Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Samenvatting

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Samenvatting

Het vermogen van cellen om te migreren is cruciaal diverse celfuncties levenslange uit embryonale ontwikkeling en wondheling tumor en kanker metastase. Ondanks intensieve onderzoeksinspanningen, de fundamentele biochemische en biofysische principes van celmigratie worden nog niet volledig begrepen, vooral in het fysiologisch relevante driedimensionale (3D) micro-omgevingen. Hier beschrijven we een in vitro assay ontwikkeld om kwantitatieve onderzoek van 3D celmigratie gedrag mogelijk. De methode maakt gebruik van de cel mechanosensing vermogen en de neiging om te migreren naar voorheen leegstaande extracellulaire matrix (ECM). We gebruiken de invasie van sterk invasieve borstkanker cellen, MDA-MB-231, collageen gels als modelsysteem. De verspreiding van de celpopulatie en de migratie dynamiek van individuele cellen over weken van de cultuur kan worden gecontroleerd met behulp van live-cell imaging en geanalyseerd om spatiotemporeel-opgelost gegevens te extraheren. BovendienDe werkwijze gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende extracellulaire matrices biedt dus een eenvoudige maar krachtige manier om de rol van biofysische factoren in het micromilieu op celmigratie te onderzoeken.

Inleiding

Migratie van cellen speelt een belangrijke rol in verscheidene fysiologische reacties zoals embryonale ontwikkeling, hemostase en immuunrespons en in pathologische processen zoals vaatziekten, ontstekingen en kanker ^1. Opheldering van de biochemische en biofysische oorzaken celmigratie derhalve fundamenteel belang niet alleen om de basisprincipes van cellulaire functies, maar ook voor verschillende biomedische toepassingen, zoals in weefselmanipulatie, anti-metastase en ontstekingsremmend ontwikkeling van geneesmiddelen bevorderen. Aangezien in vivo waarneming technisch uitdagend, heeft veel inspanningen gericht op de in vitro recapitulatie van celmigratie.

In vitro werkwijzen om celmigratie te onderzoeken grotendeels zijn ontworpen voor assays op tweedimensionale (2D) oppervlakken, met name de kras of wondgenezing assay ^2. Dergelijke tests bieden eenvoudige experimentele opstelling, eenvoudig live-cell imaging, en nuttige inzichten in verschillende biochemische mechanismen die ten grondslag liggen cel migratie. Echter, deze testen geen rekening met de extracellulaire matrix (ECM) architectuur en remodeling, die kritisch aspecten inzicht in vivo migratie. Onlangs is langzamerhand duidelijk zijn dat een 3D cultuurmodel, vaak op basis van collageen matrices ^3, een platform dat beter lijkt de in vivo situatie. Inderdaad cellen vertonen migratierichting dynamiek die verschilt van die van 2D oppervlakken, vooral door de verschillende dimensionaliteit van het milieu ^4. Bovendien, de biochemische en mechanische eigenschappen van de matrix gevoelig beïnvloeden celmigratie ^5, ook in het kader van tumorcel invasie ^6.

Hier presenteren we een methode om 3D celmigratie gedrag bestuderen ECM met biofysische eigenschappen die gemakkelijk afgewisseld met preparaat kan worden. De cellen zijngezaaid in een "innerlijke gel" en zijn toegestaan ​​om te ontsnappen in en binnen te vallen de aanvankelijk acellulaire "buitenste gel". De werkwijze berust op het vermogen van de cel om de aanwezigheid van herkennen en neiging tot migreren naar celvrije gebieden in de buitenste gel, die nauw verbonden cel mechanosensing ^7. In deze studie maken we gebruik van collageen netwerken als de ECM's binnengevallen door zeer invasieve borstkanker cellen, MD-MBA-231. De mechanische eigenschappen en de microstructuur van zowel de binnenste en buitenste gels kunnen worden afgesteld ⁸ en ^9, met het kenmerk fysiologisch relevante omstandigheden te bereiken. Reconstructie en analyse van de cel tracks staan ​​gedetailleerde kwantitatieve onderzoek van de tijdruimtelijk migratiegedrag zowel op populatieniveau en individuele cel niveau. Belangrijk is dat de opzet van het concentrische gel systeem bootst de in vivo weefsel topologie waarmee migrerende cellen, vooral binnendringende kankercellen, en biedt dus belangrijke inzichten inde fysische mechanismen van celmigratie en metastase.

