Methodenartikel

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

29 april 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Samenvatting

Traditionele vaccinadjuvanten, zoals alumina, roepen suboptimale CD8+ T-celreacties op. Om deze grote uitdaging in vaccinontwikkeling aan te pakken, zijn verschillende nanodeeltjessystemen ontworpen om kenmerken van pathogenen na te bootsen om de antigeenafgifte naar lymfeklieren te verbeteren en de antigeenopname door antigeenpresenterende cellen te verhogen, wat leidt tot nieuwe vaccinformuleringen geoptimaliseerd voor het induceren van antigeenspecifieke CD8+ T-celreacties. In dit artikel beschrijven we de synthese van een “pathogeen-nabootsend” nanodeeltjessysteem, aangeduid als interbilayer-crosslinked multilamellaire vesikels (ICMV's) die kunnen dienen als een effectieve vaccindrager voor gezamenlijke afgifte van subdeenheidantigenen en immunostimulerende agentia en het oproepen van krachtige cytotoxische CD8+ T-lymfocyt (CTL) reacties. We beschrijven methoden voor het karakteriseren van de hydrodynamische grootte en oppervlaktelading van vaccinnanodeeltjes met dynamisch lichtverstrooiing en zetapotentiaalanalyse en presenteren een op confocale microscopie gebaseerde procedure om nanodeeltje-gemedieerde antigeenafgifte naar lymfeklieren te analyseren. Verder laten we een nieuwe bioluminescentie hele-dierbeeldvormingstechniek zien die gebruik maakt van adoptieve overdracht van luciferase-expresserende, antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in ontvangende muizen, gevolgd door vaccinatie met nanodeeltjes, wat non-invasieve ondervraging van de expansie en verkeerspatronen van CTL's in real time mogelijk maakt. We beschrijven ook tetrameerkleuring en flowcytometrische analyse van perifere bloedmononucleaire cellen voor longitudinale kwantificering van endogene T-celreacties bij muizen gevaccineerd met nanodeeltjes.

Inleiding

Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen 1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen presenterende cellen (APC's) die in lymfe nodes (LNS), waardoor het maximaliseren immuunstimulatie en activering 3-5. In dit rapport beschrijven we de synthese van een "pathogeen-nabootsen" nanodeeltjes systeem, genaamd interbilayer-verknoopt multilamellaire blaasjes (ICMVs), die al eerder hebben aangetoond als een krachtige vaccin platform voor uitlokken van krachtige cytotoxische T lymfocyt (CTL) en humorale immuunresponsen bij zowel systemische als mucosale weefselcompartimenten 6-9. In het bijzonder, de gerealiseerde vaccinatie met ICMVs aanzienlijk serum IgG niveaus versterkt tegen een malaria-antigeen, in vergelijking met vaccinatie met conventionele adjuvantia (bijvoorbeeld, aluin en Montanide) 7 en ook opgewekt potente CTL-responsen tegen tumorcellen en virale uitdaging modellen in muizen 9. Hier, met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje systeem beschrijven we methoden voor de karakterisering van het vaccin nano-formuleringen, met inbegrip van de deeltjesgrootte en zetapotentiaal metingen en het bijhouden van de deeltjes mensenhandel aftappen LNS (DLNS) gebruik te maken van confocale beeldvorming van cryosectioned weefsels 7. Bovendien presenteren we een hele dier imaging-gebaseerde werkwijze voor het analyseren expansie van CTL-responsen bij muizen na adoptieve overdracht van luciferase-expressie antigeenspecifieke CD8 + T-cellen 9,10. Ten slotte hebben we deschrijver tetrameer kleuring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor longitudinaal kwantificatie van endogene T cel responsen in muizen gevaccineerd met nanodeeltjes 6,9.

ICMVs zijn een lipide-gebaseerde nanopartikelformulering gesynthetiseerd door gecontroleerde fusie van eenvoudige liposomen in multilamellaire structuren, die vervolgens chemisch worden gestabiliseerd door verknoping-maleïmide gefunctionaliseerde fosfolipide kopgroepen binnen lipide lagen met dithiol crosslinkers 6. Zodra ICMVs worden gesynthetiseerd, kan een klein deel van nanodeeltjes worden gebruikt om deeltjesgrootte en zeta potentiaal (bijv oppervlaktelading van de deeltjes) met dynamische lichtverstrooiing (DLS) systeem en een zeta potentiaal analyzer bepaald. DLS maatregelen veranderingen in de lichtverstrooiing in deeltjessuspensies, waardoor de bepaling van de diffusiecoëfficiënt en de hydrodynamische grootte van de deeltjes 11. Het bereiken van consistente deeltjesgrootte van partij tot partij synthese is van cruciaal belangaangezien deeltjesgrootte een van de belangrijkste factoren die van invloed lymfatische drainage vaccin deeltjes DLN en daaropvolgende cellulaire opname door APCs 12,13. Bovendien kan zeta potentiaal worden verkregen door meting van de deeltjessnelheid bij een elektrische stroom wordt aangelegd, met behulp waarvan de elektroforetische mobiliteit van deeltjes en deeltjes oppervlaktelading 11 toelaat. Consistente zeta potentieel waarden van de deeltjes is belangrijk omdat oppervlakte lading van de deeltjes bepaalt colloïdale stabiliteit, die een directe impact op deeltjesdispersie tijdens opslag en na de in vivo toediening 14,15 heeft. Om het deeltje lokalisatie DLN's volgen, kan ICMVs met de gewenste fluoroforen zoals lipofiele kleurstoffen en covalent gelabeld antigenen worden geëtiketteerd. Na immunisatie kunnen muizen worden gedood op verschillende tijdstippen DLN gereseceerd, cryosectioned en geanalyseerd met confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van lymfatische draining van zowel de nanodeeltjes vaccin vervoerders en antigeen DLN. De weefselcoupes kunnen bovendien worden gekleurd met fluorescent gemerkte antilichamen en gebruikt om meer informatie te verkrijgen, zoals soorten cellen verbonden met het antigeen en de vorming van germinale centra zoals we eerder hebben 7 getoond.

Zodra het deeltje synthese wordt geoptimaliseerd en handel met de DLN wordt bevestigd, is het belangrijk uitlokken van in vivo CTL expansie valideren. Om uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen te analyseren in respons op nanodeeltjes vaccinatie hebben we een model antigeen, ovalbumine (OVA) gebruikt, met OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) immunodominante CD8 + T-celepitoop, dat gedetailleerde immunologische analyses toelaat antigeen-specifieke T cel responsen voor de eerste vaccinontwikkeling 16,17. In het bijzonder om de dynamiek van expansie en migratie van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen ondervragen, hebben we gegenereerd eendubbel transgeen muismodel door kruising firefly luciferase-expressie transgene muizen (Luc) met OT-I transgene muizen die CD8 + T-cellen met T-celreceptor (TCR) specifiek voor SIINFEKL (in samenwerking met H-2Kb) bezitten. Uit deze OT-I / Luc muizen-luciferase expressie, OT-I CD8 + T-cellen kunnen worden geïsoleerd en voorbereid voor adoptieve overdracht naïeve C57BL / 6-muizen. Eenmaal gezaaide zal succesvolle immunisatie met OVA bevattende nanodeeltjes resulteren in uitzetting van de overgedragen T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het volgen van de bioluminescentie signaal met een geheel dier beeldvormingssysteem 9,10. Deze niet-invasieve whole-body imaging techniek is gebruikt met andere virale en tumor antigenen in het verleden 18-20, openbaren processen van T-cel expansie in lymfoïde weefsels en verspreiding perifere weefsels in een longitudinale wijze.

Aanvullende analyses van adoptief overgedragen antigeenspecifieke CD8 + T-cellen, endogenoons T cel responsen na vaccinatie kunnen worden onderzocht met peptide-major histocompatibility complex (MHC) tetrameer assay 21, waarbij een peptide-MHC tetrameer complex, bestaande uit vier-fluorofoor gelabeld MHC-klasse I moleculen geladen met peptide-epitopen wordt toegepast TCR label en CD8 + T-cellen binden in een antigeen-specifieke wijze. Het peptide-MHC tetrameer assay kan worden uitgevoerd in terminal necropsie onderzoeken antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in lymfoïde en perifere weefsels te identificeren of longitudinale studies met perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit seriële bloedafnames. Na kleuren lymfocyten met peptide-MHC tetrameer, flowcytometrie analyse uitgevoerd voor gedetailleerde analyses op het fenotype van CTLs of kwantificatie van de frequentie tussen CD8 + T-cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) aan de Universiteit van Michigan en uitgevoerd volgens het vastgestelde beleid en richtlijnen.

1. Synthese en karakterisering van ICMVs Co-geladen met eiwitantigeen en Adjuvant Moleculen

  1. Meng 1: 1 molaire verhouding van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) boterzuuramide] (MPB) in chloroform, waarbij het ​​totale lipide bedrag 1,26 umol per batch (dwz 500 ug DOPC en 630 ug MPB) in een 20 ml glazen flesje (diameter = 28 mm en hoogte = 61 mm).
  2. Voeg lipofiele geneesmiddelen, zoals monofosforyllipide A (MPLA) of lipofiele kleurstoffen (bijvoorbeeld deed), aan de lipide oplossing gewenste concentratie. Grondig verwijder het organische oplosmiddel door spoelen met extra droge nitrogen gas en het plaatsen van de monsters onder vacuüm O / N.
  3. Hydrateren lipide film door toevoeging van 200 ui 10 mM bis-tris-propaan (BTP, pH 7,0) bevattende wateroplosbare geneesmiddelen (bijv eiwitantigenen). Vortex gedurende 10 sec elke 10 min gedurende 1 uur bij KT.
  4. Breng de inhoud van de glazen flacon in een 1,5 ml microcentrifugebuis, plaats monsters in een ijs-waterbad en ultrasone trillingen continu gedurende 5 minuten met behulp van de intensiteit van 40% instelling op een 125 W / 20 kHz probe-tip sonicator.
  5. Voeg 4 pi van 150 mM dithiothreitol (DTT) aan elke batch (werkconcentratie 2,4 mM), vortex en kort met een tafelblad centrifuge microcentrifuge.
  6. Voeg 40 ul van 200 mM CaCl 2 en meng met de pipet (werkconcentratie 33 mM). Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 1 uur tot verknoping van MPB-bevattende lipide lagen met DTT toe.
  7. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 15 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in 200 ul van ddiH 2 O.
  8. Herhaal stap 1.7 en centrifuge opnieuw na de tweede ddiH 2 O wassen om CaCl2, gereageerde DTT en ingekapseld lading materialen te verwijderen uit het bovenstaande.
  9. Bereid 10 mg / ml 2 kDa polyethyleenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendeer elk ICMV monster in 100 pl PEG-SH-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
  10. Voer twee ddiH 2 O wassen (stap 1.7) en resuspendeer de laatste ICMV pellet in PBS en bewaar bij 4 ° C. Voor gebruik meng de ICMV suspensie, als deeltjes naar de bodem na langdurige opslag.
  11. Voor de karakterisering van deeltjes verwijdert een kleine hoeveelheid (~ 10%) van ICMVs uit elke partij en verdun afzonderlijk in een totaal volume van 1 ml ddiH 2 O. Plaats een enkel monster in een Zetasizer en meet deeltjesgrootte polydispersiteit index en zeta potentiaal van de monsters met een DLS en zeta potentiaal meetsysteem (volgens het protocol van de fabrikant).

2. Onderzoek van lymfkliertest Aftappen van fluorescentie-gelabeld ICMVs met confocale microscopie

  1. Bereiding van ICMVs geladen met fluorofoor-gelabelde antigen en lipofiele fluorescente kleurstof
    1. Bereid fluorofoor-gelabeld eiwit, zoals ovalbumine omgezet met Alexa Fluor 555-succinimidyl ester, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Om ICMVs gelabeld met fluorofoor in de lipide schaal bereiden, voeg lipofiele fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) tijdens de bereiding van de lipide film (Step 1,2) en 0,05% mol lipide bedrag. Voor lipide film hydratatie (stap 1,3), gebruik buffer bevattende fluorofoor-gelabelde antigen, en volledig ICMV synthese zoals beschreven in stappen 1,4-1,11.
  2. Subcutane toediening van nanodeeltjes op de staart basis
    1. Verdoven muis met behulp van een gecontroleerde stroom verdamper voorzien van een inductie kamer utilizing 3% isofluraan en 1,5 l / min zuurstof stroom volgens een erkende IACUC dier protocol. Zodra de muis onbewust, de volgende stappen snel voorafgaande aan de narcose dragen buiten naar optimale toegang tot de plaats van de injectie mogelijk te maken en ongemak voor het dier. Alternatief, gebruik dan een goede montage neuskegel anesthesie te onderhouden. Indien muizen worden verdoofd langer dan 5 minuten, de ogen smeermiddel noodzakelijk irritatie te voorkomen na de procedure.
    2. Spuit de basis van de staart met 70% ethanol te zuiveren en bevochtig het pelsdeel het natte haar een klein stukje zichtbare huid, die kan worden gebruikt om de naald onder de huid zichtbaar bloot.
    3. Bereid injecteren van partikels suspensie die gewenste hoeveelheid antigeen en adjuvans per 100 gl vaccinatiedosis in PBS (bijvoorbeeld 10 ug OVA en 0,3 pg MPLA per 100 gl injectiedosis werd in het verleden 6,9).
    4. Teken het deeltje schorsing into een spuit met een 27-29 G naald en breng de naald in de basis van de staart (~ 5 mm van de haarlijn) met de schuine naar boven en injecteer 50 pl van de deeltjessuspensie 22.
    5. Wacht een paar seconden voor de druk gelijk aan overmatige back-flow te voorkomen en trek de naald uit. Herhaal de injectie aan de andere zijde van de staartbasis zowel aftappen inguïnale LNS richten.
  3. Voorbereiding van de lymfeklieren cryosecties en onderzoek met confocale microscopie.
    1. Euthanaseren de muis met CO 2 stikken, gevolgd door geïnduceerde pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Extract inguïnale LNS volgens proefopzet aangetoond Bedoya 23 en was het bloed door het plaatsen van de weefsels in 1 ml 4 ° C PBS.
    2. Absorberen de PBS uit de weefsels met weefsels en plaats weefsel in weefsel cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) voorgevulde naar de top met oktober bevriezing medium 24. Snap bevriezen de tissue blok in vloeibare stikstof voor 30 sec. Als alternatief, plaats weefsel blok op droog ijs gedurende 30 min. Bewaar ingevroren weefsel in -80 ° C vriezer.
    3. Knip weefselcoupes 5-10 pm dik in een cryostaat ingesteld op -20 ° C 24.
    4. Indien nodig, voeren immunofluorescentie etikettering, en onderzoekt de weefsel met confocale microscopie als eerder aangetoond 24.

3. Controle Uitbreiding van antigeen-specifieke, Luciferase-expressie CD8 + T-cellen na vaccinatie met gehele nanodeeltjes Animal Imaging

