Methodenartikel

Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52742

⸱

24 juni 2015

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

In dit artikel

Samenvatting

Het in beeld brengen van gedrag en neurale activiteit over lange tijdschalen zonder het dier te immobiliseren, is een voorwaarde om gedrag te begrijpen. Agarose microfluïdische kamersbeeldvorming (AMI) kan worden gebruikt om neurale activiteit en gedrag voor alle levensfasen van Caenorhabditis elegans in beeld te brengen.

Samenvatting

Gedrag wordt bestuurd door het zenuwstelsel. Calcium beeldvorming is een eenvoudige werkwijze in de transparante nematode Caenorhabditis elegans om de activiteit van neuronen in verschillende gedragingen meten. Neurale activiteit correleert met gedragstherapie, dient het dier niet wordt geïmmobiliseerd maar moeten kunnen bewegen. Veel gedragsveranderingen optreden tijdens lange tijdschalen en vereisen opnemen gedurende vele uren van gedrag. Dit maakt het ook noodzakelijk om de cultuur van de wormen in de aanwezigheid van voedsel. Hoe kunnen wormen worden gekweekt en hun neurale activiteit afgebeeld over langere tijdschalen? Agarose microkamer Imaging (AMI) was eerder ontwikkeld om de cultuur en observeren kleine larven en is nu aangepast om alle levensfasen van de vroege L1 bestuderen totdat het volwassen stadium van C. elegans. AMI kan worden uitgevoerd op verschillende levensstadia van C. elegans. Langdurige calcium beeldvorming wordt bereikt zonder immobiliseren de dieren met behulp van korte extern getriggerd blootstellingen comgecombineerd met een elektron-charge-coupled device (EMCCD) camera-opname te vermenigvuldigen. Uitzoomen of scannen kan opschalen van deze methode om de afbeelding tot 40 wormen in parallel. Aldus wordt een werkwijze beschreven voor het gedrag en de neurale activiteit op langere tijdschalen in alle levensfasen van C. elegans.

Inleiding

Caenorhabditis elegans is vastgesteld als een modelsysteem om gedrag te bestuderen1. Vanwege de geschiktheid voor genetica kunnen de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag worden bestudeerd. Veel gedragingen vinden plaats op lange tijdschalen. Er zijn twee hoofdbenaderingen die kunnen worden gebruikt om mobiele dieren over lange tijdschalen te observeren. De eerste benadering is het volgen van het dier tijdens beweging met behulp van een geautomatiseerde stage of camera2-8 en de tweede is het beperken van de beweging tot een bereik dat minstens zo klein is als het gezichtsveld van de camera9-14. Beide methoden hebben hun voordelen. Tracking maakt het mogelijk om een dier te volgen over lange ruimtelijke bereiken, maar beperkt het aantal dieren dat in één experiment kan worden onderscheiden. Het beperken van de beweging van de dieren maakt het mogelijk om de waarneming op te schalen naar veel individuen tegelijkertijd door gebruik te maken van arrays van beperkte compartimenten.

Omdat de nematode transparant is, kan live fluorescente beeldvorming non-invasief worden uitgevoerd15. Calciumbeeldvorming biedt een functionele uitlezing van de activiteit van prikkelbare cellen en is vastgesteld voor C. elegans16-20. Calcium komt de cel binnen via kanalen in het plasmamembraan die openen bij depolarisatie. Dus calcium fungeert als een proxy voor neurale activiteit. Calciumsensoren kunnen in twee hoofdklassen worden gegroepeerd, ratiometrische en niet-ratiometrische sensoren. Beide klassen maken gebruik van conformationele veranderingen van calciumbindende eiwitten die worden geïnduceerd bij binding van calcium. Ratiometrische sensoren bevatten twee fluorescente eiwitten. Wanneer het fluorescente eiwit met lagere golflengte wordt geëxciteerd, wordt een deel van de lichtenergie overgedragen naar het fluorescente eiwit met hogere golflengte als functie van hun afstand in een proces dat Fluorescence Resonance Energy Transfer of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) wordt genoemd21. Niet-ratiometrische sensoren zijn gebaseerd op circulair gepermuteerde GFP en maken gebruik van de-quenching van de fluorofoor veroorzaakt door calciumbinding22. Elke klasse heeft zijn voordelen. Terwijl ratiometrische sensoren minder gevoelig zijn voor beweging of expressie-artefacten, hebben niet-ratiometrische sensoren doorgaans een hoger dynamisch bereik. Zowel ratiometrische als niet-ratiometrische sensoren zijn nuttig geweest om de activiteit van prikkelbare cellen in C. elegans te bestuderen16-20,23,24.