Protocol

1. Cell Oogsten

1. Verkrijgen MD-MBA-231 cellen van de 37 ° C, 5% _CO2 incubator. Los cellen uit weefselkweek plaat met behulp van 0,5% trypsine-EDTA-oplossing. Gebruik 1 ml trypsine-EDTA oplossing cel gekweekt in een T25 fles.
2. Pellet cellen in een 15 ml conische buis door centrifugatie bij 200 x g gedurende 4 min, zuig de supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml kweekmedium.
3. Telling celdichtheid, ρ, met behulp van een hemocytometer.
   Opmerking: Om de cel geplaatste innerlijke gel te bereiden, zal de celsuspensie later worden verdund 10 × tot de laatste cel zaaien dichtheid te bereiken. Daarom is 10 x geconcentreerde celsuspensie vereist.
4. Bereken het volume medium vereist om een ​​10 x celconcentratie te bereiken:
   
   Opmerking: Een laatste cel zaaien dichtheid, c _finale, van ongeveer 215; 10 ⁶ cellen / ml wordt aanbevolen voor MD-MBA-231-cellen en wordt in dit protocol. Andere zaaien dichtheden kan ook worden onderzocht voor andere celtypen.
5. Pellet cellen één keer in een 15 ml conische buis door centrifugatie bij 200 x g gedurende 4 minuten en zuig de supernatant.
6. Resuspendeer de cellen in de vereiste hoeveelheid (V _medium berekend in stap 1.3) serumvrij celkweekmedium grondig cel klonteren minimaliseren.
   Opmerking: Fenolrood is auto-tl, en kunnen interfereren met fluorescentie / reflectie beeldvorming. Het gebruik van fenol-rood-vrij medium kan worden beschouwd als beste beeldkwaliteit.

2. Voorbereiding van Collageen Solutions

1. Haal de stock collageenoplossing, 10 x PBS buffer, Milli-Q H ₂ O, 0,1 M NaOH en enkele microcentrifugebuizen. Houd alle op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen, en steriele conditie te houden.
2. Equilibreer een steriele glas-onderste schaal door vooraf verwarmen op 37 ° C incubator.
   Opmerking: Alle volumes in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor een glazen bodem schotel met 12 mm goed. Als een ander type gerecht wordt gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen van de volumes.
3. Bereken het vereiste volume nodig 50 ui 2,4 mg / ml collageen te bereiden voor de binnenste gel (oplossing I) op basis van het collageen voorraad concentratie.
   Opmerking: Andere collageen concentraties voor de binnenste gel kan ook worden gebruikt.
4. In een steriele (gewoonlijk een bio kap), voeg langzaam 5 ui 10 x PBS buffer tot de vereiste hoeveelheid collageen voorraadoplossing (berekend in stap 2.3) onder zachtjes wervelen. Zorg ervoor dat de vorming luchtbel te voorkomen.
5. Stel de pH van het mengsel op 7,4 met 0,1 M NaOH met geijkte pH-meter. Als een indicatie, gebruiken ongeveer 5 ul om de pH in de buurt van 7,4 te brengen (het bedrag varieert afhankelijk van de voorraad concentratie en pH).
   Opmerking: Let op dat de betrokken volumes in dezestap is te klein voor het gebruik van standaard pH-meter. Gebruik een van de volgende trucs:
   1. Bereid collageen oplossingen voor meerdere monsters. Stel de pH in bulk met behulp van standaard pH-meter en distribueren van de collageen-oplossingen in de monsters.
   2. Als alternatief, pas de pH van een oplossing van collageen in grotere volume (i. E., Volume dat het gebruik van standaard pH-meter staan). Let op de hoeveelheid NaOH om de pH op de uiteindelijke pH brengen. De schaal van de volumes en gebruik de juiste hoeveelheid NaOH voor het experiment. Bevestig de pH-waarde met behulp van Lakmoespapier.
   3. Anders een micro pH-elektrode om de pH van kleine hoeveelheden nauwkeuriger regelen.
6. Breng de oplossing tot een volume van 45 ui met _H2O Voer alle stappen op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen.

