We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tijdens infectie en inflammatie, circulerende monocyten verlaat de bloedbaan en migreren naar de weefsels, waar ze differentiëren tot macrofagen. Macrofagen uiten oppervlakte Toll-like receptoren (TLRs), die moleculaire patronen geconserveerd door evolutie in een breed scala van micro-organismen te herkennen. TLRs spelen een centrale rol bij de activering van macrofagen die meestal geassocieerd met gen expressie verandering. Macrofagen zijn van cruciaal belang bij vele ziekten en hebben zich ontwikkeld tot een aantrekkelijk doelwit voor therapie. In de onderstaande voorschriften beschrijven we een werkwijze voor peritoneale murine macrofagen middels Brewer's thioglycollaat medium te isoleren. De laatste zal monocyten migratie stimuleren in het buikvlies, dus dit zal macrofaag opbrengst te verhogen met 10-voudig. Verschillende studies zijn uitgevoerd met behulp van het beenmerg, milt of peritoneale macrofagen afgeleid. Echter, werden peritoneale macrofagen getoond rijper wanneer de cellen zijn en zijn stabieler in hun functioneleteit en fenotype. Aldus macrofagen geïsoleerd uit muizen peritoneale holte tijdens een rit aanzienlijk celpopulatie die kan dienen verschillende immunologische en metabolische studies. Eenmaal geïsoleerd, werden macrofagen gestimuleerd met verschillende TLR liganden en bijgevolg genexpressie werd geëvalueerd.
Inleiding
Het reticuloendotheliaal fagocytaire systeem bestaat uit cellen in diverse weefsels en organen zoals beenmerg, bloed, lever en milt. Macrofagen worden uitgebreid verdeeld rond het lichaam, met name wanneer zij deelnemen aan aangeboren en adaptieve immuunreacties op controle en duidelijke infecties. Naast hun rol bij de afweer, macrofagen een belangrijke rol bij wondheling en ter handhaving weefselhomeostase 1,2 spelen. Bovendien macrofagen niet alleen belangrijk voor immuunfunctie maar ook actief deelnemen aan ijzer homeostase 3. In het lichaam ongeveer 80% ijzer aanwezig in hemoglobine in erytrocyten, die bij senescent gefagocyteerd door macrofagen 4. Dagelijks zijn deze macrofagen recyclen 25 mg-erytrocyten afgeleid ijzer en bieden het transport in het plasma 5. Bovendien, tijdens infectie en inflammatie, pro-inflammatoire macrofagen sekwestreren serumijzer ijzer- availabili verminderenty om ziekteverwekkers, zowel op systemische en lokale niveaus 6-8. Als goed, hebben studies aangetoond dat macrofagen en vooral levercellen produceren een antimicrobiële peptiden genaamd hepcidin die wordt beschouwd als de meester regulator van ijzer metabolisme 9, 10. Hepcidin wordt vooral vergroot door inflammatoire stimuli en is gedeeltelijk verantwoordelijk voor ijzer opslag in macrofagen na chronische ontsteking 11-13. Zoals hepcidin expressie in macrofagen is niet erg goed begrepen, hebben we de mogelijke rol van Toll-like receptoren (TLR) in deze regeling. De TLRs zijn vooral te vinden op macrofagen en spelen een centrale rol in hun activering. Bovendien LPS geïnduceerde hepcidin expressie in de lever is afhankelijk van TLR4 13. Derhalve ons onderzoek uitgevoerd, gebruikten we een methode waarbij de isolatie van muizen peritoneale macrofagen.
Macrofaag cellijnen worden breed gebruikt in macrofaag studies; niettemin uitgebreide cultuur kan gen verlies provoceren en verminderde immuunfuncties in deze cellijnen. Aldus isolatie van macrofagen uit buikholte cruciaal.
