Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis is een zeer belangrijk modelorganisme geworden voor het bestuderen van ontwikkeling, fysiologie, ziekte en weefselregeneratie bij gewervelde dieren. Een grondig begrip van de betrokken moleculaire en cellulaire mechanismen vereist experimentele tools die induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalroutes mogelijk maken. Daarom hebben wij en anderen onlangs het TetON-systeem aangepast voor gebruik bij zebravissen. Het TetON-systeem faciliteert tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerde genexpressie en we hebben dit hulpmiddel onlangs gebruikt om te onderzoeken naar weefselspecifieke functies van Wnt/beta–catenine-signalering tijdens regeneratie van de staartvin van de zebravis. Hier beschrijven we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om induceerbare, weefselspecifieke genexpressie te bereiken in de regenererende staartvin van de volwassen zebravis. Dit omvat de generatie van stabiele transgene TetActivator- en TetResponder-lijnen, transgen-inductie en technieken voor verificatie van weefselspecifieke genexpressie in de vinnenregenerate. Dus, dit protocol dient als blauwdruk voor het opzetten van een functioneel TetON-systeem in zebravissen en het daaropvolgende gebruik ervan, in het bijzonder voor het bestuderen van vinnenregeneratie.
Inleiding
De zebravis is een gevestigde gewervelde modelorganisme diverse aspecten van de ontwikkeling, fysiologie, ziekte en regeneratie te bestuderen. Met de groeiende goedkeuring van de zebravis als model voor post-embryonale biologische processen, experimentele instrumenten voor induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalwegen zijn steeds belangrijker geworden. Vooral studies naar orgel en aanhangsel regeneratie bij volwassen zebravis hebben geleden onder een gebrek aan tools voor dissectie van de ruimte-tijd eisen van signaalroutes tijdens deze regeneratieve processen.
Momenteel zijn drie verschillende systemen gebr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Generatie van transgene TetActivator Fish Lines
- Generatie van TetActivator construct
- Kloon regulerende sequenties van belang stroomopwaarts van de TetActivator cassette vector # 1247 onder toepassing van standaardtechnieken. Of gebruik recombinatietechnieken een BAC, waarbij de TetActivator cassette (vector # 1180) in het eerste exon van het doelwitgen formule plaatst, en waarbij de Tol2 geïnverteerde repeats worden in de BAC ruggengraat (voor een gedetailleerde recombineering protocol zien 7,8).
- Bereid toxine-vrij plasmide DNA of BAC DNA-preparaten met behulp van commercieel verkrijgbare kits.
- Generatie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een functioneel Teton voor induceerbare weefselspecifieke genexpressie, transgene TetActivator en TetResponder lijnen vast te worden gegenereerd (Figuur 1A). Dit wordt bereikt door microinjecting TetActivator (Figuur 1B - C) of TetResponder (figuur 1E) constructen in vroege zebravisembryo's en daaropvolgende kiemlijn integratie. Functionele TetActivator constructen kunnen ofwel worden gegenereerd door klonering van korte regulerende sequenties (enha.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De volwassen zebravis heeft een verbazingwekkende capaciteit om vele interne organen en appendages succes regenereren. Een goed begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn vereist weefselspecifieke analyse van genfuncties en signaalwegen. Towards dit, de Teton systeem biedt een efficiënt hulpmiddel voor spatiotemporeel gecontroleerde genexpressie in embryonale en volwassen zebravissen. De Teton systeem bouwt en methodologie in dit manuscript beschreven zijn met succes gebruikt in een recent on.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Christa Haase, Doris Weber en Brigitte Korte voor technische ondersteuning. Werk in de Weidinger lab wordt ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 en door de Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via een Oskar-Lapp-Stipendium en Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | bijv. Leica, Zeiss | varieert per fabrikant | om fluorescente weefselsecties te beeld |
| Confocal microscope | bijv. Leica, Zeiss | varieert per fabrikant | om fluorescente weefselsecties te beeld |
| Cryostat | bijv. Leica, Thermo-Scientific | varieert per fabrikant | voor cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | gebruik 1/5.000 in PBS voor visualisatie van kernen |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | bereid voorraden in 50% EtOH op 50 mg/ml (97 mM) voor TetResponder inductie |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 voor fixatie |
| 1x Fosfaat-buffer zoutoplossing (PBS) | 1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5 | ||
| 1x Fosfaat-buffer zoutoplossing + Tween 20 (PBT) | 1x PBS met 0,1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesie microscoopglaasjes | Thermo Scientific | 1014356190 | voor het verzamelen van weefselsecties |
| Stereo fluorescent microscope | bijv. Leica, Zeiss | varieert per fabrikant | voor fluorescentie-gebaseerde genotypering |
| Thermocycler | bijv. Biorad, Applied Biosystems | varieert per fabrikant | voor PCR-gebaseerde genotypering |
| Weefselvriesmedium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | voor inbedding van weefselmonsters |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoaat-methaan sulfonaat/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | voor anesthesie gebruik bij 1 mg/ml in E3 embryo medium |
Referenties
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