Bij langdurige fluorescentiebeeldvorming zal de onderzoeker te maken krijgen met verschillende potentiële uitdagingen: 1. Verstoring van gedrag door excitatielicht: Wormen zijn gevoelig voor kortgolflengte fluorescentie excitatielicht en vermijden licht van het violette tot blauwe bereik dat wordt gebruikt voor calciumbeeldvorming25,26. Wormen reageren met een achteruitgaande of vooruitgaande ontsnappingsreactie25,26. Dus moet de hoeveelheid licht worden gecontroleerd. 2. Verbleking van de fluorescente sensoreiwit: Vaak belemmert verbleking van het fluorescente eiwit langdurige beeldvorming. Meestal zijn de lichtintensiteiten die nodig zijn om verbleking waar te nemen echter hoger dan de lichtintensiteiten die storende effecten op het gedrag van de dieren veroorzaken. Dus verbleking is alleen een theoretisch probleem bij dit type calciumbeeldvorming. 3. Wormen in de microkamers zijn niet gefixeerd en bewegen constant tijdens waakgedrag en beelden kunnen wazig lijken als de worm niet geïmmobiliseerd is. Al deze uitdagingen kunnen worden opgelost door gebruik te maken van extreem korte belichtingstijden met lage lichtintensiteit. Dit kan worden gerealiseerd door een zeer gevoelige EMCCD-camera te gebruiken met korte belichtingstijden en externe triggering van een lichtemitterende diode (LED). Om de wormen zo kort mogelijk bloot te stellen aan het verlichtingslicht (alleen tijdens de belichtingstijd van de camera) wordt de LED extern getriggerd met behulp van een transistor-transistor logic (TTL) signaal dat de camera tijdens de belichting uitzendt, wat resulteert in een verlichting van de worm voor precies de tijd dat het camerachip wordt blootgesteld. Dit betekent ook dat de EMCCD-chip donker zal zijn tijdens het uitlezen van gegevens, wat optimaal is voor de uitleesprestaties van deze chip.

Eerder zijn agarose microkamers ontwikkeld voor langdurige fluorescentiebeeldvorming van C. elegans larven9. Hier wordt beschreven hoe agarose microkamers kunnen worden gebruikt voor langdurige calciumbeeldvorming voor elke levensfase van C. elegans, hoe calciumbeeldvorming kan worden uitgevoerd, en hoe deze methode kan worden opgeschaald om veel individuele wormen parallel te testen.

Protocol

1. Instrumenten, Cultuur Media en gerechten

  1. Met een microscoop die kan het de monster in focus en dat is voorzien van een automatische fase. Bouw een op maat gemaakt deksel verwarming of de aanschaf van een commerciële oplossing. Opzetten van een LED-EMCCD camerasysteem waarbij de belichting van de camera triggers LED verlichting via een TTL-signaal via de fabrikant.
    Opmerking: Zie Discussie voor details.
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) postzegels
    1. Fabriceren PDMS postzegels in een microfluidics voorziening of de PDMS postzegels geproduceerd door een commerciële gieterij. Om een ​​commercieel gieterij gebruiken, stuur dan een autocad bestand naar het bedrijf en geef de diepte (15 micrometer, bijvoorbeeld) van het apparaat. Na levering van de gieterij, snijd de PDMS chip in zijn 16 postzegels met een scalpel.
    2. Obligatie elke individuele stempel op een glasplaatje met lucht plasma. Voor het verlijmen, bloot zowel de PDMS stempel en het glaasje aan de lucht plasma voor eenbout 1 min (met de hoogste plasma hier op 0,5 mbar). Zorg ervoor dat de oppervlakken voor het verlijmen van het gezicht naar boven tijdens de plasmabehandeling. Vervolgens plaatst u de PDMS stempel op het glaasje.
  3. Neem een ​​3,5 cm onderste schaal en knip een vierkant gebied van 18 x 18 mm van het centrum van de bodem van de schaal met een verticale freesmachine en scherpe roterende messen. Met lage rotatiesnelheid van het snijorgaan en langzaam voeding te voorkomen dat de kunststof smelten door warmte door wrijving. Bereid meerdere gerechten tegelijk.
    Opmerking: De onderste schaal kan vele malen opnieuw gebruikt na het experiment wanneer wordt gereinigd na weken in pure ethanol O / N.
  4. Agarose:
    1. Los 3 g high-smeltpunt agarose in 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2PO 4, 1 ml cholesterol (5 mg / ml in ethanol), H 2 O tot 1 L, steriliseer in de autoclaaf) door koken. Maak aliquots van de agarose opgelost in 2 ml Eppendorf buizen en store. Ook, stelt een batch van laag smeltpunt agarose dezelfde wijze als de hoogsmeltende agarose.
    2. Voor gebruik plaats 3 porties van hoogsmeltend agarose op een verwarmingsblok bij 95-98 ° C. Voor gebruik plaatst een aliquot van laag smeltpunt agarose op een verwarmingsblok bij 95-98 ° C totdat het gesmolten is en daarna op een verwarmingsblok bij 30 - 35 ° C.

2. Selectie van dieren

  1. Grow wormen bij een lage dichtheid op gezaaide NGM platen om schone dieren te verkrijgen. Zorg ervoor dat er is genoeg eten en slechts een paar dieren op het bord.
  2. Voor imaging L1 larven, dragen ongeveer 30 eieren met embryo's in de krakeling stadium op een frisse gezaaide NGM plaat. Voor het overzetten later larvale stadia of volwassene C. elegans, transfer ongeveer 30 wormen op een frisse gezaaide NGM plaat.

3. Bereiding van Agarose microkamers

  1. Voorbereiding van het gerecht:
    1. Neem een ​​kunststof schaal met een vierkante opening van 18 x 18 mm aan de onderkant en plaats het ondersteboven met de opening naar boven. Sluit de opening door een stuk dubbelzijdige kleefband van 20 x 20 mm op de opening. Draai de schaal om zodat het plakband op de bodem en zet de schaal op een hard oppervlak. Snijd de opening vrij met behulp van een scalpel.
    2. Met behulp van een pipet P1000, vul 2 ml 3% high-smeltpunt agarose in S-Basal in de schaal. Plaats de agarose op het gebied dat de opening omgeeft en laat stollen. Wacht tot de agarose is solide.
    3. Draai je om de schotel en trek de beschermfolie dat de dubbelzijdige plakband bedekt zodat de kleverige kant op de schotel zullen blijven en zullen worden blootgesteld.
      Opmerking: Als gevolg hiervan zal een boete ring plakband de buitenkant van de opening omringen. De agarose dient als vochtreservoir dat later het monster omgeven.
  2. Casting van microkamers:
    1. Expose the PDMS oppervlak voor het vormen met lucht plasma voor 20-60 sec.
      Opmerking: Dit plasma behandeling maakt het PDMS oppervlak hydrofiel, die het vangen van luchtbellen voorkomt en produceert scherpere prints.
    2. Construct twee spacers van gelijke hoogte door het stapelen 5-9 glasplaatjes. Place, wanneer zij hun lange zijden, de eerste afstandhouders, dan een glasplaatje, dan weer een afstandhouder stack. Plaats het glasplaatje dat de PDMS stempel bevat orthogonaal over de afstandhouders. De hoogte van de afstandhouders, zodat er een ruimte van ongeveer 1,5 mm tussen het vormoppervlak van de PDMS stempel en de interne glasplaatje.
    3. Plaats een druppel hete vloeistof high-smeltpunt agarose op de enkel glas dia in de buurt van de PDMS stempel en snel schuif de PDMS stempel verticaal in de vloeibare agarose. Laat de agarose stollen. Controleer dat het krijgt een ondoorzichtige verschijning, die meestal duurt ongeveer 2 min. Trek de stempel verticaal met één beweging.
      Opmerking: Het is handig om glue de glijplaten met dubbelzijdige plakband. De verticale beweging van de stempel voorkomt luchtbellen vast komen te zitten in de agarose.
  3. Breng de eieren of wormen samen met OP50 bacteriën op de agarose met een fijne platinum draad pick. Verdeel een ei of een worm per kamer samen met voedsel met behulp van een wimper. Vul ongeveer 30 eieren op één agarose pad.
  4. Snijd de agarose plaat met de gevulde microkamers in een vierkant van ongeveer 15 x 15 mm, zodat het past goed in de opening van de schaal. Pick-up op het plein agarose plaat met een pincet en plaats het ondersteboven op een glazen dekglaasje van 20 x 20 mm. Zodra gedaald, niet tillen het weer of schuif het rond, want dit kan ertoe leiden dat de bacteriën en wormen uit hun kamers om te worden geduwd.
  5. Montage van het gerecht:
    1. Plaats de glazen dekglaasje op de opening van de plastic schaaltje. Druk voorzichtig langs de glazen dekglaasje op de ring gemaakt van dubbelzijdige plakband.Zorg het glas niet te breken.
    2. Zet de schaal ondersteboven en gebruik een P1000 pipet om de kloof tussen de agar plaat bevattende de microkamers en agarose reservoir met vloeibaar laagsmeltende agarose afgekoeld tot ongeveer 30 ° C te vullen. Wacht tot de agarose is gestold.
    3. Sluit de schaal met deksel. Voor omgekeerde microscopen gebruik maken van een verwarmde deksel. Voor rechtop microscopen gebruik maken van een normale deksel en sluit het gerecht met Parafilm.
  6. Na het afronden van de voorbereiding van de 'counter, check ze onder een stereomicroscoop. De juiste vulling is cruciaal. Zie de discussie voor meer informatie.