De muis peritoneale holte weer een ideale plaats om macrofagen 13-15 oogsten. Geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen zijn handig voor verschillende studies met betrekking tot hun immunologische functie. Echter, het aantal macrofagen in het buikvlies onvoldoende voor uitgebreide studies en wordt geschat ongeveer 1 x 10 6 macrofagen per muis. Aldus macrofagen uitgang verhogen, een steriele opwekken middel zoals thioglycollaat werd geïnjecteerd in de peritoneale holte voorafgaande aan de celoogst. Na thioglycollaat injectie werd de opbrengst aan macrofagen per muis verhoogd 10-voudig. Ondanks de toename in macrofagen opbrengst thioglycollaat medium fungeert Brewer's als irritant dat een ontstekingsreactie induceert, resulterend in de rekrutering van macrofagen, waarvan may maar niet noodzakelijk van invloed op de genexpressie. Daarom moet een controlegroep bestaande uit niet behandelde macrofagen Bij elk experiment. In onze handen werd hepcidin uitdrukking die sterk bevorderd door ontsteking niet gedetecteerd in onbehandelde thioglycollaat opgewekte peritoneale macrofagen. Bovendien hebben studies aangetoond dat Brewer thioglycollaat werft tal van macrofagen, maar hen niet activeren 16. Anderzijds, Brewer thioglycollaat opgewekte macrofagen werd een verhoogde lysosomale enzym maar een daling doden ingenomen organismen 17. Echter, de fagocytische capaciteit niet beïnvloed in vergelijking met niet- 16 opgewekte macrofagen.
Wanneer gekweekt in schotels, de peritoneale macrofagen worden adherent, waardoor deze hun scheiding van andere soorten cellen geïsoleerd uit de peritoneale holte. Vervolgens werden de geïsoleerde macrofagen blootgesteld aan verschillende TLRs agonisten.Tenslotte werd mRNA geëxtraheerd uit de gekweekte cellen en genexpressie werd geanalyseerd met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (qRT-PCR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen na goedkeuring door de institutionele Animal Care Committee van het Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolatie, identificatie, en cultuur van muizen peritoneale macrofagen
- Bereid 3,8% brouwer thioglycollaat medium. Om dit te doen, op te schorten 38 g thioglycollaat medium in 1000 ml gedestilleerd water. Breng de oplossing neerkomen op het medium volledig op te lossen. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. Sla tot 3 maanden in het donker, bij RT 18.
OPMERKING: Gooi als troebelheid ontwikkelt die een bacteriële besmetting aangeeft. De oplossing kan voor maximaal een jaar worden bewaard in het donker als steriel gehouden. - Met 1 ml injectiespuiten verbonden met 23 G naalden, spuiten 1 ml 3,8% Brewer thioglycollaat medium in de peritoneale holte van elke mouse en wacht 3 dagen. Gebruik nieuwe spuit en naald voor elke muis.
- Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (100 mg / kg) en euthanaseren muizen door cervicale dislocatie. Bevestig de juiste verdoving door het controleren van de ademhaling. Gewoonlijk snelle ademhaling geven dat de muis niet diep verdoofd.
- Was de buik van elke muis met 70% ethanol. Met behulp van een schaar, voert een laterale insnijding langs de onderkant middellijn van het peritoneum.
- Met behulp van een tang, trek de buik huid om de transparante peritoneale huid bloot. Met 5 ml spuit verbonden 20 G naalden, spuiten 5 ml koud DPBS in de peritoneale holte van elke muis.
- Voer een zachte massage op de buikholte en dan zuigen de vloeistof zorgvuldig zonder aanprikken van een orgaan. Verwijder de naald en afzien van de peritoneale vloeistof in 50 ml conische centrifugebuizen.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 xg in een gekoelde centrifuge.Cellen moeten koud blijven tijdens de hele procedure. Gooi supernatant en resuspendeer celpellet in RPMI medium 1640.
- Met behulp van een hemocytometer tellen cellen en breng de celdichtheid 1 x 10 6 cellen / ml.
- Karakteriseren het fenotype van geïsoleerde cellen door flowcytometrie gebruik 1 x 10 6 cellen per muis en antibodie tegen F4 / 80 (a oppervlakteantigeen tot expressie op macrofagen).
2. Cell Behandelingen
- Direct, na isolatie, voeg 1 x 10 6 cellen in elk putje. Laat het muizen peritoneale macrofagen te houden in de 6-well platen door ze te kweken gedurende 1-2 uur bij 37 ° C. Verwijder niet-hechtende cellen door voorzichtig wassen 3 maal met warm PBS.
- Vervolgens kweekcellen in 900 ul serumvrij DMEM gedurende 24 uur in aanwezigheid van de volgende TLR liganden: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml), poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) , LPS-TLR4 (100 ng / ml), flagelline-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
OPMERKING: Bereid je voor elk ligand een 10x voorraad-oplossing. Voeg 100 ul van deze laatste aan elk putje, waardoor het uitvoeren van een 10-voudige verdunning.
3. RNA Isolation
- Verwijderen medium en lyseren cellen rechtstreeks in de platen met zes putjes door het toevoegen van 1 ml TRIzol aan elk putje en het afleggen van cellysaat meermaals door een pipet. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5-10 min bij kamertemperatuur, om de volledige dissociatie van nucleoproteïne complexen mogelijk maken.
