Methodenartikel

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen In Vitro

DOI:

10.3791/52779

⸱

18 juni 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er worden high throughput-assays gepresenteerd die in combinatie uitstekende tools bieden om NET-afgifte van humane neutrofielen te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofiele granulocyten zijn de meest voorkomende leukocyten in het menselijk bloed. Neutrofielen zijn de eersten die aankomen op de plaats van infectie. Neutrofielen ontwikkelden verschillende antimicrobiële mechanismen, waaronder fagocytose, degranulatie en vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs). NETs bestaan uit een DNA-skelet versierd met histonen en verschillende korrelmarkers, waaronder myeloperoxidase (MPO) en humane neutrofiele elastase (HNE). NET-release is een actief proces dat kenmerkende morfologische veranderingen van neutrofielen met zich meebrengt, wat leidt tot de uitdrijving van hun DNA naar de extracellulaire ruimte. NETs zijn essentieel om microben te bestrijden, maar ongecontroleerde afgifte van NETs is geassocieerd met verschillende aandoeningen. Om meer te leren over de klinische relevantie en het mechanisme van NET-vorming, is er behoefte aan betrouwbare tools die in staat zijn tot NET-kwantificering.

Hier worden drie methoden gepresenteerd die NET-afgifte van humane neutrofielen in vitro kunnen beoordelen. De eerste is een hoogdoorvoertest om de extracellulaire DNA-afgifte van menselijke neutrofielen te meten met behulp van een membraan-impermeable DNA-bindende kleurstof. Bovendien worden twee andere methoden beschreven die in staat zijn om de vorming van NETs te kwantificeren door het meten van niveaus van NET-specifieke MPO-DNA en HNE-DNA complexen. Deze op microplaat gebaseerde methoden in combinatie bieden geweldige tools om de mechanismen en regulatie van NET-vorming van menselijke neutrofielen efficiënt te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET-vorming is een nieuw mechanisme waarmee neutrofielen pathogenen bestrijden.1 Het hart van NETs is nucleair DNA.1 Dit DNA-netwerk is geassocieerd met neutrofiele korrelproteïnen en histonen.1 De belangrijkste vorm van NET-vorming vereist de dood van neutrofielen, gekenmerkt door chromatine decondensatie, verdwijning van korrelige en nucleaire membranen, translocatie van neutrofielen elastase naar de kern, citrullinering van histonen en uiteindelijk het overstromen van DNA-gebaseerde NETs.2 NETs vangen en doden een breed scala aan microben en zijn een essentieel onderdeel van het repertoire van aangeboren immuunwapens. Ongecontroleerde NET-vorming is echter in verband gebracht met talrijke auto-inflammatoire ziekten.3,4 Ondanks hun steeds grotere relevantie, is er weinig bekend over het mechanisme en de regulatie van NET-vrijlating.

Neutrofielen die afsterven door het vrijgeven van NETs zijn anders dan apoptotische of necrotische neutrofielen.3,5 NET-vrijstellende neutrofielen vertonen verschillende kenmerken die kenmerkend zijn voor NET-vorming. Korrelcomponenten zijn geassocieerd met DNA in NETs.1 Myeloperoxidase (MPO) en humaan neutrofiel elastase (HNE) worden beide gevonden in primaire korrels in rustende cellen, maar worden getransloceerd naar de kern om zich te binden aan DNA in NETs.1 MPO-DNA en HNE-DNA complexen zijn specifiek voor NETs, komen niet voor in apoptotische of necrotische neutrofielen.1,3,5 Chromatine decondensatie is een ander kenmerk dat typisch is voor NETose.2 NET-vrijlating vereist ook citrullinering van histonen door peptidyl aminase 4 (PAD4).6 Citrullineerde histonen zijn kenmerkend voor neutrofielen die NET-vrijlating hebben ondergaan.6

Hier worden drie methoden geïntroduceerd die in combinatie uitstekende hulpmiddelen bieden om NETs op een grootschalige te kwantificeren. De eerste test is op het veld gebruikt met verschillende wijzigingen en kwantificeert de extracellulaire DNA-vrijlating in een microplaatformaat. De tweede en derde tests bieden bevestiging van NETs door NET-specifieke MPO-DNA en HNE-DNA complexen te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Institutional Review Board van de Universiteit van Georgia goedgekeurd het menselijk subject onderzoek van de perifere bloed van gezonde vrijwilligers (UGA # 2012-10769-06) te verzamelen. 5,7,8 Vrijwilligers tekende de vereiste informed consent formulier voor bloedafname. Het onderzoek uitgevoerd in dit artikel is in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor medisch onderzoek met mensen van de Verklaring van Helsinki.

