HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van Plasmodium Rhoptry Eiwitten

Summary

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

Abstract

Malaria veroorzaakt aanzienlijke wereldwijde morbiditeit en mortaliteit. Geen routine vaccin is momenteel beschikbaar. Een van de belangrijkste redenen voor het ontbreken van een vaccin is het probleem van het identificeren van geschikte vaccin gegadigden. Malaria proteïnen uitgedrukt in prokaryote en eukaryote cellen gebaseerde expressiesystemen worden slecht geglycosyleerd algemeen onoplosbaar ondergaan onjuiste vouwing leidt tot verminderde immunogeniciteit. De tarwekiemen, konijn reticulocytlysaat en Escherichia coli lysaat cel vrije expressie systemen worden momenteel gebruikt voor de expressie van malaria eiwitten. De lengte van de expressieperiode en oneigenlijk glycosylering van eiwitten nog steeds een uitdaging. We tonen expressie van Plasmodium eiwitten in vitro gebruik van HeLa gebaseerde mobiele vrije expressie systemen, aangeduid als "in vitro menselijke cel vrije expressie systemen". De 2 HeLa gebaseerd celvrije expressiesystemen transcriberen mRNA in 75 min en 3 pi transcribed mRNA is voldoende om eiwitten te vertalen in 90 min. De 1-staps expressiesysteem is een transcriptie- en translatie-gekoppelde expressiesysteem; de transcriptie en co-translatie voorkomt in 3 uur. De werkwijze kan ook worden uitgebreid voor 6 uur door extra energie. In de 2-staps expressiesysteem, wordt mRNA eerst getranscribeerd en vervolgens aan het translatiemengsel voor eiwitexpressie. We beschrijven hoe malaria eiwitten tot expressie; een hydrofobe PF3D7_0114100 Maurer's Gespleten - 2 transmembraan (PfMC-2TM) eiwit, een hydrofiele PF3D7_0925900 eiwit en een gordeldier herhalingen bevatten eiwit PF3D7_1361800, met behulp van de HeLa gebaseerde cel vrije expressie systeem. De eiwitten worden tot expressie gebracht in microvolumes gebruik 2 stappen en stap 1 expressie strategieën. Een werkwijze voor affiniteitszuivering 25 gl eiwitten aanwezig gebruikmaking van de in vitro humane celvrij expressiesysteem wordt ook beschreven zuiveren. Eiwitrendement wordt bepaald door de Bradford test en de tot expressie gebrachteen gezuiverde eiwitten kan worden bevestigd door Western blot analyse. Expressie gebrachte recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt voor immunisaties, immunoassays en eiwitsequentie.

Introduction

In malaria onderzoek, blijft de expressie van immunogène eiwitten met behulp van prokaryote of eukaryote cellen gebaseerde systemen een uitdaging. De AT rijkdom van Plasmodium genoom en onbekende posttranslationele mechanismen ^14,7, bij aan de problemen geassocieerd met het verkrijgen van correct gevouwen en immunogene eiwitten voor antilichaamproductie en vaccine studies. Prokaryote systemen zoals Escherichia coli werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie. Prokaryotische systemen zijn lage kosten, efficiënte, produceren hoge opbrengsten van recombinante eiwitten en meerdere kloonvectoren. Host E. coli-cellen zijn eenvoudig te transformeren en cellen snel groeien. Echter, prokaryotische systemen hebben beperkingen zoals gebrek aan aminozuursubstitutie, post-translationele modificatie, besmettingsgevaar, heterogene producten en accumulatie van recombinante eiwitten in insluitingslichamen ^24.