- Transfer lysaat in 1,5 ml RNase- en DNase-vrij microcentrifugebuizen. Voeg 0,2 ml chloroform per 1 ml TRIzol. Schud buizen krachtig met de hand gedurende 15 seconden en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 min. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Observeer het mengsel scheiden in een lagere rode fase (fenol-chloroform), een tussenfase en een kleurloze bovenste waterige fase. RNA blijft exclusief in de waterige fase.
- TranSfer voorzichtig de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis zonder de interfase. Neerslaan van het RNA door het te mengen met 0,5 ml isopropylalcohol. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Het RNA precipitaten vormt een witte pellet aan de zijkant en onderkant van de buis.
- Verwijder supernatant. Was de RNA pellet één keer met 1 ml 75% ethanol. Meng de monsters door vortexen en centrifugeer bij 7500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Kort droog de RNA (lucht drogen 10 min). Los RNA in 0,1 ml DEPC (RNAse vrij water) en incubeer gedurende 10 minuten bij 55 ° C.
- Kwantificeren RNA met behulp van een spectrofotometer. Om dit te doen, te verdunnen monsters 100 keer in DEPC water en te lezen op golflengten van 260 nm. De RNA-concentratie wordt dan: OD 260 x 40 ng / ul x verdunningsfactor.
- Equalize RNA concentraties en synthetiseren cDNA volgens instructies van de fabrikant gebruikt RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis Kit. Alsinstructies van de fabrikant, meet-gen mRNA levels door real-time PCR (45 cycli) in een Real-Time DNA detectiesysteem. Normaliseren genexpressie niveaus met twee huishoudgen bijvoorbeeld β-actine en GAPDH.
OPMERKING: Normaliseer RNA concentratie 500 ug / ml en 0,5 ug gebruik voor cDNA-synthese.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben eerst gekenmerkt de geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen door flowcytometrie. Hiervoor gebruikten we (F4 / 80) antilichamen die specifiek markers alleen macrofagen tot expressie. Deze karakterisering is vereist om het percentage van geïsoleerde macrofagen bepalen en het onderscheiden tussen cellen verkregen tijdens de isolatiewerkwijze. Zoals getoond in (figuur 1), het percentage van cellen die het antigeen F4 / 80 werd consistent gevonden dat boven 95%. Vervolgens, om genexpressie in mac...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Macrofagen zijn cruciaal om te overleven en zorgen voor een verleidelijk doelwit aan de gastheer voor immunologische doelstellingen te manipuleren. De ontdekking van TLRs en andere herkenningsmoleculen zijn de macrofagen uitgevoerd om het centrum van immunologische behandeling. Macrofagen reageren op diverse stimuli, waaronder cytokinen, beschadiging geassocieerde moleculaire patroon molecules (gedempt) 20 en moleculen geassocieerd met groepen pathogenen (PAMPs) 21. Deze verschillende stimuli respo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC verlenen geen 298515-2011). AL is de ontvanger van een Ph.D. beurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC), en MS werd gesteund uit een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR, verlenen geen. MOP123246).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 muizen | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, VS) | 475 | |
| Thioglycollaat | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% natriumpentobarbital (Gebruikt voor muizenanesthesie (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), geplaatst op ijs en zal dienen om macrofagen te verzamelen | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI-medium 1640 (Supplement met penicilline, streptomycine, L-glutamine en 10% foetaal runderserum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 en 5 ml spuiten | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well platen | Corning Incorporated (NY, VS) | MCT-150-C | |
| Bacterieel lipoproteïne Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylzuur (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLRL-PIC | |
| LPS van Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | L2880 | |
| Gezuiverde flagelline van Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoproteïne synthetisch FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-FSL | |
| ssRNA afgeleid van de HIV-1 lange terminale herhaling ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG-oligonucleïde ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, VS) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G en 23 G naalden | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Schaar | |||
| Pincet | |||
| 50 ml kegelvormige buizen geplaatst op ijs | Sarstedt (Newton, MA, VS) | 62.547.205 | |
| Rode bloedcellen lyse buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Gekoelde centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antilichaam | BIO-RAD (CA, VS) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antilichamen | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, VS) | ||
| 1,5 ml Eppendorf buisjes | Axygen Scietific (CA, VS) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, VS) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC behandeld water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0,01% di-ethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water (laat overnacht staan en autoclaveer) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR systeem | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Referenties
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
