Methodenartikel

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

10.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 mei 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

In dit artikel

Samenvatting

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Samenvatting

Naast gevestigde werkwijzen zoals Western blot, zijn nieuwe methoden nodig om snel en gemakkelijk te kwantificeren ziektegeassocieerde α-synucleïne (aS D) in experimentele modellen van synucleopathies. Een transgene muis lijn (M83) overexpressie menselijke A53T aS spontaan ontwikkelen van een dramatische klinische fenotype acht tot 22 maanden oud, gekenmerkt door symptomen zoals gewichtsverlies, uitputting en ernstige motorische beschadiging, werd gebruikt in deze studie. Voor moleculaire analyses van aS D (ziekte-geassocieerde aS) in deze muizen, werd een ELISA ontworpen om specifiek te kwantificeren aS D in zieke muizen. Analyse van het centrale zenuwstelsel in dit muismodel toonde de aanwezigheid van aS D voornamelijk in de caudale hersenen en het ruggenmerg. Er waren geen verschillen in aS D verdeling over de verschillende experimentele omstandigheden die leiden tot klinische ziekte, dat wil zeggen in uninoculated en normaal veroudering transgene muizen en in muizen geënt met hersenen extracten van zieke muizen. De specifieke detectie van aS D immunoreactiviteit met behulp van een antilichaam tegen gefosforyleerd Ser129 aS door ELISA hoofdzaak gecorreleerd met die welke wordt verkregen door middel van Western blot en immunohistochemie. Onverwacht werden vergelijkbare resultaten waargenomen met diverse andere antilichamen tegen het C-terminale deel van aS. De voortplanting van aS D, wat een rol van een "prion-achtige" -mechanisme, kunnen dus gemakkelijk worden gecontroleerd en gekwantificeerd in dit muizenmodel met gebruik van een ELISA benadering.

Inleiding

De meest gebruikte methoden voor het detecteren van ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in experimentele modellen van de ziekte van Parkinson (PD), zoals immunohistochemie of Western blot, zijn tijdrovend en niet kwantitatief. Deze neurodegeneratieve ziekte wordt gekenmerkt door alpha-synucleïne aggregatie voornamelijk in de vorm van inclusies die een geaggregeerde vorm bevatten van het normaal oplosbare presynaptische eiwit αS1,2 (Lewy-lichamen en Lewy-neurieten). Normaal gesproken slechts marginaal gefosforyleerd, wordt αS hypergefosforyleerd op zijn serine 129-residu in deze inclusies3 en kan worden gemonitord door antilichamen die specifiek zijn gericht tegen gefosforyleerd αS op Ser129, waardoor een betrouwbare marker van de pathologie wordt geboden.

Recent onderzoek suggereert dat een "prion-achtige" mechanisme betrokken zou kunnen zijn bij de verspreiding van αS-aggregatie binnen het zenuwstelsel van een getroffen patiënt4,5. Deze studies rapporteerden de versnelling van een synucleïnopathie door het inoculeren van hersenextracten die αSD bevatten in een transgenisch muismodel (M83) dat een A53T-gemuteerde humane αS-eiwit tot expressie brengt die geassocieerd is met een ernstige motorische beperking die optreedt naarmate de muizen ouder worden6. Op dezelfde manier bevestigde intra-cerebrale inoculatie van geaggregeerde recombinante αS in hetzelfde M83-muismodel de versnelling van aggregatie5. De inductie van afzettingen van gefosforyleerd αS is ook gerapporteerd na inoculatie van C57Bl/6 wild-type muizen met ofwel fibrillaire recombinante αS of hersenextracten van menselijke DLB-patiënten7,8. Sacino et al.9 wezen er onlangs op dat na injectie van fibrillaire humane αS, een wijdverspreide en progressieve cerebrale αS-inclusievorming kon worden geïnduceerd in M83-muizen, maar niet in E46K-transgene muizen of niet-transgene muizen waarin geïnduceerde αS-inclusies tijdelijk waren en voornamelijk beperkt waren tot de injectieplaats. Recent onderzoek bij apen bevestigde de verspreiding van αS-aggregaten na inoculatie van PD-afgeleide extracten in diersoorten die dichter bij mensen staan10.