  1. Isolatie van OVA-specifieke 257-264, luciferase-expressie CD8 + T-cellen van OT-I / Luc transgene muizen
    1. Euthanaseren een OT-I / Luc transgene muis met CO 2 stikken en leiden tot een pneumothorax volgens een IACUC goedgekeurd dier protocol. Oogst de milt op een steriele wijze door naar de peritoneale holte en zorgvuldig losmaken van het weefsel van de alvleesklier 23 enplace in 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS voor overdracht naar weefselkweek kap.
    2. Plaats de milt op een 70 micrometer nylon zeef over een 50 ml conische centrifugebuis (tot 3 milt tegelijk). Met behulp van een zuiger van een injectiespuit 3 ml, slijpen de cellen door de zeef.
    3. Was de zuiger en de zeef met PBS + 2% FBS en gooi. Breng het totale volume op 10 ml / milt in de 50 ml buis, neem een ​​monster van de celsuspensie te tellen met een hemocytometer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
    4. Met behulp van een commercieel verkrijgbare kit magnetische negatieve selectie, isoleer het CD8 + T-celpopulatie volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Na wassen cellen met PBS, tel het aantal geïsoleerde CD8 + T-cellen. Om de zuiverheid van de geïsoleerde CD8 + T-cellen bepalen, incubeer ~ 20.000-30.000 cellen in 20 ul van muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) gedurende 10 min en voeg 20 ul van αCD8-APC antilichamen (0,005 mg / ml) en incubeer 30 min. Perform alle incubaties bij 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Voer flowcytometrische analyse 25.
  2. Adoptieve overdracht van geïsoleerde CD8 + T-cellen en visualisatie van hun expansie na vaccinatie
    1. Voer adoptieve overdracht van geïsoleerde OT-I / Luc CD8 + T cellen in naïeve C57BL / 6 muizen door toedienen van 1-10 x 10 5 cellen in 200 ul volume PBS via intraveneuze injectie in de staartader 22 (dag -1). Gezien het feit dat bont en zwarte vlekken op de huid in C57BL / 6 muizen kunnen interfereren met de lichtgevende signaal, geschoren albino C57BL / 6 muizen zijn ideaal voor deze studies.
    2. Na een dag (dag 0), het beheer van het vaccin zoals eerder beschreven (paragraaf 2.2).
    3. Dien 150 mg per kg muis luciferine lichaamsgewicht intraperitoneaal in een 300 ui volume van PBS. Na 10 min, verdoven de muizen met isofluraan (zoals in stap 2.2.1) en visualiseren OT-I / Luc CD8 + T-cellen door het verwerven van de bioluminescentie signaal voor 5-10 min wet een hele dier imaging-systeem (IVIS, zie Wilson 26 voor gedetailleerde instructies). Herhaal als nodig is voor longitudinale studies.

4. Peptide-MHC tetrameer kleuring van PBMC voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen

Opmerking: Het volgende protocol procedure kan worden uitgevoerd op basis van C57BL / 6-muizen adoptief overgedragen met OT-I / Luc CD8 + T cellen of C57BL / 6 muizen zonder de adoptieve overdracht.