1. Isolatie van neutrofielen uit perifeer menselijk bloed (figuur 1)

Opmerking: Er zijn verschillende manieren om neutrofielen uit perifeer bloed te isoleren. Het volgende protocol voorziet één mogelijkheid. Dit protocol levert grote aantallen niet-geactiveerde humane neutrofielen kan vrijgeven NET op externe stimulatie. Gebruik 40 ml bloed van gezonde vrijwilligers verkregen door venapunctie. 7,9

  1. Aliquot 20 ml bloed in twee 50 ml conische buizen. Voeg 10 ml 6% dextran. Meng voorzichtig.
  2. Na 20 min overdracht van de leukocyten-rich bovenste fase zonder enige vorm van pellets rode bloedcellen in schone 50 ml conische buizen en vul het met steriele PBS.
  3. Centrifugeer bij 400 x g 10 min. Resuspendeer pellet in 4 ml steriele PBS.
  4. Bereid een 5-staps Percoll gradiënt van 85% -80% -75% -70% -65% in twee 15 ml conische buizen en laag 2 ml leukocyt suspensie bovenop elkaar gradiënt.
  5. Centrifuge 800 g gedurende 30 min met remmen los.
  6. Verzamel alle cellen (neutrofielen) in lagen op de 75% / 80% en 70% / 75% interface.
  7. Was de cellen tweemaal in PBS (350 xg, 10 min, RT) en cellen te tellen met een hemocytometer.

2. Meting van de kinetiek van extracellulaire DNA release Met behulp van een Microplate Fluorimeter

Opmerking: deze methode kan de meting van veranderingen in fluorescentie van een membraan ondoorlaatbare DNA-bindende kleurstof die indicatief is voor DNA afgifte aan een 96-well microplaat formaat (Figuur 2).

  1. Maak een suspensie van neutrofielen in testmedium (HBSS +1% (v / v) autoloog serum + 5 mM glucose) in een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml.
  2. Voeg 5 micromol / l van het membraan ondoordringbaar DNA-bindende kleurstof. Meng voorzichtig.
  3. Aliquot menselijke neutrofielen (50 pl / putje) op 96-well zwart, transparant bodem microtiterplaten. Controleer het testmedium bestrijkt de gehele bodem van de put. Zo niet, dan tikt u op de plaat voorzichtig op de zijkant.
  4. Verwarm de plaat met neutrofielen gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  5. In de tussentijd worden de oplossingen van stimuli op het dubbele van hun uiteindelijke concentraties te worden gebruikt (in 37 ° C warm assay medium). Als een positieve controle NET gebruiken humane neutrofielen met 100 nM forbol-myristaat-acetaat (PMA) gedurende 4 uur tot maximaal NET versie te activeren. 5,8 PMA stimulatie voor 4 uur garandeert maximale netto vrijval terwijl spontane NET formatie blijft laag 5,8.
  6. Bereid de microplaat fluorimeter voor het meten (4 uur, 37 ° C, 530 nm voor excitatie en 590 nm voor emissie).
  7. Neutrofielen stimuleren door toevoeging van 50 ul stimulus oplossing van 50 gl neutrofielen suspensies. Gebruik 0,5 ug / ml saponine in een put om maximale DNA afgifte signaal te meten.
  8. Plaats de plaat in de reader en de veranderingen in fluorescentie gedurende 4 uur bij elke 2 min zonder schudden meten.
  9. Gegevensanalyse Bereken genormaliseerde toename in fluorescentie in de tijd.
    1. Aftrekken van de basislijn fluorescentie eindpunt waarden van alle putjes zoals saponine (Figuur 2A, B). Stijging van de saponine fluorescentie moet de hoogste signaal. Het wordt aangeduid als "maximale DNA afgifte" (Figuur 2A).
    2. Percentages berekenen van DNA afgifte in onbekende monsters door het delen toename in fluorescentie van onbekende monsters door DNA maximale afgifte.
    3. Gemiddelde resultaten van herhalingen en presenteren als "% van de maximale DNA release" (figuur 2C).