De link tussen αS-alteraties en de ziekte van Parkinson suggereert dat αSD een potentiële biomarker is voor de ziekte van Parkinson11. Een recente studie toonde de detectie van oligomere oplosbare aggregaten van α-synucleïne in menselijk cerebrospinale vloeistof (CSF) en plasma aan als een potentiële biomarker voor de ziekte van Parkinson op basis van een conventioneel sandwich-systeem ELISA met gebruik van dezelfde antilichaam om αS te vangen en detecteren12. Op basis van dezelfde methode werden multimere eiwitten herkend in biologische monsters, inclusief de hersenen, omdat er meerdere kopieën van epitopen aanwezig zijn in de geassembleerde vormen13. Zeer recent werd pathologisch αS in de CSF van patiënten met een bewezen Lewy-body-pathologie gedetecteerd met behulp van zowel een ELISA-kit met een zeer specifiek antilichaam tegen αSD (5G4) als een immunoprecipitatie-assay14. Deze methoden konden patiënten met PD/DLB onderscheiden van andere soorten dementie.

De "prion-achtige" verspreiding van αS-aggregatie werd verder bestudeerd in het transgene muismodel M83 met behulp van een ELISA-benadering die was ontworpen om specifiek αSD te identificeren15. In deze studie rapporteren we het gedetailleerde ELISA-protocol dat werd gebruikt om αSD kwantitatief te detecteren in zieke muizen (of ze nu zijn geïnoculeerd met αSD van zieke M83-muizen of niet) en vooral in de hersengebieden die specifiek worden aangevallen door het pathologische proces in dit transgene M83-muismodel4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures en protocollen bij dieren waren in overeenstemming met de EG-richtlijn 86/609 / EEG van de Raad en geratificeerd door komt, de Franse nationale commissie voor de behandeling van de ethiek in dierproeven (protocol 11-0043). De dieren werden gehuisvest en verzorgd in ANSES goedgekeurd experimentele faciliteiten in Lyon (goedkeuring B 69387 0801).

1. Voorbereiding van de Muizen

  1. Euthanaseren muizen door intraperitoneale injectie van een dodelijke dosis van natriumpentobarbital.
  2. Haal de hele hersenen van de muis schedel en plaats deze in een 35 mm plastic petrischaal op ijs tot extractie.
  3. Pak de cervicale ruggenmerg.
    OPMERKING: Extract aS hetzij van een van de hersenhelften na sagittale snijden of uit ontleed muis hersenen, beschikbaar na de in tabel 1 genoemde experimenten.
Experiment Muizen
Inoculum (brain equivalent) 		Survival periode
(Dpi) 		Mediaan / maximale survival
(Dagen oud) 		aS d detectie met ELISA
/ WB / IHC
1 Geënte muizen 441 ± 166 419/736 8/8
2 Geïnoculeerde muizen (0,2 mg) 150 ± 52 140/241 9/9

Tabel 1. Lijst van experimenten uitgevoerd op M83 muizen. Inentingen werden uitgevoerd op 6 weken voor experiment 2 in de striato-corticale met 20 ul van een hersenhomogenaat van een zieke muis (1% gew / vol in glucose 5%), na anesthesie van 6 weken oude homozygote M83 muizen met 3% isofluraan inademing. dpi: dagen na inoculatie.

