uitgevoerd (NIH Publications No. 80-23, herzien 2012) en studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en te gebruiken voor onderzoek Commissies bij Stony Brook University (# 1618 en # 1792).

1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturen

1. Offer muizen (postnatale dag 0-3, van wild-type (WT) of α7 nAChRs transgene muis lijn) met CO _2. Onthoofden elke pup en sla de staart in een 1,5 ml centrifugebuis voor post facto genotypering. Voer de volgende stappen in een gesteriliseerde kap.
2. Verwijder de bovenkant van de schedel met een schaar en forceps de gehele hersenen bloot. Vanaf het moment waar de cerebrale cortex gedeelte van elkaar caudaal, het verkrijgen van een coronale sectie die het achterste cortex inclusief de vHipp ^5,21 onder een dissectie microscoop bevat.
3. Ontleden vHipp weefsel stroken met het CA1-subiculum regio volgens een ontwikkeling van de hersenen van muizen atlas ²² (Figuur 1A). Transfer naar een 35 mm cultuur schotel met koude cultuur media (4 ° C), snijd ze in kleine dunne plakjes (ongeveer 100 micrometer x 100 micrometer microslices).
4. Pre-incubeer 12 mm poly-D-lysine / laminine beklede dekglaasjes in 24 well weefselkweek platen met kweekmedium (~ 500 ul) gedurende ten minste 30 min in de incubator bij 37 ° C. Verwijder media voordat plating microslices.
5. Plaat met een vuur gepolijste Pasteur pipet in het midden van het dekglaasje met een minimale hoeveelheid medium (~ 50 pi gemaakt met ~ 20 stuks microslices) voor bevestiging van de explantaten vergemakkelijken. Plate vHipp microslices afkomstig van een enkel dier (ofwel de + / + of - / - genotype van de transgene α7 lijn) op elke dekglaasje.
6. Na de explantaten vestigen op de dekglaasje, zachtjes toe te voegen extra media (~ 100 pi) door The wand zodat het niveau van het materiaal hoog genoeg is om volledig te bedekken de explantaten op de periferie, maar niet die in het midden van het dekglaasje.
7. Na een O / N incubatie bij 37 ° C, 5% CO _2-incubator, dispergeren NACC neuronen uit embryonale dag 18 tot postnatale dag 1 WT-muizen en aan de explantaten.
   1. Ontleden NACC weefsels volgens een zich ontwikkelende hersenen van muizen atlas ²⁰ (Figuur 1B).
   2. In kleine stukjes gesneden (ongeveer 500 pm × 500 micrometer microslices) en transfer naar een 15 ml buis.
   3. Behandel met 0,25% trypsine (2 ml) gedurende 15 min bij 37 ° C. Wash weefsel brokken driemaal wassen met koud medium (5 ml, 4 ° C), gevolgd door een wassing in koud kweekmedium (5 ml, 4 ° C). Laat schorsing te rusten voor 5 min in elke wasbeurt stap, en giet af supernatant zorgvuldig.
   4. Distantiëren cellen door zachte trituratie in 2 ml van de cultuur media met een licht-vuur gepolijste Pasteur pipet.
   5. Transfer celsuspensie aan een andere 15 ml buis en centrifugeer bij 2000 x rpm gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedia op 1 ml per 6 pups. Verspreiden cellen door voorzichtig pipetteren in de media meerdere malen met een vuur gepolijste Pasteur pipet.
   6. Voeg 0,25 ml van verspreide NACC cellen om elke dekglaasje met vHipp explantaten.
   7. Handhaaf de kweken in een bevochtigde 37 ° C, 5% _CO2 incubator. Plaats de cultuur platen op bevochtigde steriele gaasjes mechanisch stabiliseren en luchtvochtigheid te behouden, het vergemakkelijken van synapsvorming.

2. Immunocytochemie

1. Fix kweken (5-7 dagen in vitro) in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 20 min, RT).
2. Permeabilize kweken met 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 5 min, kamertemperatuur).
3. Block kweken met 10% normaal donkey serum in PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 30 min, RT) voordat Antibody kleuring. Incubeer met primaire antilichamen O / N bij 4 ° C. Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-nAChRs (α ₄ -ECD 1: 500, anti-α ₅ subunits, 1: 500), anti-vesiculaire glutamaat transporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
4. Was de primaire antilichamen met PBS (3 keer / ~ 500 ul per dekglaasje, 5 min) en vervolgens incubeer culturen in secundaire antilichamen geconjugeerd met Alexa 488 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 500) of Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje , 1: 500) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
5. Incubeer culturen αBgTx geconjugeerd met Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 1000 in cultuurmedia) gedurende 45 min bij 37 ° C voorafgaand aan fixatie etiketteren oppervlak α7 * nAChRs.
6. Mount en seal dekglaasjes.
7. Beelden vastleggen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met Plan-Apochromat doelstellingen (20X met 0,8 NA of 63x olie met 1.4 NA) en een CCD-camera.