3. kwantificering van NET Formatie van MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays

Opmerking: Deze testen gemodificeerd (MPO-DNA) of gevestigde (HNE-DNA) in ons laboratorium kwantificeren netvorming door het meten van niveaus van MPO-DNA en HNE-DNA complexen 5.

  1. Coat 96-well high-bindend vermogen ELISA-platen 's nachts met capture antilichamen (50 pl / putje): anti-MPO (1: 2000 verdunning) of anti-HNE (1: 2000).
  2. Wassen ELISA platen driemaal met PBS (200 ul / putje) en blokkeren met 5% BSA en 0,1% menselijk serum albumine gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (200 ui / putje). Spoel driemaal met PBS.
  3. Zaad neutrofielen op 96-putjes bij een dichtheid van 100.000 cellen / putje in 100 pl assaymedium en stimuleren netvorming. Incubeer cellen: 4 uur 37 ° C.
  4. Voer een beperkte DNase spijsvertering door toevoeging van 2 U / ml DNase neutrofielen supernatanten, meng ze goed. Houd ze bij RT.
  5. Stop de DNase na 15 min door het toevoegen van 11 pi 25 mM EGTA (eindconcentratie 2,5 mm). Goed mengen. Verzamel supernatants in schone microfugebuizen. Spin monsters kwijt celresten bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer hun supernatanten in schone microcentrifuge buizen. Houd ze op ijs pas klaar.
  6. Gebruik een hoeveelheid van een eerder bereide "NET standaard".
    Opmerking: De NET-standaard is een mix van DNase gedigereerd supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen verkregen uit ten minste 5 verschillende, onafhankelijke menselijke donors.
    1. Op hetzelfde niveau gedurende lange tijd, verzamelen en aliquot een grote hoeveelheid neutrofielen supernatanten van elke donor. Verzamelen bijvoorbeeld 2 ml DNase-gedigereerde supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen zal resulteren in 200 monsters (10 pl elk) genoeg 200 ELISA platen. Kenmerkende gegevens NET norm in figuur 5.
    2. Stimuleer menselijke neutrofielen met 100 nM PMA gedurende 4 uur en van toepassing DNase verteren hun supernatanten volgens stappen 3,4-3,5.
    3. Verzamel, zwembad, monster (10 pl) en gratisZE (-20 ° C) neutrofiel supernatanten.
    4. Om de "NET-standaard" voor te bereiden, dooi een portie / donor verkregen uit ten minste vijf afzonderlijke donors, meng ze en houd ze op ijs.
    5. Gooi ontdooide monsters en het gebruik van verse die voor het volgende experiment.
    6. Bereid een 1: 2 seriële verdunning van de NET-standaard in PBS + EGTA.
  7. Verdun DNase1-verteerd samples (standaard en onbekende supernatanten) 20-voudig in PBS + EGTA en aliquot ze op ELISA-platen bekleed met capture antilichamen.
  8. Incubeer ELISA platen overnacht bij 4 ° C en wassen driemaal met PBS.
  9. Solliciteer detectie antilichaam-oplossing (100 ul / putje): mierikswortelperoxidase geconjugeerd anti-DNA antilichaam (1: 500, muis). Incubeer gedurende 1 uur in het donker.
  10. Na vier wassingen met PBS toe te voegen TMB peroxidasesubstraat: 100 ul / well, 30 min. Blauw kleuring is een indicatie voor peroxidase activiteit (NET aanwezig).
  11. Stop reactie door het toevoegen van 100 ul / putje 1 M HCl. Deblauw oplossingen zullen geel (figuur 5A) draaien.
  12. Lees absorptie bij 450 nm onder toepassing van een microplaat fotometer.
  13. Voor gegevensanalyse Bereken de hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA complexen in vergelijking met de standaard NET.
    1. Aftrekken van de achtergrond optische dichtheidswaarde van het testmedium van alle monsters.