2. aS extractie van hersenhelften

  1. Sagittally snijd de hersenen om twee helften te verkrijgen. Weeg elke helft in een ribolysis buis met kogels.
  2. Bereid High Salt (HS) buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatase en protease inhibitor cocktail. Naar High Salt buffer de hersenhelften tot 20% (w / v) homogenaten verkrijgen.
  3. Bereid monsters van de hersenhelften behulp van een mechanische homogenisator bij 6,0 m / s voor 23 sec tweemaal. Na de eerste 23 sec homogenisatie, plaats de buizen met de homogenaten op ijs gedurende 2 minuten vóór de tweede 23-seconden cyclus.
  4. Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij ongemalen hersenen fragmenten elimineren. Herstel de supernatanten, verdelen in 200 gl aliquots en bewaar ze bij -80 ° C voor daaropvolgende analyse ELISA.

3. aS Extraction uit ontleed Brain Regio

  1. Ontleden eenhele brein in een 35 mm plastic petrischaal op ijs met een laag vermogen vergrootglas (8x vergroting) met behulp van twee forcipes waarvan de uiteinden worden bij elkaar gehouden, behalve wanneer het ontleden van de hippocampus. Niet meer dan 10 minuten om de integriteit hersenen te behouden. Plaats de hersenen goede kant naar boven en de volgende gebieden van de hersenen in deze volgorde op te halen:
    1. Afzonderlijke één van beide reukkwabben behulp van een tang geplaatst achter de lamp. Maak het van de hersenen door een neerwaartse beweging. Herhaal deze handeling voor de tweede lamp.
    2. Voorzichtig wig de tang tussen beide cortex en verplaatsen naar voren om dissociatie van de twee cortex vergemakkelijken. Houd de hersenen plaats met een tang, gebruikt een andere voor de cortex te scheiden van de hippocampus.
    3. Plaats de tang 2 mm onder de cortex. Handhaaf een zachte druk op de tang tot de bovenkant van de hippocampus zichtbaar. Trek het eerste deel van de cortex, en herhaal met het tweede deel. Gebruik de tang om de twee te scheiden cortexvanaf de hippocampus en beweegt naar de voorzijde van de hersenen.
    4. Plaats de open tang rond een van de hippocampus. Sluit de tang onder in de hippocampus verwijder voorzichtig, terugwinnen zoveel mogelijk. Herhaal de procedure voor de tweede hippocampus.
    5. Plaats de geopende tang onder een van de striata en voorzichtig scheiden van de hersenen. Gebruik de tang om alle resterende cortex van het striatum te verwijderen. Herhaal deze procedure voor de tweede striatum.
    6. Gebruik de tang voorzichtig drukken van 2 mm van de omtrek van het cerebellum om scheiding van het cerebellum van de hersenen te vergemakkelijken. Plaats de tang net achter het cerebellum en verwijder deze door het bewegen van de tang naar voren.
    7. Gebruik het brede deel van de tang om de mesencephalon om te verhogen om duidelijk te zien waar het samenkomt met de hersenstam. Maak een verticale incisie op de kruising verwijder vervolgens de hersenstam.
    8. Plaats de tang achter het mesencephalon, die iks uit vier ronde structuren. Incise verticaal tot het mesencephalon volledig is gescheiden van de resterende hersenen.
  2. Bereid homogenaten van variable% (gewicht / volume) in HS buffer, afhankelijk van de hoeveelheid beschikbare weefsels, dat wil zeggen 5% homogenaat een gewicht tussen 10 en 30 mg, 10% bij een gewicht tussen 30 en 80 mg, en 20% een gewicht boven 80 mg.
    1. Voeg een voldoende hoeveelheid HS buffer aan de ontlede hersengebieden de verwachte% homogenaat verkregen.
    2. Vortex en controleer of de weefsels volledig ondergedompeld in de HS buffer.
    3. Homogeniseren monsters bereid uit de ontleed hersenen regio's of de cervicale ruggenmerg met een tissue molen bestaat uit een borosilicaat glazen buis en twee stampers, A en B.
    4. Giet elk gebied van de hersenen om direct in de buis worden verpletterd. Plaats de stamper Een in de buis en trek het. Herhaal deze beweging ongeveer tien keer om het weefsel te distantiëren. Maak dan gebruik van een stamper B naar Continue malen van het weefsel met een verdere 20 beweging. Breng de homogenaten in een 1,5 ml buis met een 1 ml transferpipet.
  3. Centrifugeer de monsters bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C geven ongemalen hersenen fragmenten elimineren. Haal de supernatanten, verdeel ze in 200 ul aliquots en bewaar ze bij -80 ° C voor daaropvolgende ELISA analyse.