3. Vorming van Concentric Gel Cultuur

1. Neem de voorverwarmde glazen bodem schaal (zie stap 2.2) van the incubator.
2. Voeg 5 ul van de 10 × geconcentreerde celsuspensie (opgesteld in stap 1.5) naar oplossing I. Hersuspendeer grondig. Zorg ervoor dat de vorming luchtbel te voorkomen. Het mengsel heeft nu een volume van 50 pl en bevat de uiteindelijke collageen concentratie (2,4 mg / ml) en celdichtheid (c _{uiteindelijke} = 2 x 10 ⁶ cellen / ml).
3. Voeg 20 ul van de cel-bevattende oplossing ik langzaam naar het midden van de put, zodat vormt een koepelvormige druppel (Figuur 1A). Zorg ervoor dat de vorming van luchtbellen bij deze stap te vermijden. Als een zeepbel vormen, voorzichtig maar snel proberen om ofwel scheurt het of uitzuigen met een pipet tip. Plaats voorzichtig de schotel terug in de incubator te laten de innerlijke gel polymeriseren gedurende 45 min.
4. Pesticide O (voor de buitenste, acellulair collageen gel) ongeveer 15 minuten vóór het einde van de incubatiestap.
   Opmerking: De buitenste gel voorwaarde kan worden gevarieerd in termen van collageenconcentratie en polymerisatie pHnetwerken te verkrijgen met verschillende microstructuren ^10. In dit protocol, gericht op een 1,5-4,0 mg / ml collageengel gepolymeriseerd bij een pH van 7,4.
   1. Op basis van de collageen voorraadconcentratie Bereken het vereiste volume nodig is om 200 pl collageenoplossing O bereiden de eindconcentratie.
5. Voeg 20 ul van 10 x PBS buffer langzaam de vereiste hoeveelheid collageen voorraadoplossing (berekend in stap 3.4) onder zachtjes wervelen. Stel de pH van het mengsel aan de uiteindelijke pH met 0,1 M NaOH met behulp van gekalibreerde pH-meter. Zie toelichting naar stap 2.5 met betrekking tot aanpassing van de pH.
6. Breng de oplossing tot een eindvolume van 200 pl met _H2O Voer alle stappen op het ijs om voortijdige collageen polymerisatie te voorkomen.
7. Neem de schaal uit de incubator na 45 min polymerisatie van de binnenste gel (zie stap 3.3). Voeg voorzichtig 180 ul oplossing O bovenop de binnenste gel, zodat de oplossing volledig bedekt binnenstegel en vult de put (Figuur 1B).
   1. Voer deze stap voorzichtig zonder roeren van de oplossing, wat kan leiden tot ongelijkmatige vezel oriëntaties in de buitenste gel. Zorg om te voorkomen dat het aanraken van de binnenste gel met een pipet, en om de vorming van bellen of luchtzakken te voorkomen. Als een zeepbel vormen, voorzichtig maar snel proberen om ofwel scheurt het of uitzuigen met een pipet tip. Plaats voorzichtig de schotel terug in de incubator te laten de buitenste gel polymeriseren.
8. Neem de schaal uit de incubator na 45 min van de polymerisatie. De gel moet reeds vrij solidified op dit punt, maar het kan nog los van het bodemoppervlak als ruw behandeld.
   1. Giet 2 ml opgewarmd celcultuurmedium om de schotel (figuur 1C). Zorg ervoor dat de gel volledig is ondergedompeld in het medium. Vernieuwen het medium elke 2 - 3 dagen tijdens de gehele duur van de cultuur.