In eenonderzoek van Mehlin et al. (2006), 1000 open reading frames (ORF) hadden. Ongeveer 7% van de tot expressie gebrachte eiwitten waren oplosbaar ^14. De onoplosbaarheid waargenomen wordt veroorzaakt door de voorgespannen aard van de genen en de hoge frequentie van codons die idealiter worden gebruikt door de Plasmodium AT rijke genoom ^14. Een alternatieve strategie om dit probleem te ondervangen is ontwikkeld door plasmiden en gastheercellen die tRNAs dat zeldzame codons of codons die overeenkomen met de frequenties ³ herkennen. Zelfs na het uitvoeren van deze optimalisaties, zeer kleine porties eiwitten aanwezig als oplosbare, actieve immunogene ^14. De cel-vrije expressie systemen bevatten alle componenten die nodig zijn voor de transcriptie en translatie zoals ribosomen, initiatie factoren, elongatie factoren (vertalingen factoren), tRNA en aminoacyl-tRNA synthetasen. Zowel transcriptie en translatie reacties worden gekoppeld eenstapsprocedure ^11,29. De transcription reactie wordt uitgevoerd in een rol voor geschikte hoeveelheid mRNA geïncubeerd met translatie machinerie in een ander buisje ^11,29. Hoewel deze werkwijzen succesvol Plasmodium sp. Eiwitexpressie zijn een groot nadeel is de duur van eiwitexpressie, wat ongeveer 22 uur ^29. Daarnaast zijn de hoge kosten van benodigdheden voor opneming in de protocollen ^29, de arbeidsintensieve preparaten van het cellysaat en inconsistenties in bestanddeel preparaten, maken deze systemen onbereikbaar. De belangrijkste focus van de onderzoekers voor de ontwikkeling van een cel vrije expressie systeem is afhankelijk van factoren zoals de snelle genetische modificatie, snel rendement met een hoge concentraties en straight forward lysaat voorbereidingen ^1.

Eukaryote systemen zoals gist, zoogdiercellijnen, baculovirus expressiesysteem gemedieerd, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum en parasitaire expressiesystemen such zoals Leishmania werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie ^7. Eukaryote systemen delen fylogenetische relatie en dus ook de kenmerken zoals glycosylering, acylering, de vorming van disulfidebinding, chaperone interactie, proteolyse en sub-cellulaire verkokering te delen. Eiwitsecretie gebeurtenissen in eukaryoten voorkomen accumulatie en verlaagt de toxiciteit voor expressie systemen ^13. Het gebruik van gistsystemen heeft de voorkeur aangezien zij geschikt zijn voor eiwitexpressie op grote schaal en voor het verkrijgen van hoge opbrengsten ^4. Twee P. falciparum eiwitten PfCP-29 en Pvs25 werden geproduceerd met behulp van de gist systeem ^4. Echter, een belangrijk nadeel in de synthese van de meeste eiwitten was onregelmatig N en O-glycosylering patronen verkeerde vouwing en truncatie van eiwitten uit hun natieve vorm ^4.

Het gebruik van zoogdiercellen voor de synthese van recombinante eiwitten is arbeidsintensief en wordt expensive stabiele recombinante cellijnen ⁴ te handhaven. Daarom zijn zoogdiercellen beperkt voor de analyse van eiwit signalering, eiwitinteracties en parasiet-gastheer interacties maar ook voor het testen van DNA-vaccins ^4. The Human DNA en mRNA in vitro eiwitexpressie celvrij systeem hierin beschreven is een HeLa-cellen afgeleide-zoogdierlijke systeem dat eiwitten tot expressie in 3 uur. Eiwitten uitgedrukt met behulp pT7CFE1-Chis expressievector hebben een C-terminaal tag vergemakkelijkt de identificatie en zuivering. De HeLa systeem wordt aangevuld met translatie initiatie factoren en een vertaling regulator, waardoor de efficiëntie van het vertaalsysteem verbeteren. Eiwitten kunnen snel worden vertaald gescreend geverifieerd en in diverse immunologische en structurele toepassingen ¹⁵ verwerkt voor gebruik.

Eukaryote celvrije expressiesystemen zoals tarwekiemen en konijnen reticulocyten worden momenteel gebruikt voor de expressie van various eukaryotische eiwitten waaronder Plasmodium eiwitten ^11,29. Bovendien, E. coli gebaseerde celvrije systemen worden ook toegepast voor eukaryote eiwitexpressie ^11. Tabel 1 vat de verschillende celvrije expressiesystemen door vergelijking van kenmerken van de systemen en het gemak van het gebruik van systemen voor eiwitexpressie. De humane celvrij systeem in vergelijking met de anderen heeft de mogelijkheid om post en co-translationele modificaties uitvoeren en goedkoper. Codon-optimalisatie mogelijk en alle reacties in 3 uur worden uitgevoerd. De HeLa-systeem een ​​ideale translatiesysteem voor eiwitsynthese in de laboratoriumopstelling.