4. Calcium Imaging

  1. Gebruik transgene stammen die genetisch gecodeerd calcium sensoren zoals HBR16 (goeIs5 [pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27.
  2. Gebruik een samengestelde microscoop uitgerust voor wide-field epifluorescentie. Sluit de TTL-uitgang van de camera aan EMCCDTTL ingang van de LED, zodat telkens wanneer de camera een lijst het monster wordt belicht. Gebruik een belichtingstijd van ongeveer 5 msec. EM winst in het bereik van 50-300.
  3. Geef een uitbarsting film running voor 24 uur bij elke worm wordt afgebeeld elke 15-30 min eerst voor 20 sec met DIC, dan voor 20 sec met een GFP fluorescentie op te nemen GCaMP, en neem dan een laatste beeld van het mKate2 signaal wordt genomen om controle voor expressieniveaus. Gebruik een beeldsnelheid van 2 / sec gedurende iedere burst.
  4. Voor visuele inspectie gegevens, gebruikt een kunstmatig gekleurde kaart om de zichtbaarheid van kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te verbeteren. Plot fluorescerende gegevens als AF / F, met F zijnde de gemiddelde uitgangswaarde van de fluorescentie. Een gedetailleerde beschrijving van calcium gegevensanalyse te vinden in de literatuur 20.

5. Parallel AMI van Multiple Worms

  1. Plaats het schaaltje met het microkamers op de microscoop, focus op het monster en schakel de autofocus. Een software protocol zodat de camera verkrijgt een uitbarsting van 40 beeldframes in 20 seconden elk half uur gedurende 24 uur, wat zal resulteren in 1920 frames per worm, een redelijke hoeveelheid data. Stel de scan, zodat het elke worm bezoekt met behulp van het podium. Doel om ongeveer 30 wormen filmen in één run.
  2. Afbeelding meerdere wormen door in te zoomen, dwz, met een lagere vergroting. Gebruik een lagere vergroting verschillende microkamers met de camera chip te dekken en te filmen meerdere aangrenzende microkamers tegelijk. Na het einde van het beeld overname, scheiden de gegevens voor elke individuele kamer door het bijsnijden van een regio van belang met betrekking tot een dier.
  3. Om snel data mobiliteit te beoordelen, te gebruiken kader aftrekken 28-32.

6. Imaging verschillende levensfasen van C. elegans

  1. Gebruik agarose microkamers voor alle levensstadia van C. elegans van L1 tot volwassen en met dauers. Gebruik de juiste kamer afmetingen voor difschillende levensfasen die worden weergegeven in Tabel 1.
Levensfase Kamer grootte Kamerdiepte Typische opnameduur Vergroting
L1 190 x 190 micrometer 10-15 urn ei - mid L2 400X
L2 370 x 370 micrometer 15 pm ei - L3 200X
Dauer larve 370 x 370 micrometer 25 pm 4 dagen 200X
L3 700 x 700 micrometer 45 pm L2 - L4 200X
L4 700 x 700 micrometer 45 pm jonge L4 - jong volwassen 100X
Jonge volwassen 700 x 700 micrometer 45 pm 12-24 uur 100X

Tabel 1. Kamer maten voor de verschillende levensfasen. Getoond worden Kamerafmetingen en vergrotingen die bruikbaar zijn voor verschillende stadia geoptimaliseerd voor een 8 x 8 mm camera chip.

Resultaten

Agarose microkamers kan worden toegepast op elk levensfase van C. elegans. Zoals te zien is in figuur 1A, kunnen larvale ontwikkeling en slaapgedrag tijdens L1 lethargus worden waargenomen. Getoond zijn kamer maten, dat zijn 190 x 190 pm, 10 pm diep. Als langere tijdschalen nodig zijn, kunnen grotere kamers worden gebruikt. Zoals te zien is in figuur 1B, met een kamer met grotere afmetingen (370 x 370 urn, 25 urn diep) maakt de ontwikkeling van C. elegans van ei tot volwassene. Figuur 1C toont een analyse van de lange termijn gedragsverandering middels kader aftrekken van een worm gekweekt in een kamer van ei tot volwassene. Getoond zijn gemiddelde intensiteit na frame van aftrekken voor geselecteerde uitbarstingen tijdens de wake en lethargus. Hoe lager de gemiddelde intensiteit na frame subtraction waarden, hoe lager de mobiliteit van de worm. Getoond worden geselecteerd uitbarsting sporen van de ene kielzog toestand en één lethargus toestand per larvale stadium. Dewaargenomen toename van de gemiddelde intensiteit tijdens de ontwikkeling is vooral te wijten aan toegenomen contrast en grootte van het dier. Figuur 1D toont een dauer larve, een andere levensfase dat wordt geactiveerd tijdens het ongunstige milieuomstandigheden 33. Kamer grootte is 370 x 370 um, 15 urn diep. Merk op dat de Dauer larve in de kamer werd geplaatst zonder bacteriële voedsel, dat het verlaten van de dauer larvale stadium zou veroorzaken. Figuur 1E toont een volwassen worm die al heeft gelegd veel eieren in de kamer. Kamerafmetingen voor de volwassen waren 700 x 700 urn, 45 urn diep. Tenslotte Figuur 1F toont een volwassen hermafrodiet en een mannelijke paring in een volwassene kamer.

Calcium beeldvorming in beweeglijke wormen is mogelijk met GCaMP calcium sensoren. Figuren 2A, B tonen calcium beeldvorming van het commando interneuron AVA voor een L1 larve 27. De figuren 2C, D calcium activiteit vertonen voor de same type neuron in een volwassen dier.

Opschaling lange termijn beeldvorming is mogelijk door het scannen en door in te zoomen uit. Figuur 3A toont de beeldkwaliteit van gelijktijdige beeldvorming van 30 wormen op een camera chip met een 5 megapixel camera. Figuur 3B toont de beeldkwaliteit van 4 wormen calcium tegelijk afgebeeld.

figure-results-1
Figuur 1. Aanpassing van AMI op alle levensfasen van C. elegans. (A) larve afgebeeld van begin L1 tot begin L2 stadium in 190 x 190 micrometer kamers. (B) De ontwikkeling van ei tot volwassen in een 370 x 370 micrometer kamer. (C) Mobiliteit van een worm beoordeeld met behulp kader aftrekken. Afgebeeld is de gemiddelde intensiteit van alle foto's van het beeld na het frame van aftrekken voor een geselecteerde burst film voor elke larvale stage voor de wake en lethargus gedrag. (D) Een dauer larve in afwezigheid van voedsel in een 370 x 370 urn kamer. (E) Volwassen hermafrodiet met vele gelegd in een 700 x 700 micrometer kamer eieren. (F) Het koppelen van een mannelijke en een hermafrodiet in een 700 x 700 micrometer kamer. YA betekent jonge volwassene. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Calcium beeldvorming met AMI. (A) Calcium beeldvorming met GCaMP3 in de opdracht interneuron AVA van L1 larven met behulp van de nmr-1 promotor. Getoond zijn twee valse kleuren beelden. In de linkerafbeelding de activiteit van AVA laag en de worm is niet het maken van een achterwaartse beweging. In het juiste beeld van de activiteit van de AVA is hoog, en de worm beweegt naar achteren. (B) Calcium passanten over de tijd voor een L1 worm. (C, D) calcium transiënten in een volwassen dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Imaging meerdere wormen in parallel door uitzoomen. (A) gelijktijdig beeldvorming van 30 L1 wormen per frame met 190 x 190 micrometer kamers en een 100X vergroting (met behulp van een 10x objectief) en een 16,6 x 14 mm camera chip. (B) gelijktijdige beeldvorming van vier L3 worms per frame gebruiken 370 x 370 urn kamers en 100X vergroting en een van belang van een 16,6 x 14 mm camera chip.et = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hardware

De focus van een microscoop zal doorgaans drift tijdens langdurige beeldacquisitie. Voor samengestelde microscopen, concentreren-het houden van systemen kunnen worden gekocht bij de grote microscoop fabrikanten. Wanneer een samengestelde microscoop met focusbesturing te duur zou een eenvoudig alternatief een stereomicroscoop gebruiken. Verbinding microscopen maken het gebruik van doelen met een hoge numerieke apertuur (NA) en kan gemakkelijk worden geautomatiseerd. 40X olie doelstellingen zijn zeer geschikt. Waterimmersie lenzen zijn niet ideaal vanwege verdamping gedurende langdurige imaging. Differentieel interferentie contrast (DIC) vormt een mooi contrast dat helpt om morfologische en gedragsveranderingen te volgen, maar eenvoudige helderveld beeldvorming kan worden gebruikt. Voor DIC of heldere veld imaging, gebruiken rood licht door het plaatsen van een rood licht filter in de dia-verlichting pad van de microscoop. Voor het scannen van verscheidene microkamers een geautomatiseerd fase noodzakelijk. Beste prestaties is achieved wanneer een trap wordt gebruikt dat lineaire versnelling en vertraging heeft en kan worden ingesteld op lage scansnelheid te voorkomen tijdens het scannen de dieren te storen. We hebben geen gedragsreacties of calcium verhoging mechanosensitieve neuronen (ALM en PLM) tijdens het scannen, wat suggereert dat langzame scan inderdaad geen mechanosensitieve stelsel van de worm te activeren waargenomen (gegevens niet getoond). Commerciële LED kunnen worden gebruikt. Verschillende bedrijven bieden kant-en-klare oplossingen die de LED's bij verschillende golflengten omvatten. De LED moet de mogelijkheid van extern triggering de LED met een TTL-signaal. Een zeer gevoelige camera nodig op calcium beeldvorming van bewegende dieren. EMCCD's zijn de meest gevoelige camera's op de markt. De camera dient een TTL-uitgang tijdens blootstelling (ook wel "fire" output) hebben. Een deksel verwarmingselement dient om condensatie op het deksel te voorkomen bij gebruik van een omgekeerde microscoop. Aan een rechtopstaande microscoop, wordt de schaal gelegd zodat het deksel will onderaan en dus condensatie wordt voorkomen en geen deksel verwarmen. Het deksel moet goed sluiten de schotel om verdamping van water tijdens langdurige imaging voorkomen.

PDMS postzegels

Het oppervlak van PDMS stempel dat de structuur voor het vormen van de agarose bevat wordt verwijderd van het glasplaatje, waarbij de PDMS stempel steunt geconfronteerd. Een lijst met bedrijven die aangepaste microfluïdische chips bieden is te vinden op Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Het vullen van de aaltjes in hun kamers

