Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

Samenvatting

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Samenvatting

De ubiquitine-proteasoom-systeem is onlangs betrokken bij diverse pathologieën waaronder neurodegeneratieve ziekten en kanker. Gezien deze technieken voor het bestuderen van reguleringsmechanisme van dit systeem zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire en moleculaire processen van bovengenoemde ziekten. Het gebruik van hemagglutinine afkomstig ubiquitine probes die in dit document dient als een waardevol hulpmiddel voor de studie van dit systeem. Deze paper Gegevens een methode die de gebruiker in staat stelt om te testen die een directe visualisatie van ubiquitinerings enzymactiviteit te voeren. Ubiquitinerings enzymen regelen proteasomale afbraak en functionele homologie delen hun actieve plaatsen, waarmee de gebruiker de activiteit van verschillende enzymen in een assay te onderzoeken. Lysaten worden verkregen door middel van zachte mechanische celdisruptie en geïncubeerd met actieve plaatsgerichte probes. Functionele enzymen worden gelabeld met de sondes tijdens inactieve enzymen ongebonden blijven. Door running deze test krijgt de gebruiker informatie over zowel de activiteit en mogelijke expressie van meerdere ubiquitinerings enzymen op een snelle en gemakkelijke wijze. De huidige methode is significant efficiënter dan het gebruik van afzonderlijke antilichamen voor de voorspelde honderd ubiquitinerings enzymen in de menselijke cel.

Inleiding

De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) dient als een van de belangrijkste afbraakroutes in de zoogdiercel. Substraten gebonden voor de afbraak in het proteasoom covalent gelabeld met polymeren van ubiquitine (Ub) ^1. Voor het beoogde substraat komt het proteasoom voor afbraak, moet de poly-ubiquitine tag verwijderd. Een klasse van enzymen bekend als ubiquitinerings enzymen (Dubs) is verantwoordelijk voor de verwijdering en recycling van ubiquitine moleculen ^2. Volgens schattingen van het menselijk genoom dat er bijna honderd Kopieën die in de cel ^3. Met een dergelijk groot aantal nasynchroniseert regelen Ub-gemedieerde cellulaire processen bestuderen van deze enzymen een uitdaging omdat mRNA technieken geen informatie over de activiteit en Western blotting geven geeft alleen informatie over expressieniveaus.

Het gebruik van influenza hemagglutinine (HA) tag, Ub-afgeleide actieve plaatsgerichte probes maakt een covalente modcatie van de functionele nasynchroniseert en derhalve geeft een directe visualisatie van de activiteit van deze enzymen op een western blot ^4. De probes hebben een C-eindstandige thiol reactieve groep die dient als zelfmoord substraat voor de actieve plaats cysteïnerest ^5. Met deze sondes is het mogelijk om de activiteit en mogelijke expressie van vele nasynchroniseert studeren bij zowel fysiologische en pathologische toestanden van de cel.

Veranderingen in DUB activiteit zijn betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer, anemie en diverse kankers ^6-10. Deze techniek verschaft een krachtig hulpmiddel voor de studie van ziekten. In het onderhavige document tonen wij de toepassing van deze techniek in HeLa en M17-cellen die werden gelyseerd middels glasparels. Daarnaast hebben we schetsen hoe deze methode in de muis ruggenmerg weefselmonsters gebruiken. De resultaten van deze techniek informatie kan worden gebruikt als uitgangspunt voor het identificerentherapeutische doelen alsmede vaststelling modellen voor de studie van verschillende aandoeningen. De werkelijke bruikbaarheid van deze techniek ligt in het vermogen om informatie op meerdere Kopieën voorzien in een enkele assay.