Een groot voordeel van humane celvrije expressiesystemen boven andere celvrije systemen is de beschikbaarheid van verschillende cellijnen afkomstig van verschillende organen en weefsels. Verschillende soorten celvrije systemen worden ontworpen, afhankelijk van de cellijn. Het extracts afgeleid van zoogdiercellen hogere efficiëntie grote eiwitten te synthetiseren dan andere celvrije expressiesystemen. De celvrije expressiesystemen kunnen ook worden gebruikt in diagnostische en eiwitkarakterisering toepassingen zoals micro arrays ^30. De populaire HeLa cellijnen worden het meest gebruikt voor de expressie van eiwitten ³³ te voeren. Het endoplasmatisch reticulum in HeLa cellijnen onvoldoende ontwikkeld, waardoor de afwezigheid van post-translationele modificatie glycosylering activiteit ^33. Echter, dit systeem aangenomen voordelig Plasmodium eiwitsynthese te zijn zoals Plasmodium ontbreekt ook glycosylering na translatie modificatie ^29. De HeLa celvrije transcriptie-translatie protocol is eenvoudig uit te voeren, goedkoop en eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in 90 min, gereed voor zuivering en toepassingen later.

Protocol

1. Voorbereiding van de Parasite Celkweken, Collectie van Parasite Pellets

1. Bereid RPMI-1640-medium door toevoeging HEPES 10 g RPMI-1640 poeder, 66 mg gentamycine sulfaat, 2 g natriumbicarbonaat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxanthine en 3,8 g dextrose in 1 L steriele dH ₂ O. Meng met behulp van tafel magneetroerder tot alle poeder opgelost in 1 liter gedestilleerd water. Voer micro filtratie van media met behulp van 0,22 pm filter. Bewaar de media in steriele flessen.
2. Was ongeïnfecteerd (vers) type A + erytrocyten met behulp van RPMI. Bereid 5% hematocriet van erytrocyten (0,5 ml vers gewassen erytrocyten in 9,5 ml RPMI + 10% humaan serum).
3. Voeg 15% humaan serum + RPMI (15 ml humaan serum en 85 ml RPMI) het kweken van parasieten leiden. Voeg 10% humaan serum en RPMI (10 ml humaan serum en 90 ml RPMI) verder kweken van parasieten in rode bloedcellen.
4. Cultuur P. falciparum (3D7 en FCR-3 stammen) in typeA + menselijk erytrocyten bij 5% hematocriet en 20% parasitemie in petrischaal of een 75 cm ³ kolf. Handhaaf cultuur in vitro volgens de werkwijze van Trager en Jensen Theelichthouder ^26. Alternatief handhaven culturen in incubator bij 37 ° C werd gehouden 9,5% _CO2 en 3,4% _N2 gas. Cultuur P. falciparum in RPMI 1640-HEPES medium gesupplementeerd met 10% humaan serum.
5. Synchroniseer P. falciparum cultuur door het toevoegen van 65% Percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 zonder menselijke serum) aan de kweek te concentreren ^27.
6. Centrifugeer de kweek concentraat met Percoll bij 2500 xg gedurende 5 minuten waardoor 3 lagen. Zorgvuldig met een transferpipet isoleren schizonten van het midden overdrachtslaag in een afzonderlijke buis onder aseptische condities ^27.
7. Was de geïsoleerde kweken met 10% humaan serum + RPMI-1640 maal tot overmaat Percoll te verwijderen door centrifugeren bij 7500 g gedurende 5 min. Discard de bovenstaande telkens onder aseptische omstandigheden ^27.
8. Ga door het kweken van de gesynchroniseerde P. falciparum schizonten in 10% humaan serum + RPMI-1640 ^27.
9. Verzamel schizonten door behandeling Plasmodium geïnfecteerde erytrocyten met 10 mM Tris pH 8,8 en centrifugeren bij 15.000 xg gedurende 15 min ^23. WINKEL parasiet pellets bij -70 ° C na toevoeging van 5 pl proteaseremmer (aprotinine) aan de pellets. Gebruik parasiet pellets voor eiwit-extractie, genomische DNA isolatie en RNA-isolatie.