Dit is de meest cruciale stap in het protocol en de volgende punten moeten worden overwogen: A) De vochtigheid van de agarose is cruciaal voor de overdracht van de wormen en voor de beeldvorming. Wanneer de agarose te vochtig, dwz een liquide covering een gebied van enkele microkamers, zal het niet mogelijk zijn om bacteriële voedsel en wormen distribueren gecontroleerd omdat de vloeistof zal de bacteriën wegvloeien. Wanneer de agarose te droog is dan de bacteriën en wormen niet van de pick eenvoudig betekent dat meer kracht gebruikt moet worden om de wormen en bacteriën die gemakkelijk schade veroorzaakt aan de agarose vallen. Bij het invullen van veel wormen de agarose kunnen opdrogen. In het ergste geval wordt de agarose zo droog uiteindelijk dat de kamers zullen bezwijken. Wanneer de agarose te droog kan worden gerehydrateerd door een kleine druppel (ongeveer 2 pl) van S-Basal op de zijkant van de chip waar geen wormen. Dompel de platinadraad halen in de vloeistof en zelfs de vloeistof te trekken in het gebied waar de kamers worden gevuld met wormen. B) De hoeveelheid voedsel is essentieel voor een succesvolle langdurige imaging. Als er niet genoeg voedsel, kan de wormen uit het uit te voeren. Als er teveel voedsel in de holte van de kamerniet gedragen als een vloeistof, maar veeleer als een stevig en zal wormen te ontsnappen uit de kamer door afzetten van de bacteriën. Streven naar een bacteriële suspensie dat de hele kamer vult verkrijgen. De wormen zijn constant fysiek contact met de agar en glasoppervlakken langs het grootste deel van hun lengte gedurende het experiment en de kruipende gedrag lijkt vergelijkbaar met beweging op een plaat en ongelijk aan dorsen vloeibaar zijn. C) Mechanische beschadiging van de agarose kan het experiment ruïneren. Een fijne keuze is essentieel. Het moet geen scherpe hoeken. Een zachte wimpers bevestigd aan een pipetpunt kan worden gebruikt om bacteriën of wormen verplaatsen in de kamers in plaats van een platina oogst. In de meeste gevallen echter extra gedroogde agarose is de oorzaak van schade. De pick of wimpers moet idealiter alleen nauwelijks raken de agarose zelf, en het water film op de agarose oppervlak moet trekken uit wormen en bacteriën. Bij het afdichten van de kamers, nogmaals, het vocht van de agarose essentieel. Er moet nietzijn geen vrije vloeistof op de agarose oppervlak, omdat deze weg bacteriën en wormen tijdens het afdichten kunnen wassen. Grote bellen kunnen worden verwijderd door voorzichtig een tipje van de agar plaat. Kleine belletjes die kleiner zijn dan de kamer vaak vast komen te zitten in de kamers. Deze belletjes zijn geen probleem en zal verdwijnen door absorptie. Na het monteren van de schotel, opnieuw controleren dat de agarose niet te droog of te nat. De kamers moeten netjes worden afgesloten en er mag geen vloeistofstroom tussen de kamers zijn. Als de agarose te nat is, zullen de kamers niet goed af. Wormen kunnen ontsnappen of hun voedsel zal worden weggespoeld. Als het monster is te vochtig, eenvoudig open het deksel en laat de agarose drogen voor een minuut of twee. Als de agarose te droog is, kunnen de kamers instorten en de wormen zullen ontsnappen.

Opschalen door in te zoomen op

Voor fluorescentie beeldvorming, uitzoomen wordt beperkt door de lage hoeveelheid licht verkregen bij lagere vergrotingen. Ook, EMCCD camera zijn geoptimaliseerd voor gevoeligheid en hebben vaak een relatief lage resolutie. Echter, het opschalen van imaging viervoudige is goed mogelijk. Zo kunnen vier kamers van 190 micrometer x 190 micrometer passen op één frame wanneer u 140x vergroting (bereikt door het gebruik van een 20X Doel en een 0,7X camera mount) en een 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm camera. Een hoge-resolutie camera met een grote chip (zoals sCMOS camera's, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 megapixels) optimaliseert het opschalen van DIC en lichte field imaging. Bijvoorbeeld, tot 30 L1 wormen in 190 urn x 190 urn kamers passen op elk frame van de camera bij gebruik van een 100x vergroting (zie figuur 3). In principe uitzoomen en scanning kan ook gecombineerd worden om nog grotere aantallen dieren te verkrijgen. De meeste neuronen blijven vrij goed in focus, zodat slechts een focal plane moet worden afgebeeld. Als neuronen worden gevonden om uit te gaan van de focus, az scan met een piëzo-station kan worden genomen op elk tijdstip point.

Aanpassing aan verschillende gedragingen

Dit protocol geeft een goed beeld van het gedrag over lange tijdschalen. Uiteraard is de timing van de bursts moet worden aangepast aan verschillende gedragingen en ontwikkelingsstadia.