Protocol

1. Lysis Buffer Voorbereiding

1. Los sucrose in gedeïoniseerd (DI) water met een 2 M voorraadoplossing te maken. Filtreer een 2 M oplossing van sucrose met behulp van een vacuüm aangedreven 0,22 urn polyvinylideenfluoride (PVDF) filter.
2. Los dithiothreitol (DTT) in DI water om een ​​500 mM voorraad oplossing en op te slaan onder anaerobe omstandigheden te maken. Los magnesiumchloride _(MgCl2) in DI water om een 100 mM voorraad oplossing te maken. Los adenosine trifosfaat (ATP) dinatrium hydrateren in DI water om een ​​50 mM voorraad oplossing te maken.
3. Maak een Tris bij pH 7,4 door het oplossen Trizma hydrochloride in DI-water en de pH met behulp van natriumhydroxide (NaOH).
4. Combineer gedeelten van de voorraadoplossingen in DI water om een lysis buffer maken met een sucrose concentratie van 250 mM, een DTT-concentratie van 1 mM, een _{MgCl2-concentratie} van 5 mM, de ATP-concentratie van 1 mM en een Tris concentratie van 50 mM . Bijvoorbeeld, meng 535,3 pl tris, 500 pl _MgCl2, 1,25 ml sucrose, 20 pl DTT, 200 pl ATP en 7,4947 ml DI water tot 10 ml lysisbuffer maken. Dit kan voor ongeveer 20 experimenten.

2. Kweken van cellen voor Experiment

1. Voeg media door aliquoting 30 ml DMEM + 10% foetaal runderserum (FBS) in een 50 ml conische buis.
2. Transfer bevroren M17 of HeLa-cellen uit vloeibare stikstof opslag een kleine beker met lauw water.
3. Breng de cellen om de 50 ml conische buis. Voeg eerst sommige media aan de cel flacon. Daarna brengt de geresuspendeerde cellen binnen 5 seconden na het ontdooien.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij 450 xg gedurende 5 minuten een celpellet te verkrijgen. Voeg 20 ml medium in een T75 kolf.
5. Verwijder de media uit de cellen met behulp van zuigkracht. Voeg 5 ml vers medium aan de cellen en resuspendeer pellet.
6. Breng de 5 ml celsuspensie aan de 20 ml van media in de T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C. Change de media om de 3 dagen.

3. Cell Oogsten

1. Verwijder de media via zuigkracht, zorg dat u de cellen niet aan te raken.
2. Was de cellen met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS gebruikt afzuiging.
3. Voeg 3 ml trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij de T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 min.
4. Voeg 6 ml van verse media om de kolf en resuspendeer de cellen.
5. Breng de suspensie aan een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten.
6. Verwijder het supernatant en voeg 5 ml PBS. Tik voorzichtig de bodem van de buis te breken van de pellet. Centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten.
7. Herhaal stap 3.6 drie keer.
8. Verwijder PBS en resuspendeer de cellen in 1 ml verse PBS. Transfer naar Eppendorf tube (1,5 ml). Spin bij 290 xg gedurende 5 minuten.

4. Cel Lysis

1. Meet het volume van de pellet benadering met een pipet eend afwegen glazen kralen in een massa: volume verhouding van 1: 1. Voeg tweemaal het volume van de pellet in lysis buffer.
   Opmerking: Voeg de buffer voor het toevoegen van de glasparels.
2. Lyse van de cellen in de Eppendorf buis bij de maximale schudden gedurende 30 minuten bij 4 ° C door vortexen in een koude kamer.
3. Centrifugeer kort bij 200 xg gedurende 30 seconden om de kralen te regelen. Verzamel de bovenstaande vloeistof.
4. Voeg een gelijk volume glaskorrels als voorheen aan het supernatant.
5. Vortex opnieuw maximaal schudden gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
6. Centrifugeer kort bij 200 xg gedurende 30 seconden aan de glazen kralen af ​​te wikkelen. Verzamel de bovenstaande vloeistof.
7. Centrifugeer bij 5030 xg gedurende 5 minuten aan de kernen, membranen en ongebroken cellen te verwijderen. Verzamel de bovenstaande vloeistof, die het cellysaat.

5. Tissue Homogenisering

1. Maak een massa: volume van 1: 9 oplossing van de muis ruggenmerg weefsel lysisbuffer.
   Opmerking: Deze methode is toepasbaar op een verscheidenheid verschient weefselmonsters.
2. Homogeniseer het weefsel met behulp van een instelling van niveau 2 van de homogenisator gedurende 30 seconden zodat er geen stukjes overgebleven.
3. Spin neer op 5030 xg gedurende 3 minuten naar de kernen, membranen en ongebroken cellen te verwijderen.
4. Verzamel de bovenstaande vloeistof, die het lysaat.