2. Voorbereiden plasmidevector

1. Isoleer genomisch DNA van P. falciparum schizont pellets bereid uit kweken van ongeveer 20% parasitemie.
2. Voeg 600 ul van 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS en 1 mg / ml proteinase K, pellets in een microcentrifugebuis, homogeniseren pellet met behulp van een 1 ml spuit verbonden met een 26 G naald. Alternatieve vullen van de spuitde pellet mengsel en legen in een microcentrifugebuis 20 keer. Incubate buis met homogenaat O / N in een 50 ° C waterbad.
3. Voer fenol - chloroform (P + C) extractie met toevoeging van 600 ui P + C (300 ui fenol en 300 pl chloroform) gehomogeniseerd pellet. Cap buis strak en schud het mengsel krachtig door het omkeren van de buis end-to-end. Centrifugebuis bij 14.000 xg gedurende 2 minuten en laat bovenstaande waterige oplossing met behulp van een micropipet in een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal deze stap twee keer.
4. Voeg 600 ul chloroform aan de waterige laag in de nieuwe buis uit stap 2.1.2. Vortex de buis gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 2 min. Meet de bovenste waterlaag met een micropipet en overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis.
5. Voeg 0,1 volume van 5 M natriumacetaat pH 5,5 en 1 volume isopropanol (als waterige laag 300 pl voeg 30 pl van 5 M natriumacetaat pH 5,5 + 330 pl isopropanol) aan waterige layer vanaf stap 2.1.3. Incubeer de buis bij kamertemperatuur 15 min.
6. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 10 min om DNA pellet precipiteren. Verwijder het supernatant en was pellet met 100 pl 70% ethanol (70 pl ethanol en 30 ui dH ₂ O) om overmaat zout uit het DNA te verwijderen. WINKEL DNA in 50 ui dH ₂ O bij -20 ° C.
7. Ontwerp van voorwaartse en reverse primers met behulp van software of handmatig voor amplificatie van P. falciparum genen PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 en PF3D7_0114100 eerder geïdentificeerd in proteoom ^16,18 studies met geschikte restrictieplaatsen voor het kloneren van het gen sequenties in de meervoudige kloneringsplaatsen van expressieplasmide pT7CFE1-CHIS toe zoals getoond in Tabel 2.
8. Wordt 50 pi reactiemengsel door toevoegen; 5 pl geïsoleerde P. falciparum genomisch DNA, 5 ui 10X buffer, 5 pl _MgCl2, 1,5 pl voorwaartse primer, 1,5 plreverse primer, 0,5 pl T7 DNA polymerase en 31,5 pl dH ₂ O en uitvoeren polymerase chain reaction (PCR) bij 94 ° C gedurende 8 minuten voor denaturatie, 50 ° C gedurende 1 min 30 sec voor uitbreiding of 72 ° C gedurende 9 min voor annealing en renaturatie voor het amplificeren van genen in tabel 1.
9. Afzonderlijke PCR-producten op 1% agarose gel (1 g agarose en 100 ml Tris-acetaat EDTA (TAE) buffer) ^32.
10. Snijd het PCR geamplificeerde DNA-banden van de agarose gel, plaatst de gelschijfjes bevattende DNA in een gel van DNA-extractie centrifugekolom en invriezen bij -20 ° C gedurende 5 min. Voeg 100 ul isopropanol aan de bevroren gelplakjes en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 min.
11. Meet de waterige doorstroom gefiltreerd in de verzamelbuis van stap 2,5, met behulp van een micropipet en naar een nieuwe buis. Voeg 0,1 volume van 5 M natriumacetaat en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg 10 ul van dH ₂ O aan The DNA pellet.
12. Digest de pT7CFE1 CHIS-expressievector en gezuiverde DNA-fragmenten (van 2,6) in twee afzonderlijke buizen door de toevoeging van 3 pi plasmide en 5 ui PCR genproducten aan elke buis. Aan elke buis, 1 gl specifieke restrictie-enzymen, 2 pl reactiebuffer en 14 ui dH ₂ O.
13. Voeg 3 ul van gedigereerde plasmide, 5 ui gedigereerde DNA-fragmenten, 2 ui 10X ligase buffer, 1 ui ligase en 9 ul van dH ₂ O in een microcentrifugebuis. Incubeer bij 12 ° CO / N.
14. Voeg 0,1 volume van 3 M natriumacetaat bij pH 5,5 en 2 volumes ethanol (als ligatie tubes volume is 20 gl voeg 2 pl 3 M natriumacetaat + 44 pl ethanol) aan de buis uit stap 2,14. Goed mengen en incuberen bij -20 ° C gedurende 15 min.
15. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 15 min. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een micro pipet zonder de pellet te verstoren.
16. Voeg 100 ui 70% ethanol to de pellet uit stap 2.10. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 5 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Voeg 10 ul nuclease-vrij water aan het DNA pellet.