4. Detectie van aS door ELISA

  1. Verdun de coating antilichamen tegen 0,01 ng / ml. Gebruik een anti-aS konijnen polyklonaal of monoklonaal antilichaam kloon 42 in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO buffer 3 (pH 9,6).
  2. Coat de 96-well microplaten met 100 gl per putje van deze bekledingsoplossing, uitstappen bij 4 ° CO / N. Gebruik de anti-aS konijn polyklonaal antilichaam in de coating oplossing voor het gebruik van ELISA-detectie van antilichamen syn514, kloon 42, LB509, AS11, 4D6 of 8A5. Met de anti-aS monoklonaal antilichaam kloon 42 als een bekledingsoplossingin combinatie met de anti-pSer129 aS detectieantilichaam.
    Opmerking: Zo nodig kunnen de platen bij 4 ° C worden gehouden gedurende één week voordat de ELISA wordt uitgevoerd.
  3. Gebruik een plaatwasser aan de platen vijfmaal wassen met 300 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 (PBST) per putje. Vanaf deze stap verder, incubatie bij KT.
  4. Voeg 200 ul van T20 PBS blokkerende buffer per putje. Schud gedurende 1 uur bij 150 opm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST.
  5. Verdun het homogenaat (verdunning 1: 100 van de 20% homogenaten, 01:50 10% van de homogenaten en 1:25 van de 5% homogenaten in PBST 1% BSA) en voeg 100 ul aan elk putje. Incubeer daarna gedurende 2 uur onder schudden bij 150 rpm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST.
  6. Voeg de verschillende aS detectie antilichamen in PBST met BSA 1% aan het in de Materials List genoemde verdunningen. Incubeer gedurende 1 uur bij 150 opm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST.
  7. Voeg ofwel anti-mouse of anti-konijn IgG HRP-conjugaten verdund 1: 8000 in PBST, aangevuld met 1% BSA gedurende 1 uur onder schudden bij 150 rpm. Was de plaatjes vijfmaal met PBST.
  8. Voeg 100 ul van 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten in het donker onder schudden bij 150 rpm.
  9. Stop de reactie door toevoeging van 100 ul 1 N HCl per put meet de absorptie bij 450 nm met de microplaat reader.
  10. Voor data-analyse, aftrekken van de verkregen in een goed met alle reagentia behalve eventuele muizenhersenen monsters (blanco putje) van de OD-waarden gemeten voor elk van de geanalyseerde monsters OD-waarde.

5. Epitope Mapping

  1. Voer epitoopmapping volgens de beschreven Osman 16 werkwijze. Kort spot peptiden van humaan α-synucleïne sequentie die 12 aminozuren aan nitrocellulose met 10 overlappende aminozuren.
  2. Blok met 50 mM Tris / 150 mM NaCl pH 10 bevattende 0,05% Tween 20 en 5% melkpoeder. Incubeer het antilichaam in blokkerende oplossing bij een concentratie van 2 mg antilichaam per ml bij 2-10 ° CO / N.
  3. Was het membraan driemaal met gebruikmaking van 50 mM Tris / 150 mM NaCl pH 10 met 0,05% Tween 20. Incubeer met geit anti-muis IgG HRP conjugaat. Was het membraan nog vijf keer met dezelfde buffer dan vlek met behulp van een Western blot TMB vlekken kit.

