Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Samenvatting

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Samenvatting

Er is momenteel veel belangstelling voor het begrijpen hoe cellen en weefsels reageren op mechanische prikkels, maar de huidige benaderingen zijn beperkt in hun vermogen om reacties in realtime in levende cellen of viabel weefsel te meten. Er werd een protocol ontwikkeld met behulp van een celactuator om levende cellen die op of weefsels die aan een elastisch substraat zijn gegroeid uit te rekken terwijl ze worden geïmager met confocale en atomaire krachtmicroscopie (AFM). Voorlopige studies tonen aan dat tonisch uitrekken van menselijke bronchiale epitheelcellen een significante toename veroorzaakte in de productie van mitochondriale superoxide. Bovendien werden, met behulp van dit protocol, alveolaire epitheelcellen uitgerekt en geïmager, wat directe schade aan de epitheelcellen toonde door overdistensie, wat een vorm van longbeschadiging in vitro simuleert. Er is ook een protocol opgenomen om AFM nano-indentaties uit te voeren op uitgerekte cellen.

Inleiding

De cellen worden onderworpen aan mechanische belasting in veel weefsels, en deze mechanische stimulatie is aangetoond dat veranderingen in de patronen van genexpressie, afgifte van groeifactoren, cytokinen, of verbouwen van de extracellulaire matrix te bevorderen cytoskelet ^1-4. De intracellulaire signalen getransduceerd door deze mechanische stimuli optreden door het proces van mechanotransductie ^5-7. In het ademhalingssysteem, vloeit uit mechanotransduction de toename van reactieve zuurstof species (ROS) ^8,9 en pro-inflammatoire cytokinen ¹⁰ in pulmonaire epitheelcellen in aanwezigheid van cyclische trekbelasting. Sterk bewijs suggereert ook dat overmatige trekbelasting leidt tot directe schade aan het alveolaire epitheel, naast de biochemische reacties van cellen ^11-14. Hoewel de nadruk ligt hier vooral op de reactie van longcellen aan mechanische vervorming, paden veroorzaakt door mechanotransductie spelen een belangrijke rol in de basic functie van vele weefsels in het menselijk lichaam, waaronder de regulering van de vasculaire tonus en de ¹⁵ ontwikkeling van de groeiplaat ^16.

De toenemende belangstelling mechanotransduction heeft geleid tot de ontwikkeling van talrijke inrichtingen voor de toepassing van fysiologisch relevante mechanische belastingen op gekweekte cellen en weefsels. Met name inrichtingen aanbrengen van een trekspanning, die een gebruikelijke vorm van mechanische belasting ervaren door weefsel, populair ^11,17-19. Veel van de beschikbare inrichtingen zijn ofwel uitgevoerd als een bioreactor voor weefselregeneratie toepassingen of niet bevorderlijk real time imaging met stretch. Als zodanig is er behoefte aan middelen en methoden om cellen en weefsels kunnen visualiseren spanning het onderzoek trajecten van mechanotransduction vergemakkelijken.

Hierin werd een in-plane mechanische spaninrichting ontworpen en protocollen werden ontwikkeld om m passenultiple vormen van stam aan weefsels en cellen terwijl beeldvorming van de biochemische en mechanische reacties in real time (Figuur 1A-D). De inrichting maakt gebruik van zes regelmatig verdeelde klemmen omtrek aangebracht op een flexibel membraan begrijpen en toepassen van een in-vlak radiale uitzetting tot ongeveer 20% (Figuur 1B). De bedieningsinrichting kan in een celkweek incubator geplaatst gedurende een langere tijd, terwijl de motor (figuur 1C) gepositioneerd buiten de incubator en gecontroleerd door proprietaire software die door de motor leverancier. De motor is verbonden met een lineaire driver, die een interne nok roteert, drijven de zes stretcher klemmen gelijkmatig in spanning en ontspanning.