3. Eiwit expressie met behulp van in vitro Menselijke cel Gratis Expression System

1. Bereid 20 pi van transcriptie mengsel door het meten van 2 pl van het recombinant pT7CFE1 CHIS-plasmide-DNA, 4 ui 5x transcriptiebuffer, 4 pi NTP mix, 2 pi T7 RNA Polymerase en 8 pi nuclease-vrij water voor 2 stappen Mens in vitro Protein Expression met behulp van DNA templates. Meng componenten in een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 75 minuten bij 30 ° C in een waterbad.
2. Neem 2 pi van de transcriptie mengsel toevoegen aan 23 gl vertaling mengsel dat 12,5 pl HeLa cellysaat, 2,5 gl additionele eiwitten, 1 pl zoutoplossing A, 0,5 pi aminozuren -Met, 0,5 pi aminozuren Leu, 181; l van RNAse inhibitor, 1,25 pi van de energiemix en 3,75 ul van nuclease-vrij water.
3. Incubeer de vertaling mengsel van stap 3,2 bij 30 ° C gedurende 90 min. WINKEL vertaald producten bij -20 ° C.
4. Bereid 25 pl transcriptie en translatie mengsel door toevoeging van 3 pl van het recombinante pT7CFE1 CHIS-plasmide-DNA, 2 pi nuclease-vrij water, 5 gl reactiemengsel, 12,5 ul lysaat HeLa en 2,5 ul van additionele eiwitten van 1-staps Human Gekoppeld IVT Protein Expression voor DNA-templates.
5. Incubeer het reactiemengsel uit stap 3,4 gedurende 90 minuten tot 6 uur bij 30 ° C. Bewaar de vertaling producten op -20 ° C.

4. Zuivering van tot expressie gebrachte recombinante eiwitten

1. Voeg 75 ul van 1x zuivering buffer om 25 ul van de vertaling product tot 100 ul van zuivering mengsel te maken.
2. Voeg 100 ul van nikkel chelerende hars 100 ul zuivering mixture. Wash Ni-hars tweemaal door toevoeging van 300 pi dH ₂ O en 300 pl van de bindingsbuffer. Resuspendeer hars en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min om overmaat ethanol te verwijderen.
3. Voeg 100 ul van zuivering mengsel uit stap 4,2-100 pl nikkel chelaat hars en incubeer gedurende 60 min bij kamertemperatuur werd het mengsel.
4. Centrifugeer het mengsel bij 14.000 xg gedurende 1 minuut en laat supernatant in een nieuwe buis aangeduid als "doorstromen".
5. Was de hars met 100 ul 1x wasbuffer (20 mM imidazool, 250 mM NaH ₂ PO ₄ bij pH 8, 2,5 M NaCl en dH ₂ O). Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min en verzamel supernatant in nieuwe buis met het label "wash". Herhaal stap 4,5 keer.
6. Voeg 100 ul van 1 x elutiebuffer (100 mM imidazool, 250 mM Na ₂ PO ₄ bij pH 8,0, 2,5 M NaCl en dH ₂ O) aan de hars en incubeer gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min. Doe de elutiestap tweemaal. Iedertijd verzamel supernatant in de frisse microcentrifugebuisjes en label als "eluaat".
7. Na elutie was tweemaal hars zoals beschreven in stap 4.5. Store doorstromen, wast en elutie monsters bij -20 ° C of lager. Resin moet worden bewaard bij 4 ° C. Gebruik 30 pi van elk monster voor SDS-PAGE en immunoblotting-analyse.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay ³⁴

1. Bereid standaard bovine serum albumine (BSA) oplossing met de concentratie 20 pg / ml (mix 10 gl BSA (2 mg / ml) en 90 ul van dH ₂ O), 40 ug / ml (mix 20 gl BSA (2 mg / ml) en 80 ul van dH ₂ O), 60 ug / ml (mix 30 gl BSA (2 mg / ml) en 70 gl van dH ₂ O), 80 ug / ml (mix 40 gl BSA (2 mg / ml) en 60 ui dH ₂ O), 100 ug / ml (mix 50 gl BSA (2 mg / ml) en 50 ui dH ₂ O), 160 ug / ml (mix 80 gl BSA (2 mg / ml) en 20 gl dH₂ O) en 200 ug / ml (100 pl BSA (2 mg / ml).
2. Maatregel 5 pl doorstroming, wast en eluaatmonsters uit stap 4.7. Voeg 95 ul van dH ₂ O.
3. Voeg 5 ml van Coomassie blauw reagens om het mengsel van stap 5.1 en 5.2. Bedek de buizen met parafilm en vortex gedurende 10 seconden daarna geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
4. Met behulp van een spectrofotometer meet de optische dichtheid (OD) bij golflengte van 650 nm voor eiwitbuisjes uit stap 5.3. Plot concentratie vs. OD lezing aan het eiwit concentraties ³⁴ te bepalen.

