We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Traditionele vaccinadjuvanten, zoals alumina, roepen suboptimale CD8+ T-celreacties op. Om deze grote uitdaging in vaccinontwikkeling aan te pakken, zijn verschillende nanodeeltjessystemen ontworpen om kenmerken van pathogenen na te bootsen om de antigeenafgifte naar lymfeklieren te verbeteren en de antigeenopname door antigeenpresenterende cellen te verhogen, wat leidt tot nieuwe vaccinformuleringen geoptimaliseerd voor het induceren van antigeenspecifieke CD8+ T-celreacties. In dit artikel beschrijven we de synthese van een “pathogeen-nabootsend” nanodeeltjessysteem, aangeduid als interbilayer-crosslinked multilamellaire vesikels (ICMV's) die kunnen dienen als een effectieve vaccindrager voor gezamenlijke afgifte van subdeenheidantigenen en immunostimulerende agentia en het oproepen van krachtige cytotoxische CD8+ T-lymfocyt (CTL) reacties. We beschrijven methoden voor het karakteriseren van de hydrodynamische grootte en oppervlaktelading van vaccinnanodeeltjes met dynamisch lichtverstrooiing en zetapotentiaalanalyse en presenteren een op confocale microscopie gebaseerde procedure om nanodeeltje-gemedieerde antigeenafgifte naar lymfeklieren te analyseren. Verder laten we een nieuwe bioluminescentie hele-dierbeeldvormingstechniek zien die gebruik maakt van adoptieve overdracht van luciferase-expresserende, antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in ontvangende muizen, gevolgd door vaccinatie met nanodeeltjes, wat non-invasieve ondervraging van de expansie en verkeerspatronen van CTL's in real time mogelijk maakt. We beschrijven ook tetrameerkleuring en flowcytometrische analyse van perifere bloedmononucleaire cellen voor longitudinale kwantificering van endogene T-celreacties bij muizen gevaccineerd met nanodeeltjes.
Inleiding
Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen 1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) aan de Universiteit van Michigan en uitgevoerd volgens het vastgestelde beleid en richtlijnen.
1. Synthese en karakterisering van ICMVs Co-geladen met eiwitantigeen en Adjuvant Moleculen
- Meng 1: 1 molaire verhouding van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) boterzuuramide] (MPB) in chloroform, waarbij het totale lipide bedrag 1,26 umol per batch (dwz 500 ug DOPC en 630....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De stappen betrokken bij de synthese van ICMVs zijn aangegeven in figuur 1 6. Kort wordt een lipide film die één lipofiele geneesmiddelen of fluorescente kleurstoffen gehydrateerd in aanwezigheid van hydrofiele geneesmiddelen. Divalente kationen, zoals Ca2 +, worden toegevoegd om fusie van anionische liposomen multilamellaire vesicles rijdt. Dithiol crosslinker, zoals DTT, is op "nieten"-maleïmide gefunctionaliseerde lipiden toegevoegd op apposing lipide lagen, en ten slo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol in dit artikel beschrijft de synthese en karakterisering van een nieuwe lipide-gebaseerde nanodeeltjes systeem, genaamd ICMVs en geeft het proces valideren doeltreffendheid van nanodeeltjes gebaseerde vaccinpreparaten antigeen-specifieke CD8 + T-cel responsen te induceren. ICMV synthese in elke waterige toestand, hetgeen een belangrijk voordeel ten opzichte van andere gebruikelijke polymere nanodeeltjes systemen (bijvoorbeeld poly (lactide-co-glycolide) zuurdeeltjes), die typisch vereist organische.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Perkin Elmer mits de productie gemaakte kosten tijdens de publicatie van dit artikel.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen 1K22AI097291-01 en door het National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR000433. We hebben ook erkennen Prof. Darrell Irvine aan het MIT en Prof. Matthias Stephan bij Fred Hutchinson Cancer Center voor hun bijdrage aan de eerste werkzaamheden op het vaccin nanodeeltjes en OT-I / Luc transgene muizen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Synthese en karakterisering van ICMV's geco-loaded met proteïne-antigeen en adjuvant moleculen | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[4-(p-maleïmidophenyl)butyramide] (natriumzout) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monofosforyl Lipid A (Synthetisch) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glazen injectieflacon | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumine (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propaan (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethyleen Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Onderzoek van lymfeklierdrainage van fluorescentie-gelabelde ICMV's met confocale microscopie | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodikarbocyanine, 4-Chloorbenzenesulfonaat Zout (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimide ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT vriesmedium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring van de uitbreiding van antigeen-specifieke, luciferase-expresserende CD8+ T-cellen na nanopartikelvaccinatie met hele dierbeelden | |||
| C57BL/6 muizen | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 muizen | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 muizen | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon zeef | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® hele dierbeelden systeem | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptid-MHC tetrameerkleuring van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) voor flowcytometrische analyse van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen | |||
| K2EDTA buizen | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Blok | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetrameer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
Referenties
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