3. FM1-43 Based Vesicular Fusion

1. Handhaving van culturen (5-7 dagen in vitro) in een imaging kamer, monteren de kamer op de draaiende schijf confocale microscoop. Continu perfuseren (1 ml / min) met HBS cocktail bij RT.
2. Stop perfusie en belasting culturen met 10 uM FM1-43 in 56 mM K ⁺ ACSF (~ 500 ul) gedurende 90 sec (vlekken), wassen externe kleurstof weg gedurende 15 minuten met Ca ²⁺ vrije HBS met ADVASEP-7 (0,1 mM) naar membraangebonden FM1-43 vangen.
3. Stimuleren van de kweken met 56 mM K ⁺ ACSF (~ 500 ul) zonder FM1-43 voor 120 sec (ontkleuren), herladen kweken met FM1-43 onder dezelfde omstandigheden en nawassen met Ca2 ⁺ vrij HBS bevattende ADVASEP-7 voor 15 min.
4. Acquire FM1-43 fluorescentie beelden met draaiende schijf confocale microscoop voorzien van een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en foto's maken met een CCD-camera.
5. Verzamel basislijn FM1-43 fluorescentiebeelden (elke 2 s gedurende 1 min) Als pre-nicotine control; toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen nicotine met HBS cocktail. Houd capture time-lapse beelden voor, tijdens en na de nicotine toepassing elke 2 seconden voor 5 min.
6. Kwantificeren FM1-43 fluorescentie-intensiteit vóór (F _vlekken) en na (F _ontkleuren) nicotine toepassing op elke synaptische Bouton.
7. Bereken totale bedrag van afgeefbare FM1-43 fluorescentie langs vHipp axonen door het kwantificeren van het verschil van FM1-43 fluorescentie-intensiteit voor en na nicotine applicatie (AF = F _vlekken -F _ontkleuren). Analyseer fractie van de fluorescentie-intensiteit dalen na nicotine de volgende vergelijking: F = _afname% AF / F _kleuring.

4. Calcium Imaging

1. Snel - (7 dagen in vitro 5) met een normale HBS, laad dan culturen met 5 pM Fluo-4 Ca ²⁺ indicator (Spoel culturenAM ester) en 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO _2.
2. Spoel de Fluo-4-oplossing met HBS (3 keer / 5 min). Terug culturen incubator (37 ° C / 5% CO ₂₎ gedurende ten minste 30 min.
3. Handhaving van culturen in dezelfde beeldvorming kamer en dezelfde voorwaarden als beschreven in FM1-43 gebaseerd vesiculaire fusie sectie (zie stap 3.1).
4. Verzamel Fluo-4 fluorescentie beelden van axonale projecties van de vHipp micro-schijfjes met een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en een CCD-camera.
5. Verzamel basislijn Fluo-4 fluorescentiebeelden (om de 10 seconden gedurende 2 min) als pre-nicotine control toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen met HBS nicotine cocktail. Blijf capture time-lapse beelden voor, tijdens en na nicotine gebruik elke 10 sec gedurende 30 minuten.
6. Bewaar alle frames van de ruwe fluo-4 fluorescentie beelden, export als een reeks vanAfbeeldingen TIFF-formaat voor verdere analyse.
7. Verzamel de geïntegreerde intensiteit van fluo-4 fluorescentie langs vHipp axonen voor en na nicotine applicatie.
8. Normaliseren geïntegreerde fluorescentie-intensiteit met de volgende vergelijking: AF / F = ₀ (FF ₀₎ / ₀ F, waarbij F ₀ is de achtergrond-gecorrigeerde pre-nicotine geïntegreerde fluorescentie-intensiteit en F de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit langs vHipp axons op elk tijdstip na nicotine applicatie. Analyseren en plot genormaliseerd geïntegreerde fluorescentie-intensiteit.

Resultaten

De voorbereiding dienst bestaat uit gen chimerische co-culturen van vHipp-NACC circuits in vitro. Projecties afkomstig van vHipp microslices, als pre-synaptische axonale input, kan synaptische contacten met postsynaptische targets, de verspreide neuronen van NACC te maken. Nicotine veroorzaakt een aanhoudende (≥ 30 min) faciliteren van glutamatergische overdracht van NACC neuronen geïnnerveerd door vHipp axonen ²¹ en langdurige calcium signalering langs vHipp axonen ⁵ via pre-synaptische α...

Discussie

De co-kweek bereiding beschreven re-capituleert ventrale hippocampus-accumbens circuits in vitro. Dit preparaat vergunningen betrekkelijk eenvoudige en betrouwbare behandeling van de ruimtelijke en temporele profielen waardoor activatie van presynaptische nAChRs wekken verhoogde glutamaterge transmissie ^{5, 21.}

Co-culturen worden gedefinieerd als de groei van verschillende specifieke celtypes in een gerecht die fysiologische omstandigheden kunnen verschaffen in vitro

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1. Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
2. washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
3. HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
5. Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM