Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

Samenvatting

Hier beschrijven we een semi-invasieve optische microscopiebenadering voor het induceren van een Rose Bengal fototrombotrotisch stolsel in de somatosensorische cortex van een muis in vivo. De technische aspecten van de beeldvormingsprocedure worden beschreven, van de inductie van een fototrombotrotisch evenement tot de toepassing en gegevensverzameling.

Samenvatting

In vivo beeldvormingstechnieken zijn in gebruik genomen als gevolg van recente vorderingen in beeldvormingskleurstoffen en optische technologieën, waardoor het mogelijk wordt om cellulaire gebeurtenissen in een intact dier te beeldvormen. Bovendien vergroot de mogelijkheid om fysiologische ziektetoestanden zoals een beroerte in vivo te induceren de bruikbaarheid ervan. De hier beschreven techniek maakt fysiologische beoordeling van cellulaire reacties binnen het CZS na een beroerte mogelijk en kan worden aangepast voor andere pathologische aandoeningen die worden bestudeerd. De gepresenteerde techniek maakt gebruik van laserexcitatie van de lichtgevoelige kleurstof Rose Bengal in vivo om een focaal ischemische gebeurtenis in een enkele bloedvat te induceren.

Het videoprotocol toont de voorbereiding van een dunne craniale venster over de somatosensorische cortex bij een muis voor de inductie van een Rose Bengal fototrombotische gebeurtenis met minimale schade aan het onderliggende dura-weefsel en de hersenen. Chirurgische voorbereiding wordt in eerste instantie uitgevoerd onder een dissectiescoop met een op maat gemaakt chirurgisch/beeldvormingsplatform, dat vervolgens wordt overgebracht naar een confocale microscoop uitgerust met een omgekeerde objectievenadapter. Representatieve beelden verkregen met behulp van dit protocol worden gepresenteerd, evenals time-lapse sequenties van beroerte-inductie. Deze techniek is krachtig omdat hetzelfde gebied herhaaldelijk op opeenvolgende dagen kan worden beeldvormd, wat longitudinale in vivo studies van pathologische processen na een beroerte mogelijk maakt.

Inleiding

De techniek beschreven vergunningen visualisatie van in vivo cellulaire reacties onmiddellijk na inductie van Rose Bengal photothrombosis in een intacte muis. Rose Bengal (4,5,6,7-tetrachloor-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) een fotogevoelige gebruikt om ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) induceren. Na een bolus injectie van RB door de staartader en de daaropvolgende verlichting door middel van een uitgedund schedel met een 564 nm laserlicht, is een trombus inductiestroom het veroorzaken van een fysiologische slag ^1. De methode werd oorspronkelijk beschreven door Rosenblum en El-Sabban in 1977, en werd later aangepast door Watson in het midden van de jaren 1980 ^1,2. In het kort, wordt Rose Bengal bestraald met groene excitatielicht (561 nm laser in ons geval), die de productie van reactieve zuurstof species, die vervolgens activeert weefselfactor, een initiator van de stollingscascade gegenereerd. De inductie van de stollingscascade produceert een ischemisch lesion dat pathologisch relevant klinische beroerte ^3.

Beroerte heeft een complexe pathofysiologie gevolg van de invloed van vele verschillende celtypen waaronder neuronen, glia, endotheel en het immuunsysteem. Het kiezen van de beste techniek te bestuderen van een bepaald cellulair proces vereist meerdere overwegingen. Experimentele technieken vallen ruwweg in drie categorieën: in vitro, in vivo en in silico met elk voor- en nadelen In vitro studies hebben de primaire nadeel van het verwijderen van cellen uit hun natuurlijke omgeving en daarom mag geen effecten gezien in een intacte reproduceren. levend dier. In vivo technieken zorgen voor een verbeterde experimentele replicatie van ziektebeelden met een verhoogde translatie betekenis. In silico algemeen verwijst naar computermodellen van een ziekte of een cellulair proces, en terwijl in toenemende mate gebruikt om mogelijke interacties tussen geneesmiddelen voor examen studerenple, alle informatie die verkregen moet nog getest worden in levende cellen of weefsels.