    2. Zet de absorptiewaarden (X-as) van de verdunde standaardmonsters op hun relatieve netto inhoud (Y-as) (figuur 5A).
    3. Met behulp van de nonsaturated bereik van deze norm curve opzetten van een trendlijn (gebruik best exponentiële fit van de gebruikte software) (Figuur 5A). De vergelijking van deze trendlijn is bepalend voor de omzetting van de OD-waarden bedragen van NET kwantitatief.
    4. Plaats de gemeten OD-waarden van de onbekenden in de tendens-lijn vergelijking van 3.13.3 dat het bedrag van NET in het onbekende monster als percentage van de netto-standaard (figuur 5A) zal geven.
    5. Berekenengemiddelden van herhalingen (drie exemplaren) en de definitieve gegevens te presenteren als "hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA-complexen (% van de norm)" (figuur 5C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cijfers in dit manuscript beschrijven de wijze van neutrofielen isolatie, voor experimenten en presenteren representatieve resultaten met uitleg van gegevensanalyse. Figuur 1 toont de opeenvolgende stappen van humaan neutrofiel preparaat. Dit protocol vertegenwoordigt slechts één mogelijke manier van neutrofielen isolement. Het levert grote hoeveelheden rustende neutrofielen kunnen vrijgeven netten na stimulatie. Figuur 2 toont hoe de fluorescentie ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET's vertegenwoordigen een fascinerend nieuw mechanisme waarmee neutrofielen doden pathogenen. 1 Hoewel de literatuur van de netten is voortdurend uit te breiden in de afgelopen tien jaar sinds hun ontdekking, een aantal belangrijke vragen met betrekking tot hun rol in de biologie, mechanisme en regelgeving onduidelijk blijven. Passende methode moet worden ontwikkeld om NET's, dit zeer unieke antimicrobiële mechanisme meten. Dit artikel beschrijft methoden die kunnen worden gebruikt voor NET kwantifi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bijzondere dank aan het personeel van het Health Center laboratorium van de University of Georgia voor hun voortdurende ondersteuning van ons werk aan het isoleren van menselijke neutrofielen. Dit werk werd ondersteund door het startkapitaal van Dr. Rada, verstrekt door UGA Office of Vice President for Research.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab Calbiochem4810011:2.000x gecoat
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)Millipore07-4961:2.000x gecoat
DNase-1Roche10-104-159-0011 µg/ml gebruikt voor digestie
20 mM EGTA/ PBSSigma-AldrichE3889-25G
2,5 mM EGTA/PBSSigma-AldrichE3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA PODRoche115446750011:500x 
Eon Microplate SpectrophotometerBiotek
Gen5 All-in-One microplate softwareBiotekanaltisch hulpmiddel (ELISA)
Sytox orangeLife TechnologyS113680,2% eindconcentratie/volume
1 M HepesCellgro25-060-ClGebruik 10 mM eindconcentratie.
1 M glucoseSigmaGebruik 5 mM eindconcentratie.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Thermoscientific
PMASigmaP 8139100 nM eindgebruik
ELISA PlateGreiner bio-one655061
Conical tubes 15 mlThermoscientific339650
Conical tubes 50 mlThermoscientific339652
Percoll (pH 8,5-9,5) SigmaP 1644Natriumchloride, Sigma, S7653-250G
DextranSpectrumD1004
RPMI 1640 mediaCorning Cellgro17-105-CV
96 well assay plate zwarte plaat met heldere bodemCostar3603

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neutrofiele extracellulaire trapshigh throughput assayMPO DNA ELISAHNE DNA ELISASYTOX Orangeisolatie van neutrofielenPercoll gradi ntmicroplaatfluorometer

Gerelateerde artikelen