  1. Op een gewenst tijdstip na vaccinatie verzamel ongeveer 100 pl bloed (4-6 druppels) van muizen via submandibular bloeden techniek 27 in een buis bekleed met K 2 EDTA en keer herhaaldelijk om stolling te voorkomen.
  2. Breng 100 pi van bloed naar een microcentrifuge buis, voeg 1 ml lysisbuffer, en incubeer gedurende 2-3 minuten om rode bloedcellen (RBCs) te verwijderen. Centrifuge monsters gedurende 5 minuten bij 1500 xg en verwijder het supernatant. Indien de pellet nogppears rood (met vermelding van onvolledige verwijdering van RBC), herhaal de lysis stap met een korte incubatie (<1 min) van lysisbuffer.
  3. Was de resterende PBMCs met 1 ml FACS-buffer (PBS + 1% w / v BSA) en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 min.
  4. Zuig het supernatant en resuspendeer de sample in 20 gl muis CD16 / 32 antilichaam (0,025 mg / ml) om niet-specifieke en FcR bemiddelde antilichaam blokkeert binding. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Transfer cellen van microcentrifugebuisjes in 4 ml ronde bodem FACS buizen. Voeg 20 ul van H-2Kb OVA tetrameer-PE SIINFEKL-oplossing volgens de specificaties van de fabrikant aan elk monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  6. Bereid de antilichaam cocktail (bv αCD8-APC, αCD44-FITC en αCD62L-PECy7 antilichamen (0,005, 0,005 en 0,002 mg / ml concentratie, respectievelijk)). Voeg 20 ul aan elk experimenteel monster en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Bereid enkele fluorofoor controles door laBeling cellen met elk fluorofoor gelabeld tetrameer of antilichaam op het hierboven aangegeven concentratie.
  7. Was 2 maal met FACS-buffer en resuspendeer de uiteindelijke pellet in FACS buffer die 2 ug / ml DAPI. De cellen zijn nu gereed voor flowcytometrie-analyse (gegevens en voorbeelden zijn te vinden in Scheffold 25).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De stappen betrokken bij de synthese van ICMVs zijn aangegeven in figuur 1 6. Kort wordt een lipide film die één lipofiele geneesmiddelen of fluorescente kleurstoffen gehydrateerd in aanwezigheid van hydrofiele geneesmiddelen. Divalente kationen, zoals Ca2 +, worden toegevoegd om fusie van anionische liposomen multilamellaire vesicles rijdt. Dithiol crosslinker, zoals DTT, is op "nieten"-maleïmide gefunctionaliseerde lipiden toegevoegd op apposing lipide lagen, en ten slo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol in dit artikel beschrijft de synthese en karakterisering van een nieuwe lipide-gebaseerde nanodeeltjes systeem, genaamd ICMVs en geeft het proces valideren doeltreffendheid van nanodeeltjes gebaseerde vaccinpreparaten antigeen-specifieke CD8 + T-cel responsen te induceren. ICMV synthese in elke waterige toestand, hetgeen een belangrijk voordeel ten opzichte van andere gebruikelijke polymere nanodeeltjes systemen (bijvoorbeeld poly (lactide-co-glycolide) zuurdeeltjes), die typisch vereist organische...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Perkin Elmer mits de productie gemaakte kosten tijdens de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen 1K22AI097291-01 en door het National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR000433. We hebben ook erkennen Prof. Darrell Irvine aan het MIT en Prof. Matthias Stephan bij Fred Hutchinson Cancer Center voor hun bijdrage aan de eerste werkzaamheden op het vaccin nanodeeltjes en OT-I / Luc transgene muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Synthese en karakterisering van ICMV's geco-loaded met proteïne-antigeen en adjuvant moleculen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[4-(p-maleïmidophenyl)butyramide] (natriumzout) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.850375
Monofosforyl Lipid A (Synthetisch) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 ml glazen injectieflaconWheaton0334125D
Symphny Vacuum OvenVWR414004-580
Ovalbumine (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propaan (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Thiolated Polyethyleen Glycol (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer CuvettesMalvernDTS1070
2. Onderzoek van lymfeklierdrainage van fluorescentie-gelabelde ICMV's met confocale microscopie
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodikarbocyanine, 4-Chloorbenzenesulfonaat Zout (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimide ester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT vriesmedium VWR25608-930
Tissue CryomoldsVWR25608-922
3. Monitoring van de uitbreiding van antigeen-specifieke, luciferase-expresserende CD8+ T-cellen na nanopartikelvaccinatie met hele dierbeelden
C57BL/6 muizenJackson000664
Albino C57BL/6 muizenJackson000058
OT-1 C57BL/6 muizenJackson003831
70 μm nylon zeefBD352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation KitStemCell19853
IVIS® hele dierbeelden systeemPerkin Elmer
4. Peptid-MHC tetrameerkleuring van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) voor flowcytometrische analyse van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen
K2EDTA buizenBD365974
ACK lysis bufferLife TechnologiesA10492-01 
Anti-CD16/32 Fc BlokEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetrameerMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn Flow CytometerBeckman Coulter
FlowJo SoftwareFlowJo

Referenties

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antigeenspecifieke CD8 T cellenflowcytometriebioluminescentie imagingtetrameerkleuringmononucleaire cellen uit perifeer bloeddynamische lichtverstrooiingzeta potentiaalanalyseconfocale microscopie

Gerelateerde artikelen