Beperkingen van de techniek

Verscheidene factoren beperken de duur van beeldvorming. De belangrijkste is de hoeveelheid voedsel. Zodra het voedsel wordt geconsumeerd, larven stoppen met het ontwikkelen. Dus, in kleine kamers (190 x 190 micrometer) wormen ontwikkelen tot het L3 stadium en dan arresteren. Indien langere beeldvorming vereist is, groter compartimenten moet gebruiken. De maximale duur van het langdurige beeldvorming in het bereik van 2,5-3 dagen. Als langer beeldvorming nodig is, moeten de wormen te vorderen en geplaatst in de nieuwe kamers. Bij beeldvorming volwassen wormen, wordt een beperking veroorzaakt door het nageslacht van deze wormen. Volwassen wormen leggen eieren waaruit larven komen. Deze larven zullen ook in de kamer te blijven, Voedsel consumeren, en kan de beeldanalyse verstoren. Als nakomelingen problemen een oplossing is om ofwel gebruik steriel volwassenen of herhaaldelijk plaats de wormen in de frisse kamers. Om wormen te herstellen, wordt de agarose plaat bevat de kamer vrij gesneden met een scalpel, wordt getrokken uit het dekglaasje, en wordt geplaatst op een NGM plaat waaruit de wormen kunnen worden hersteld. Een andere beperking is de beperking van de wormen relatief kleine gebieden. Dit kan een probleem zijn als lange-afstands beweging moet worden geanalyseerd. Terwijl dieren in de kamers mechanisch als optogenetically 21,27,34,35 kan worden gestimuleerd, wordt de afgedichte aard van de kamer maakt het moeilijk oplosbare of vluchtige stimulerende toepassen. Biologisch belangrijke gassen zoals zuurstof of kooldioxide vrij diffunderen in de agar. De grote lucht reservoir in de schaal moet de concentratie gas in de kamers constant over de tijd die nodig is voor de experimenten te houden. Er moet echter rekening mee dat de lokale zuurstof concentratio worden gehoudenn in de kamer kan meer lijken op de omstandigheden in vloeibare cultuur dan de cultuur op het bord.

Belang met betrekking tot bestaande methoden

Microfluïdische apparaten zijn sterk geavanceerde gedrags- en ontwikkelingsstoornissen studeerde in C. elegans. Vaak worden microfluïdische structuren gemaakt van PDMS 12. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van microfluïdische cultuur raakvlakken gemaakt van agarose. De kracht van deze techniek is de combinatie van hoge afbeeldingkwaliteit, correlatie van gedrag fysiologische metingen, langdurige imaging en een redelijk hoge doorvoer. Hoge beeldkwaliteit wordt bereikt door beeldvorming door het glas dekglaasje met behulp van hoge NA doelstellingen. Hierdoor kan fluorescentie beeldvorming zoals calcium beeldvorming en confocale beeldvorming van subcellulaire structuren worden uitgevoerd. Doordat de dieren niet geïmmobiliseerd zoals in andere systemen, laat een correlatie van gedrag fysiologische metingen. Because de dieren voldoende voedsel, blijven ze ontwikkelen waardoor de lange termijn imaging. Dit systeem kan afbeelding veel wormen in één run omdat de dieren zijn beperkt tot hun gedefinieerde kamers. Zo kan deze werkwijze gemakkelijk worden opgeschaald 9,27,34-36.

Toekomstige toepassingen

Tot dusver is dit systeem voornamelijk gebruikt om slaapgedrag bestuderen in C. elegans L1 larven. Toch zal de aanpassing aan alle fasen het mogelijk om verschillende gedragingen ook onderzoek in dauers en volwassenen. Een breed scala aan gedragingen kunnen worden bestudeerd met deze techniek, variërend van paring tot het leggen van eieren.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Het Max Planck Society en een Göttingen Graduate School Junior Group stipendium om HB gefinancierd dit werk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hoge smeltpunt agaroseFisher BioreagentsBP(E)164-1000
Top Vision lage smeltpunt agaroseThermo ScientificR0801
LED systeemCoolLEDpE-2
Compound microscoopNikonTiE
StereomicroscoopLeicaM5
EMCCD cameraAndoriXon 897nu verkocht als iXon Ultra 897
sCMOS cameraAndorNeo
Plasma cleanerHarrickPDC-23G2
DekselverwarmerMPI workshopop maat gemaakt
Kunststof schaalFalcon08-757-100A
Z-trap voor de microscoopPriorNano Scan Z
X-Y trap voor de microscoopPriorProscan III
PDMS stempelAbbott Laboratoriesop maat gemaakt
Rode lichtfilterChromaET660/50m
35 mm petrischaalFalconFalcon wegwerp petrischalen, steriele, Corning
Dubbelzijdige plakbandSellotape/Henkeldubbelzijdig 25 mm x 33 malternatief kan dubbelzijdige plakband van Rubance Adhesives worden gebruikt.

Referenties

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094(2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208(2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198(2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782(2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853(2013).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

C eleganslangetermijnbeeldvormingEMCCD cameraneurale activiteitgedragsmonitoringmicroflu dische kamersvoedingsreservoirstage scanning
Agarose microkamers naar Lange termijn Calcium Imaging van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.