Naast de mechanische inrichting zijn aangepast flexibele membranen gemaakt van commercieel verkrijgbare celkweek bereid membranen voor gebruik in het mechanische systeem. Dan cirkelvormige wanden (met een diameter van ongeveer28 mm) werden gemaakt en vastgemaakt aan het flexibele membraan zodat cellen kunnen worden gekweekt alleen in dit gebied goed beschreven soort profiel. Om te bepalen of de positie van deze membranen in de aandrijfinrichting uniform en isotroop rek zou voorzien in het midden van het flexibele membraan, werd eindige elementen analyse uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare software (Figuur 1E-F). Het flexibele membraan werd gemodelleerd met symmetrische randvoorwaarden en gebruik van alle vierhoekige elementen van de maas. De concentrische ringen gezien in de contourgrafiek van maximum hoofdrek figuur 1F geven de isotrope verdeling van de spanning.

De rek ervaren door het membraan werd gemeten door beelden markeringen doorladen (figuur 2). Figuur 2D laat zien dat de gemiddelde membraan rek gemeten in radiale en axiale richting ongeveer lineairmet betrekking tot de toegepaste motor telt maximaal lineaire rek van 20%. Er was geen significant verschil tussen de rekniveaus gemeten tijdens uitzetting vergeleken met die gemeten tijdens het terugtrekken terug naar de rustpositie. Vervolgens wordt de verplaatsing van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE) en hun kernen gekweekt op de aangepaste flexibel membraan werden gemeten. Fluorescent gelabelde (DAPI) kernen van de 16HBE cellen werden afgebeeld met behulp van een 20X objectief onder een confocale microscoop, terwijl hele cel verplaatsing werd gemeten met fase contrast beelden die zijn opgenomen met een digitale microscoop. Zoals blijkt uit figuur 3, de spanning gemeten door verplaatsing van kernen was vergelijkbaar met die gemeten door verplaatsing van markeringen op het membraan, tot ~ 20% lineair rek. Dit bevestigt dat de spanning uitgeoefend op de membranen van de hechtende cellen werd overgebracht. De protocollen die het gebruik van de aangepaste inrichting op een traditionele microscoop en een atomic force microscope worden in de volgende stappen.

Protocol

1. De bouw van de membraan met Well Muren voor Behoud van de Cel Cultuur Media (zie figuur 1D voor het eindproduct)

1. Met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) platen bekleed met collageen I, snijd de omtrek van het flexibele membraan met een scalpel of een matrijs.
2. Plaats elk membraan in een 60 mm petrischaal voor opslag.
3. Oprichting van de muren:
   1. Meng PDMS bij een 10: 1 gewichtsverhouding van elastomeer A tot elastomeer B (verharder).
   2. Giet 5 ml volledig gemengde PDMS in 50 ml buizen.
   3. Plaats 50 ml buizen met uitgeharde PDMS horizontaal in een hybridisatieoven.
   4. Gebruik de rotor het bekleden van de binnenwanden van de buizen bij 8 rpm gedurende de hardingstijd. Bij KT, wordt de PDMS volledig uitgehard in 2 dagen.
   5. Verwijder de PDMS uit de buis in een steriele celkweek kap.
   6. Met behulp van een nieuw scheermesje, partitioneren de cilinder van PDMS in secties 4 mm in de hoogte.
   7. Plaats de secties, die zal dienen als het membraan walls, in een petrischaal container zonder dat de wanden kreuken te vermijden.
4. Selecteren en middelste wand van PDMS op een membraan terwijl de twee in de petrischaal.
5. Plaats voorzichtig uitgeharde PDMS (10: 1-verhouding) op de buitenomtrek van de wand te gebruiken lijm. Voorkom vorming van spleten tussen de wand en het membraan omdat het er om vloeistof vast te houden.
6. Plaats elke petrischaal met de voltooide membraan en bedekt met een oven bij 70 ° C gedurende 24 uur om uit te harden.

2. Correlatie van Motor Rotaties met klem Verplaatsing of Radial Groei voor Calibration (figuur 2)

1. Start de software besturen van de motor.
2. Verplaats de klemmen van het apparaat met behulp van de handmatige instelling in de motor software.
3. Meet de afstand en noteer de motor telling positie tussen tegenover elkaar liggende klemmen zowel minimum en maximum verplaatsing van de klemmen.
4. De procentuele verandering van het distance tussen de klemmen als functie van het aantal motor (~ 0-75k tellingen). Hierdoor wordt de maximum mogelijke belasting verwezenlijkt op het membraan te geven.