6. Western Blotting

1. Voeg 5 ul van schizont uittreksels uit P. falciparum, 2 pl Escherichia coli tot expressie gebracht recombinant Rhop-3 eiwitten ^31, 5 pi van recombinante eiwitten tot expressie gebracht middels 2 stappen en stap 1 in vitro humane expressiesystemen en 10 pl eiwitproducten gezuiverd middels affiniteit methode buizen scheiden.
2. Voeg elektroforese monsterbuffer met mercapto- ethanol aan elke buis een eindvolume van 20 pi aan oplosbaar eiwit monsters te maken. Kook buisjes gedurende 2 minuten.
3. Laad gesolubiliseerde eiwit monsters op 10% SDS-PAGE gels om de eiwitten te scheiden.
4. Transfer gescheiden eiwitten van SDS-PAGE gels op nitrocellulose papier (NCP) van elektroforeren bij 35 mA per gel in een semi-droge western blotting kamer gedurende 2 uur.
5. Block NCP's na de overdracht met 2% magere melk.
6. Incubate geblokkeerd NCP's met de volgende polyklonale antilichamen verdund 1: 100 in 2% melk aan western blotting te voeren; konijn antilichaam # 676 ²¹ specifiek voor P. falciparum merozoïet rhoptries, muis antilichamen ²⁰ specifiek voor P. en P. yoelii berghei merozoite rhoptries antisera # 685 specifiek voor P. falciparum parasitophorous vacuole eiwit, SERA (serine rijk antigeen) ²² en antilichamen specifiek voor de Maurer217; s gespleten eiwit PfMC-2TM ^28.
7. Incubate NCP's ook in 1: 100 verdund normale muis en konijn serum en bracht kweeksupernatant (SCS) van SP2 myeloma cellen als negatieve controles.
8. Incubate NCP's met antilichamen en controles op 4 ºC O / N.
9. Wash NCP 4x met Blot buffer en incubeer NCP met soortspecifieke secundaire antilichamen, geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) 1: 1000 verdund in 2% melk.
10. Wash NCP 4x met Blot buffer. Incubeer gewassen NCP de kleurontwikkeling-oplossing A + B (Oplossing A: voeg 50 ml 1x Blot buffer en 30 ui _{H2O 2,} Oplossing B: voeg 10 ml methanol en 30 mg 3-chloor-naftol) voor 30 min in het donker. Analyseer western blot resultaten colorimetrisch.

Results

Validatie van de tot expressie gebrachte recombinante eiwitten door middel van reactiviteit met specifieke antilichamen is een belangrijke eerste stap bij het bevestigen van de juiste vouwing van de tot expressie gebrachte eiwitten. Recombinant malaria eiwitten werden uitgedrukt met behulp van de een stap en twee stappen in vitro menselijke cel vrije expressie systemen. De recombinante eiwitten worden gezuiverd Ni-chelerende affiniteit methode. We vervolgens gebruikt antisera tegen hele merozoïet rhoptries in westerse b...

Discussion

De belangrijke stappen voor een succesvolle expressie van eiwitten onder toepassing tweestaps in vitro humane celvrij expressiesysteem en zuivering zijn: 1) succesvolle amplificatie en klonering van genen in pT7CFE-CHIS plasmidevector; 2) het transcriberen van RNA bij 30 ^o C; 3) translatie van proteïne bij 30 ° C in aanwezigheid van RNAse inhibitor; 4) de affiniteit gebaseerde zuiveringsprotocol middels harskorrels bekleed met Ni en 5) het analyseren van de resultaten op Western blot met behulp van polyklonal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-step in vitro humaan celvrij expressiesysteem	Thermo Fisher	88856	Niet langer leverbaar. Altijd bewaren bij -80 °C. Niet ontdooien in warm water
1-step in vitro gekoppelde translatiesysteem	Thermo fischer	88860	Altijd bewaren bij -80 °C. Niet ontdooien in warm water
ProBond zuiveringssysteem	Invitrogen	K850-01	Bewaren bij RT
Probond nikkel-chelerende hars	Invitrogen	R801-01	Bewaren bij 4oC.
A+ Menselijke Bloed	Interstate Blood Bank		Bewaren bij 4 °C.