We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tijdens infectie en inflammatie, circulerende monocyten verlaat de bloedbaan en migreren naar de weefsels, waar ze differentiëren tot macrofagen. Macrofagen uiten oppervlakte Toll-like receptoren (TLRs), die moleculaire patronen geconserveerd door evolutie in een breed scala van micro-organismen te herkennen. TLRs spelen een centrale rol bij de activering van macrofagen die meestal geassocieerd met gen expressie verandering. Macrofagen zijn van cruciaal belang bij vele ziekten en hebben zich ontwikkeld tot een aantrekkelijk doelwit voor therapie. In de onderstaande voorschriften beschrijven we een werkwijze voor peritoneale murine macrofagen middels Brewer's thioglycollaat medium te isoleren. De laatste zal monocyten migratie stimuleren in het buikvlies, dus dit zal macrofaag opbrengst te verhogen met 10-voudig. Verschillende studies zijn uitgevoerd met behulp van het beenmerg, milt of peritoneale macrofagen afgeleid. Echter, werden peritoneale macrofagen getoond rijper wanneer de cellen zijn en zijn stabieler in hun functioneleteit en fenotype. Aldus macrofagen geïsoleerd uit muizen peritoneale holte tijdens een rit aanzienlijk celpopulatie die kan dienen verschillende immunologische en metabolische studies. Eenmaal geïsoleerd, werden macrofagen gestimuleerd met verschillende TLR liganden en bijgevolg genexpressie werd geëvalueerd.
Inleiding
Het reticuloendotheliaal fagocytaire systeem bestaat uit cellen in diverse weefsels en organen zoals beenmerg, bloed, lever en milt. Macrofagen worden uitgebreid verdeeld rond het lichaam, met name wanneer zij deelnemen aan aangeboren en adaptieve immuunreacties op controle en duidelijke infecties. Naast hun rol bij de afweer, macrofagen een belangrijke rol bij wondheling en ter handhaving weefselhomeostase 1,2 spelen. Bovendien macrofagen niet alleen belangrijk voor immuunfunctie maar ook actief deelnemen aan ijzer homeostase 3. In het lichaam ongeveer 80% ijzer aanwezig in hemoglobine in erytrocyten, die bij senescent gefagocyteerd door macrof....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Raad van Animal Care richtlijnen na goedkeuring door de institutionele Animal Care Committee van het Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Isolatie, identificatie, en cultuur van muizen peritoneale macrofagen
- Bereid 3,8% brouwer thioglycollaat medium. Om dit te doen, op te schorten 38 g thioglycollaat medium in 1000 ml gedestilleerd water. Breng de oplossing neerkomen op het medium volledig op te lossen. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. Sla tot 3 maanden in het donker, bij RT 18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben eerst gekenmerkt de geïsoleerde muizen peritoneale macrofagen door flowcytometrie. Hiervoor gebruikten we (F4 / 80) antilichamen die specifiek markers alleen macrofagen tot expressie. Deze karakterisering is vereist om het percentage van geïsoleerde macrofagen bepalen en het onderscheiden tussen cellen verkregen tijdens de isolatiewerkwijze. Zoals getoond in (figuur 1), het percentage van cellen die het antigeen F4 / 80 werd consistent gevonden dat boven 95%. Vervolgens, om genexpressie in mac.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Macrofagen zijn cruciaal om te overleven en zorgen voor een verleidelijk doelwit aan de gastheer voor immunologische doelstellingen te manipuleren. De ontdekking van TLRs en andere herkenningsmoleculen zijn de macrofagen uitgevoerd om het centrum van immunologische behandeling. Macrofagen reageren op diverse stimuli, waaronder cytokinen, beschadiging geassocieerde moleculaire patroon molecules (gedempt) 20 en moleculen geassocieerd met groepen pathogenen (PAMPs) 21. Deze verschillende stimuli respo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC verlenen geen 298515-2011). AL is de ontvanger van een Ph.D. beurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC), en MS werd gesteund uit een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR, verlenen geen. MOP123246).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 muizen | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, VS) | 475 | |
| Thioglycollaat | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% natriumpentobarbital (Gebruikt voor muizenanesthesie (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), geplaatst op ijs en zal dienen om macrofagen te verzamelen | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI-medium 1640 (Supplement met penicilline, streptomycine, L-glutamine en 10% foetaal runderserum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 en 5 ml spuiten | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well platen | Corning Incorporated (NY, VS) | MCT-150-C | |
| Bacterieel lipoproteïne Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylzuur (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLRL-PIC | |
| LPS van Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | L2880 | |
| Gezuiverde flagelline van Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoproteïne synthetisch FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-FSL | |
| ssRNA afgeleid van de HIV-1 lange terminale herhaling ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, VS) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG-oligonucleïde ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, VS) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G en 23 G naalden | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Schaar | |||
| Pincet | |||
| 50 ml kegelvormige buizen geplaatst op ijs | Sarstedt (Newton, MA, VS) | 62.547.205 | |
| Rode bloedcellen lyse buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Gekoelde centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antilichaam | BIO-RAD (CA, VS) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antilichamen | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, VS) | ||
| 1,5 ml Eppendorf buisjes | Axygen Scietific (CA, VS) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, VS) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC behandeld water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0,01% di-ethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water (laat overnacht staan en autoclaveer) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR systeem | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
Referenties
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