3. Toepassing van Stretch op Mouse Lung epitheelcellijn (MLE12)

1. Zaad MLE12 cellen met 2,5 miljoen cellen op het flexibele membraan (stap 1) per putje worden confluent binnen twee dagen. De zaaidichtheid kan variëren voor verschillende celtypen.
2. Controleer de mechanische actuator in een volledig ontspannen positie.
   1. Verwijder celcultuur media.
   2. Met 1,5 mm biopt stoten, punch twee gaten in elk van de zes klemmen (zie figuur 1D) tabs van het membraan. De radiale positie van de gaten bepaalt de hoeveelheid voorspanning van het membraan ervaringen oorspronkelijk. Pons de gaten op een straal van 20,5 mm op de tabs membraan indien geen voorspanning wordt gewenst.
   3. Plaats het membraan op de brancard met de geponste gaten rij met de pennen in de klemmen.Plaats de top klemmen op zijn plaats. Draai de schroeven een voor een afwisselend kanten.
   4. Voeg 1 ml celcultuur media.
3. Plaats het apparaat op de microscooptafel centrering het midden van de membraan met de lichtweg.
4. Gebruik tape of magneten (indien mogelijk) om het apparaat naar het podium. Eenmaal opgelost, regelen in het vlak (parallel aan het membraan) en verticale (z-richting) van de mechanische inrichting van fase controller van de microscoop.
5. Breng traject met de software van de fabrikant door het handmatig regelen van de positie en de snelheid van rotatie van de motor ^20.

4. Meting van de mitochondriale reactive oxygen species (ROS)

1. Zodra cellen zijn confluent, voeg 1-2 ml RT DMEM met mitochondriale superoxide indicator (5 uM uiteindelijke concentratie) direct op de cellen.
2. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
3. Was de cellen voorzichtig drie keer met buffer verwarmd in een waterbad37 ° C.
4. Plaats onmiddellijk het flexibele membraan op de brancard (Stap 2.2) reeds in plaats onder een rechtopstaande confocale microscoop.
5. Voeg 1 ml van DMEM met fenolrood-vrij medium en 25 mM HEPES.
6. Stel excitatie / emissie filters om 510/580 nm.
7. Afbeelding meerdere velden elke 15 minuten naar het gewenste tijdsverloop van mitochondriale superoxide productie creëren.
8. Van de opgenomen beelden, opnemen fluorescentie-intensiteit histogrammen op elk tijdsinterval met behulp van software in staat te kwantificeren fluorescentie-intensiteit.

5. Toepassing van de Stretch en Atomic Force Microscopy (AFM)

OPMERKING: Deze stappen zijn bedoeld voor een bepaalde AFM en optische microscoop combinatie (Figuur 4 en Materials List).