6. Statistische analyse

  1. Gebruik de R software en nlme pakket om mixed-effects regressies uit te voeren om te modelleren OD. Voor elke vergelijking, het uitvoeren van een gemengd effect regressiemodel. Gebruik een fixed effect te onderscheiden symptomatische van asymptomatische groepen.
  2. Gebruik een willekeurig effect om de variabiliteit herhalingen geven voor een bepaalde muis. Controleer homoscedasticiteit door onderzoek van de residuen en indien nodig de variantie functies om het model van variantiestructuur ze binnen de groep fouten in overeenstemming met Pinheiro en Bates 17. Instellen 0,05 als significantiedrempel P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie, de ELISA gebruikte welbepaalde ziektegeassocieerde aS (aS D) in hersen- homogenaten bereid in een buffer met hoog zoutgehalte van zieke muizen M83. Met behulp van een antilichaam specifiek herkent pSer129 aS (p = 0,0074), de ELISA onderscheidt gemakkelijk oude, zieke muizen (> 8 maanden oud) uit jonge (2-5 maanden oud), gezonde M83 muizen (figuur 1). Verscheidene andere antilichamen toonde vergelijkbaar hoog signalen (> 0,6 OD) alleen in hersenhomogenaten van zieke muize...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebruik van een ELISA werd aangetoond om specifiek te detecteren aS D rechtstreeks van muizenhersenen homogenaat gedurende de ziekte bij de M83 transgeen muismodel. Inderdaad, kan dit ELISA gemakkelijk onderscheiden ziek M83 muizen van gezonde M83 muizen met alleen hele hersenhomogenaten in High Salt buffer.

De meest kritische stappen voor succesvolle resultaten met deze ELISA zijn: kunnen ontleden de verschillende gebieden van de muizenhersenen door de nodige handvaardigheid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Damien Gaillard bedanken voor inentingen en de follow-up van dierproeven. Dit werk werd ondersteund door ANSES (Franse agentschap voor Voedsel, Milieu en Occupational Health & Safety) en door een subsidie ​​van de Stichting France Parkinson.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LB509Abcamab27766Detectieantilichaam 1/2.000
AS11Geproduceerd bij AnsesDetectieantilichaam 1/1.000
4D6Abcamab1903Detectieantilichaam 1/2.000
PSer129Abcamab59264Detectieantilichaam 1/3.000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Detectieantilichaam 1/1.000
syn514Abcamab24717Detectieantilichaam 1/500
clone 42BD Biosciences610787Bekledings- en detectieantilichaam (1/2.000)
8A5Verstrekt door Dr. AndersonDetectieantilichaam 1/2.000
polyclonal anti-αsyn antilichaamMilliporeAB5038PBekledingsantilichaam
Anti-muis IgG HRP-conjugaatSouthern Biotech1010-05
Anti-konijn IgG HRP-conjugaatSouthern Biotech4010-05
Geit anti-muis IgG HRP-conjugaatDianova115-035-164
HS-bufferAanpassen op pH 7,5 en bewaren bij 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAanpassen op pH 7,5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Voorraadoplossing 100 mM, giftig
1% fosfatase cocktailPierce78428
1% protease remmer cocktailRoche04 693 132 00150x geconcentreerd
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonaat 50 mM pH 9,6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602,86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293,36 g/L, pH 9,6
Superblock T20 PBS-blokkeringsbufferPierceE6423H10x geconcentreerd
TMBSigmaT0440Gebruikt voor ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Gebruikt voor epitope mapping
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120bewaar op ijs bij deze stap
SlijpbuizenBiorad355-1197
PlaatwasserTecanColumbus Pro
PlaatlezerBioradModel 680
Krachtvergroter met lage vergroting VWR630-10628x vergroting
Forceps Dumont#7WPI14097Voor dissectiestappen
Transferpipet 1ml SamsoSamso043231
1,5 ml buisjesDutscher033290

Referenties

  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van alfa synucle neELISA methodeziektegeassocieerd alfa synucle nebereiding van hersenhomogenaatWestern blot vergelijkingphospho Ser129 antilichaamanalyse van het ruggenmergmesencefalon hersenstamprion achtige propagatie

Gerelateerde artikelen