4. Live-cell imaging

1. Voer beeldvorming met behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met langdurige live cell imaging vermogen. Neem een ingebouwde incubatiekamer met een temperatuur (37 ° C) en _CO2 (5%) controle. Schakel de microscoop en opwarmen het stadium ten minste 1 uur voor de proef begon.
   Opmerking: Gebruik objectief met lange werkafstand de waarneming en lokalisatie van cellen te optimaliseren in de 3D gels.
2. Incubeer de gel in medium dat 5 pl fluorescerende cel tracker kleurstof gedurende 30 min nauwkeurige lokalisatie van de cellen in het 3D systeem mogelijk. Vervolgens verwijdert ongebonden kleurstof door drie keer wassen met 1 x PBS. Daarna voeg celkweekmedium van de schaal.
3. Neem de schaal uit de incubator en plaats het op de microscoop podium (figuur 1D).
   Opmerking: beeldvorming van levende cellen kan beginnen in principe direct na de polymerisatie van de buitenste gel. Echter op dit moment de cellen in de binnenste gel nog niet verspreid. De migratie van de eerste cellen die zijn binnengevallen de buitenste gel, live-cell imaging 24 uur begint (afhankelijk van het type cel) na het begin van de cultuur onderzocht. Als vuistregel, ongeveer 12 - 14 dagen kweken zijn vereist voor de meeste van de cellen in de binnenste gel naar de buitenste gel voeren.
4. Select Volumes of View (VOV's) in de regio's in de buitenste gel rond de binnenste gel. Na 24 uur incubatie wordt de celpopulatie hebben verspreid, staken de interface tussen de binnenste en buitenste gels, en begon de buitenste gel binnenvallen.
   1. Voor de VOV's, onder meer de gel regio's direct naast de gel-interface, tussenliggende gebieden en regio's dicht bij de rand van de buitenste gel ^7. Gebieden uitsluiten dichter dan 50 urn van de bodem en zijvlakken, en uit de bovenkant van de gel, om eventuele randeffecten te vermijden. Elke VOV meet 647 × 647 × 100 micrometer ³ meestal (in x, Y en z-richtingen, respectievelijk) met 5 pm interval in de z -stack.
5. Zorgen imaging modes, kanalen / filters, belichting tijden, en het beeld resoluties correct geselecteerd. Voor label-free beeldvorming van het collageen netwerk, gebruikt confocale microscopie reflectie gelijktijdig tijdens de time-lapse live cell imaging.
6. Neem voorbeeldbestanden, plotten de intensiteit histogrammen, en de winsten en offsets aan te passen om voldoende signaal te observeren en verzadiging te voorkomen door ervoor te zorgen dat het histogram ligt tussen nul en de maximale intensiteit. Deze instellingen niet meer veranderen gedurende de looptijd van het experiment.
7. Neem time-lapse beelden van de geselecteerde VOV's met een tijdsinterval Δ t, 10 min gedurende 8 uur (of langer indien nodig).

5. Cel Tracking en Data-analyse

1. Het verrichten van kwantitatieve nabewerking van de beelden van de z -stack beelden met behulp Aangepast decor te beeldbewerkingssoftware.
   1. Segment de time-lapse beelden automatisch de 3D ​​cel posities (x, y, z, t) te selecteren.
   2. Voor elk frame, handmatig controleren van de juistheid lokalisatie en verwijder valse positieven te wijten aan cel puin en cellulaire uitsteeksels die mogelijk zijn aangezien voor cellen. Verwijder proliferatieve cellen van de analyse en splitsing overlappende of geschakelde cellen in afzonderlijke objecten.
2. Genereer 3D time-lapse cel nummers van de cel coördinaten (x, y, z, t) in de vorige stap verkregen door het koppelen van de locatie van elke cel in de tijdreeks.
3. Elimineer willekeurig en systeem geluid door het verwijderen van sporen korter dan een drempel rupslengte (meestal 20 min).
4. Corrigeren voor monster drift door het aftrekken van de totale netto verplaatsingen van de tracks indien nodig.
5. Bereken cel verplaatsing,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/>, en cel migratie afstand, Van de waargenomen cel trajecten, waarbij een vector die de 3D-locatie van een cel op tijdstip en het aantal tijdstippen.
   1. Bereken cel snelheid S = d / (n • Δ t), waarin Δ t is de tijd tussen frames. Bereken cel migratie gerichtheid (of persistentie) met P = Ad / d. Deze eenvoudige maatregel van persistentie houdt in dat voor P = 0 de netto verplaatsing nul is en voor P = 1 de baan is een rechte directionele lijn.

Resultaten

De concentrische gel assay hier gepresenteerde werd uitgevoerd met sterk invasieve borstkankercellen MDA-MB-231, 2,4 mg / ml binnenste collageengel en een mobiele zaaidichtheid van = 2 x 10 ⁶ cellen / ml, als voorbeeld. Zoals getoond in figuur 2, gewoonlijk na een paar dagen kweken werden de cellen geschonden binnenste buitenste gel interface en begon de buitenste gel binnenvallen. De celpopulatie uitgespreid hoofdzakelijk radiaal naar buiten.

De polymerisatieomst...

Discussie

In dit protocol beschrijven we een in vitro assay om het 3D migratiegedrag van cellen in matrixomgevingen te bestuderen die topologisch lijken op ECM's die in vivo worden aangetroffen. Er zijn drie belangrijke voordelen van deze assay in vergelijking met andere momenteel beschikbare methoden. Ten eerste maakt deze assay het mogelijk om tegelijkertijd de celmigratiemechanismen op zowel populatieniveau als individueel celniveau te onderzoeken. Dit opent mogelijkheden voor het bestuderen van collectieve ce...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cell culture incubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope	Nikon A1R		Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR	Life Technologies	C2927
Glass-bottom dish	IWAKI Cell Biology	3931-035	35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH meter	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054