6. Sample Derivatisering

1. Voer een bicinchoninezuur (BCA) in een 96-putjesplaat analyse om de eiwitconcentratie van het lysaat weefsel met behulp van een colorimetrische 96 putjes plaatlezer aanwijzingen van de Pierce BCA Protein Assay kit protocol te bepalen.
2. Breng een hoeveelheid die overeenkomt met 20 ug totaal eiwit aan 50 gl behulp gedeïoniseerd (DI) water.
3. Voeg 2 ul van 1,35 uM HA-Ub-vinyl sulfon (VS) aan de oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Dit resulteert 20 ug lysaat tot 50 nM probe in het uiteindelijke reactiemengsel. Dit is in grote molaire overmaat aan tagging van functionele dubs waarborgen.
4. Ikncubate het monster in Laemmli monsterbuffer gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Voor een 52 ul reactie volume gebruik 26 ul 2x monsterbuffer, 13 ul van 4x sample buffer of 8,87 pi van 6x monsterbuffer.
5. Afkoelen op ijs vóór het laden van de gel.

7. Western Blot

1. Laad een 12-put 4-20% Tris-glycine gel met 40 ul van de voorbereide monster
2. Laat de gel bij 95 V tot de ion achterkant bodem bereikt.
3. Verricht een overnachting overdracht van de gel op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan.
4. Incubeer het membraan in de amido zwarte vlek en scan de membane een overzicht zien van de hoeveelheid eiwit in elke laan te verkrijgen.
5. Destain het membraan en geïncubeerd in 5% melk in PBS gedurende 1 uur te blokkeren.
6. Incubeer het membraan in de primaire anti-HA antilichaam bij een concentratie van 1: 10.000 in 5% melk in PBS of overnacht bij 4 ° C en gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd.
7. Voer 3 wasbeurten fof 5 min elk in PBS met 0,1% Tween-20 detergent.
8. Incubeer het membraan in een muis mierikswortel peroxidase bij een concentratie van 1: 10.000 in 5% melk in PBS gedurende ten minste 2 uur.
9. Voer 3 wassingen gedurende 5 minuten elk in PBS met 0,1% Tween-20 detergent.
10. Voer 1 wassen gedurende 5 min in PBS.
11. Incubeer het membraan in een chemiluminescente detectie reagens voor 10 min en gedetecteerd met een chemiluminescente detectie. Gebruik de automatische belichting instellen op de detector.

Resultaten

Gekweekte M17 en HeLa-cellen werden geoogst met behulp van de methode beschreven in het protocol (3 Cell Oogst) en de muis ruggenmerg weefsel werd verkregen. De celpellet / ruggenmerg werd in een buis met lysis buffer in het reagens bereiding beschreven. Celpellets werden gelyseerd middels glasparels (figuur 1A) en muis ruggenmerg weefselmonsters werden gehomogeniseerd met de homogenisator (Figuur 1B). Na lysis of homogeniseren werd het monster gecentrifugeerd bij 5030 xg om de glaspare...

Discussie

Aangezien ubiquitinatie is een fundamenteel celactiviteit begrijpen van de regelmechanismen kan de sleutel opgraven de processen van ziekte en pathologie. Het gebruik van HA tag Ub-afgeleide actieve gerichte sondes hier gemeld biedt een eenvoudige, maar zeer toepasbare methode voor het bestuderen van Ub-gemedieerde afbraak van eiwitten. Deze werkwijze is sneller en goedkoper dan het bestuderen elk van de dubs afzonderlijk.

In deze werkwijze, wordt de lyse van de cellen bereikt door mechanisc...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PowerGen 125 (homogenizer)	Fischer Scientific	14-261-02P
Vacuum-driven filters 0.22 µm		BPV2210
Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve)	Sigma-aldrich	G4649-10G
Sucrose	Fischer Scientific	S6-212
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-092
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023
Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs	Cellstar	T-3001-2
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
HI FBS	Life Technologies	16140-071
Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	H9658
Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)	Enzo Life Sciences	BML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing)	Boston BioProducts	BP-110R
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225