Method Article

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

DOI:

10.3791/52784

⸱

May 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ubiquitine-proteasoom-systeem is onlangs betrokken bij diverse pathologieën waaronder neurodegeneratieve ziekten en kanker. Gezien deze technieken voor het bestuderen van reguleringsmechanisme van dit systeem zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire en moleculaire processen van bovengenoemde ziekten. Het gebruik van hemagglutinine afkomstig ubiquitine probes die in dit document dient als een waardevol hulpmiddel voor de studie van dit systeem. Deze paper Gegevens een methode die de gebruiker in staat stelt om te testen die een directe visualisatie van ubiquitinerings enzymactiviteit te voeren. Ubiquitinerings enzymen regelen proteasomale afbraak en functionele homologie delen hun actieve plaatsen, waarmee de gebruiker de activiteit van verschillende enzymen in een assay te onderzoeken. Lysaten worden verkregen door middel van zachte mechanische celdisruptie en geïncubeerd met actieve plaatsgerichte probes. Functionele enzymen worden gelabeld met de sondes tijdens inactieve enzymen ongebonden blijven. Door running deze test krijgt de gebruiker informatie over zowel de activiteit en mogelijke expressie van meerdere ubiquitinerings enzymen op een snelle en gemakkelijke wijze. De huidige methode is significant efficiënter dan het gebruik van afzonderlijke antilichamen voor de voorspelde honderd ubiquitinerings enzymen in de menselijke cel.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) dient als een van de belangrijkste afbraakroutes in de zoogdiercel. Substraten gebonden voor de afbraak in het proteasoom covalent gelabeld met polymeren van ubiquitine (Ub) 1. Voor het beoogde substraat komt het proteasoom voor afbraak, moet de poly-ubiquitine tag verwijderd. Een klasse van enzymen bekend als ubiquitinerings enzymen (Dubs) is verantwoordelijk voor de verwijdering en recycling van ubiquitine moleculen 2. Volgens schattingen van het menselijk genoom dat er bijna honderd Kopieën die in de cel 3. Met een dergelijk groot aantal nasynchroniseert regelen Ub-gemedieerde cellulaire proce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lysis Buffer Voorbereiding

  1. Los sucrose in gedeïoniseerd (DI) water met een 2 M voorraadoplossing te maken. Filtreer een 2 M oplossing van sucrose met behulp van een vacuüm aangedreven 0,22 urn polyvinylideenfluoride (PVDF) filter.
  2. Los dithiothreitol (DTT) in DI water om een ​​500 mM voorraad oplossing en op te slaan onder anaerobe omstandigheden te maken. Los magnesiumchloride (MgCl2) in DI water om een 100 mM voorraad oplossing te maken. Los adenosine trifosfaat (ATP) dinatrium hydrateren in DI water om een ​​50 mM voorraad oplossing te maken.
  3. Maak een Tris bij pH 7,4 door het oplossen Trizma hydrochloride in DI-water en ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gekweekte M17 en HeLa-cellen werden geoogst met behulp van de methode beschreven in het protocol (3 Cell Oogst) en de muis ruggenmerg weefsel werd verkregen. De celpellet / ruggenmerg werd in een buis met lysis buffer in het reagens bereiding beschreven. Celpellets werden gelyseerd middels glasparels (figuur 1A) en muis ruggenmerg weefselmonsters werden gehomogeniseerd met de homogenisator (Figuur 1B). Na lysis of homogeniseren werd het monster gecentrifugeerd bij 5030 xg om de glaspare.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien ubiquitinatie is een fundamenteel celactiviteit begrijpen van de regelmechanismen kan de sleutel opgraven de processen van ziekte en pathologie. Het gebruik van HA tag Ub-afgeleide actieve gerichte sondes hier gemeld biedt een eenvoudige, maar zeer toepasbare methode voor het bestuderen van Ub-gemedieerde afbraak van eiwitten. Deze werkwijze is sneller en goedkoper dan het bestuderen elk van de dubs afzonderlijk.

In deze werkwijze, wordt de lyse van de cellen bereikt door mechanisc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag de Lee lab van de Universiteit van Minnesota bedanken voor het verstrekken van de muis ruggenmerg weefselmonsters die werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door de Randy Shaver Cancer Research Fund en Gemeenschap MB en door de Minnesota eierstokkanker Alliance (MOCA) naar MB. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PowerGen 125 (homogenizer)Fischer Scientific14-261-02P
Vacuum-driven filters 0.22 µmBPV2210
Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve)Sigma-aldrichG4649-10G
SucroseFischer ScientificS6-212
DL-dithiothreitolSigma-AldrichD0632
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichA26209
Trizma hydrochlorideSigma-AldrichT3253
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-092
Phosphate buffered salineLife Technologies10010-023
Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
0.05% Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Monoclonal anti-HA antibody produced in mouseSigma-AldrichH9658
Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

Related Articles