Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ubiquitine-proteasoom-systeem is onlangs betrokken bij diverse pathologieën waaronder neurodegeneratieve ziekten en kanker. Gezien deze technieken voor het bestuderen van reguleringsmechanisme van dit systeem zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire en moleculaire processen van bovengenoemde ziekten. Het gebruik van hemagglutinine afkomstig ubiquitine probes die in dit document dient als een waardevol hulpmiddel voor de studie van dit systeem. Deze paper Gegevens een methode die de gebruiker in staat stelt om te testen die een directe visualisatie van ubiquitinerings enzymactiviteit te voeren. Ubiquitinerings enzymen regelen proteasomale afbraak en functionele homologie delen hun actieve plaatsen, waarmee de gebruiker de activiteit van verschillende enzymen in een assay te onderzoeken. Lysaten worden verkregen door middel van zachte mechanische celdisruptie en geïncubeerd met actieve plaatsgerichte probes. Functionele enzymen worden gelabeld met de sondes tijdens inactieve enzymen ongebonden blijven. Door running deze test krijgt de gebruiker informatie over zowel de activiteit en mogelijke expressie van meerdere ubiquitinerings enzymen op een snelle en gemakkelijke wijze. De huidige methode is significant efficiënter dan het gebruik van afzonderlijke antilichamen voor de voorspelde honderd ubiquitinerings enzymen in de menselijke cel.
Inleiding
De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) dient als een van de belangrijkste afbraakroutes in de zoogdiercel. Substraten gebonden voor de afbraak in het proteasoom covalent gelabeld met polymeren van ubiquitine (Ub) 1. Voor het beoogde substraat komt het proteasoom voor afbraak, moet de poly-ubiquitine tag verwijderd. Een klasse van enzymen bekend als ubiquitinerings enzymen (Dubs) is verantwoordelijk voor de verwijdering en recycling van ubiquitine moleculen 2. Volgens schattingen van het menselijk genoom dat er bijna honderd Kopieën die in de cel 3. Met een dergelijk groot aantal nasynchroniseert regelen Ub-gemedieerde cellulaire proce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Lysis Buffer Voorbereiding
- Los sucrose in gedeïoniseerd (DI) water met een 2 M voorraadoplossing te maken. Filtreer een 2 M oplossing van sucrose met behulp van een vacuüm aangedreven 0,22 urn polyvinylideenfluoride (PVDF) filter.
- Los dithiothreitol (DTT) in DI water om een 500 mM voorraad oplossing en op te slaan onder anaerobe omstandigheden te maken. Los magnesiumchloride (MgCl2) in DI water om een 100 mM voorraad oplossing te maken. Los adenosine trifosfaat (ATP) dinatrium hydrateren in DI water om een 50 mM voorraad oplossing te maken.
- Maak een Tris bij pH 7,4 door het oplossen Trizma hydrochloride in DI-water en ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gekweekte M17 en HeLa-cellen werden geoogst met behulp van de methode beschreven in het protocol (3 Cell Oogst) en de muis ruggenmerg weefsel werd verkregen. De celpellet / ruggenmerg werd in een buis met lysis buffer in het reagens bereiding beschreven. Celpellets werden gelyseerd middels glasparels (figuur 1A) en muis ruggenmerg weefselmonsters werden gehomogeniseerd met de homogenisator (Figuur 1B). Na lysis of homogeniseren werd het monster gecentrifugeerd bij 5030 xg om de glaspare.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aangezien ubiquitinatie is een fundamenteel celactiviteit begrijpen van de regelmechanismen kan de sleutel opgraven de processen van ziekte en pathologie. Het gebruik van HA tag Ub-afgeleide actieve gerichte sondes hier gemeld biedt een eenvoudige, maar zeer toepasbare methode voor het bestuderen van Ub-gemedieerde afbraak van eiwitten. Deze werkwijze is sneller en goedkoper dan het bestuderen elk van de dubs afzonderlijk.
In deze werkwijze, wordt de lyse van de cellen bereikt door mechanisc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zouden graag de Lee lab van de Universiteit van Minnesota bedanken voor het verstrekken van de muis ruggenmerg weefselmonsters die werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door de Randy Shaver Cancer Research Fund en Gemeenschap MB en door de Minnesota eierstokkanker Alliance (MOCA) naar MB. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
Referenties
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