1. Bereid de AFM het experiment.
   1. Vergroot de hoogte van de AFM kop tot de maximale positie in de z-richting.
   2. Zet extenders op de benen van de AFMTil het vliegtuig waarin AFM cantilever contacten het monster. Het monster en de AFM printkop moet worden opgetild tot de hoogte van de mechanische koppelstuk.
2. Bereid de optische microscoop (indien beschikbaar).
   1. Verwijder de AFM scanner plaat. Verwijder het gewenste doel.
   2. Voeg een afstandhouder aan de doelstelling. De hoogte van de afstandhouder zal afhangen van het doel en de specifieke AFM opzet, maar het is noodzakelijk als optische beeldvorming gewenst aangezien waarnemingsvlak verschuiving in de z-richting met een bedrag gelijk aan de brancard en de hoogte van de adaptor (figuur wordt 5A). Merk op dat de AFM biedt meestal lage vergroting beeldvorming van een optisch pad boven het apparaat.
   3. Monteer de gewenste doel weer op zijn plaats. Plaats de scanner terug naar de AFM.
   4. Start de AFM software. Start alle benodigde lichtbronnen inclusief de lichtbron voor fluorescentie metingen.
   5. Monteer een chip met een vrijdragende balkgeschikt is voor de gewenste metingen. 200 pN / nm of minder stijfheid heeft de voorkeur bij het meten van de elastische modulus van levende cellen.
   6. Lijn de laser en kalibreren van de cantilever stijfheid volgens de suggesties van de fabrikant op een glazen dekglaasje gemonteerd op het apparaat.
3. Bereid een membraan als in stap 1, maar met de volgende modificaties.
   1. Onmiddellijk voor het monteren van de membraan naar de spaninrichting, snijd de wanden ongeveer 1 mm in hoogte. Dit voorkomt de ondervonden interferentie tussen de membraanwanden en de meetcel.
   2. Monteer het membraan op de mechanische apparaat zoals beschreven 3.2.1-3.2.3.
   3. Celkweek media verwijderen om beschadiging van de AFM scanner bij een lekkage te voorkomen.
   4. Koppel het apparaat met een adapter (Figuur 5A). Plaats het mechanische apparaat met de adapter op de scanner.
   5. Trek de membraan naar de gewenste trekspanning level.
4. Nano-inspringen van uitgerekt cellen.
   1. Voeg een beperkt (<0,5 ml) volume van de media op de cellen naar AFM scanner of microscoop schade te voorkomen als gevolg van een lekkage.
   2. Schakel de cantilever met het membraan.
   3. Volg het protocol van de bijzondere AFM apparaat om gebieden van belang te scannen.

Resultaten

Reactive oxygen species en vervorming

Eerdere studies toonden verhogingen reactive oxygen species (ROS) in de luchtwegen en alveolaire epitheelcellen in respons op cyclische rek ^21. Reactieve zuurstofspecies omvatten moleculen en vrije radicalen afgeleid van moleculaire zuurstof met een hoge reactiviteit met lipiden, eiwitten, polysachariden, en nucleïnezuren ^22-24. ROS als gemeenschappelijke intracellulair signaal ionkanaalfunctie reguleren, proteïne kinase / ...

Discussie

Een uniek apparaat voor live-cell imaging tijdens mechanische stretch is ontwikkeld; en dit apparaat werd gebruikt in een protocol om long epitheelcellen Mechanobiology bestuderen. In voorlopige studies werd gevonden dat een enkele plaats rek stimuleerde de productie van mitochondriale superoxide in bronchiale epitheelcellen. Bovendien werd aangetoond dat verhoogde mechanische belasting veroorzaakt directe schade aan de integriteit van een monolaag van alveolaire epitheelcellen.

Om deze voor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series	MOOG Animatics	SM3416D	Geïntegreerde motor, controller, versterker, encoder en communicatiebus
Flexcell Membrane (Collagen I coated)	Flexcell International Corp	SM2-1010C	3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184	Dow Corning Corporation		10:1
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	H1399	DAPI-kleurstof
MitoSOX	Sigma-Aldrich	M36008
Tiron	Sigma-Aldrich	D7389	mitochondrial superoxide label
DMEM			superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes	Fisher Scientific	06-443-19	Elke centrifugebuis kan worden gebruikt om een gebied voor beeldvorming te creëren.
Hybridization oven	Bellco Glass
MLE12 Cells	ATCC	CRL-2110	Mouse Lung Epithelial Cells
16HBE cells	ATCC	CRL-2741	Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation	Budget Sensors	Si-Ni30
AFM	Asylum Research	MFP3D
Olympus microscope	Olympus	IX-71	Omgekeerde microscoop met 20X en 40X objectieven.
AFM Leg Extenders	Asylum Research	Not available	AFM microscoop
Finite Element Analyses
ABAQUS	Simulia	6.12
Software
ImageJ	NIH
Microscopes
Digital microscope	Life Technologies	EVOS XL Core	Aanvankelijk een zelfstandig bedrijf, nu eigendom van Life Technologies.
Confocal microscope	Zeiss	LSM 710	2-foton rechtopstaande microscoop