Het ideale model van een beroerte in het laboratorium instelling moet aantonen vergelijkbaar pathologische kenmerken met die in de menselijke populatie. Hoewel er gemeenschappelijke fysiologische kenmerken van een beroerte in de humane populatie, zijn er ook veel verschillen afhankelijk van het type schade voor. Stroke in de humane populatie voorkomt als klein of groot vat occlusies, hemorrhagische laesies en slagader te slagader of cardio-embolieën die resulteren in verschillende infarct volumes en de verschillen in mechanismen die verantwoordelijk elke pathologie. Het voordeel van het gebruik van dierlijke tweetaktmodellen is het genereren van reproduceerbare infarcten die karakteristieken van menselijke beroerte nabootsen. De meest voorkomende dier beroerte modellen omvatten slagader occlusie met: midden cerebrale slagader occlusie (embolische of endovasculaire filament methoden), die modellen distale MCAO en de photothrombosis model. De voordelen van eend nadelen van elk model zijn elders beoordeeld (zie ⁴ en ^5). Global ischemische modellen (MCAO), terwijl het relatief eenvoudig uit te voeren zijn minder relevant voor de menselijke beroerte dan zijn brandpunt takt modellen. Bovendien zijn deze werkwijzen zeer variabel in induceren reproduceerbare herseninfarct laesies. Het photothrombosis model is zeer reproduceerbaar zolang de experimentator regelt hun experimenten goed, een duidelijk voordeel ten opzichte MCAO modellen. Vanwege microvasculatuur insult model is beschreven een minimale ischemische penumbra, het gebied waar de cellen worden verondersteld redden ^6,7 te geven. Bovendien kunnen vasogeen oedeem en cytotoxische oedeemvorming worden geïnduceerd na bestraling van het beeldgebied. Ondanks deze beperkingen techniek nieuwe inzichten voorziet in vele fysiologische processen na beroerte ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Opmerking: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio en waren in overeenstemming met de richtlijnen KOMEN.

1. verlamming voor Cortical Voorbereiding

1. Plaats de muis in een inductie kamer met 2-3% isofluorane gemengd met zuurstof om anesthesie. Let op de ademhaling daling als de muis wordt geïnduceerd. Knijp de poot van de muis te bepalen of de muis is klaar om te verhuizen naar de neuskegel. Opmerking: Anesthesie-niveau is een cruciale stap in een in vivo voorbereiding en de zorg moeten worden genomen een niveau dat globale ischemie zal leiden tot niet te induceren.
2. Zodra de muis voldoende verdoofd Breng het dier de operatie / imaging platform en plaats neus van de muis in de neuskegel en toepassing 1-1,2% isofluorane een verdoofde toestand te houden. Zorg ervoor dat de muis is liggend op een temperatuur controlled verwarmingskussen de lichaamstemperatuur (37 ° C +/- 0,5 ° C) gedurende de gehele verdere procedures. Plaats dierenarts zalf over de ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose.
3. Bewaken van de fysiologie van de muis met een pulsoximetrie systeem met de staart of voet clip die bij het systeem. Controleer of de ademhaling wordt gehandhaafd tussen 50-65 ademhalingen / min. Controleer of de hartslag blijft tussen 300-450 bpm en zuurstofverzadiging wordt gehandhaafd tussen de 97-98% op de lange-termijn overleving van het dier te waarborgen.
4. Wanneer de muis voldoende is verdoofd, scheren de haren over de schedel met elektrische tondeuse, verwijder resterende haren en schoon met betadine, gevolgd door een ethanol wattenstaafje. Herhaal deze procedure tot driemaal een steriele chirurgische milieu.

2. Chirurgische Procedure

1. Met de hoofdhuid volledig gereinigd en geschoren, maak een 5 mm incisie in de hoofdhuid van de muis om de schedel fissu onthullenres en bregma lokaliseren.
2. Gebruik een steriele katoenen applicator om eventuele resterende fascia bovenop de schedel te verwijderen.
3. Lijm een maat roestvrij stalen ring (figuur 1) met weefsellijm het bot ligt over de pariëtale cortex met de stereotactische coördinaten van Bregma: -1 tot -3 mm en zijdelings: 2-4 mm. Opmerking: De lijm bevat meestal binnen 2 minuten na de plaatsing van de ring op het bot.
4. Bevestig de ring een stereotaxische houder (figuur 2) aan de muis te stabiliseren en om beweging te voorkomen tijdens de beeldvorming.
5. Onder een chirurgische kwaliteit dissectiemicroscoop langzaam boren een sectie 1-2 mm in de schedel met een snelheid gecontroleerd dremel-achtige tool (Meisinger 3.9 mm boor) en zorg ervoor dat het gebied niveau te houden als het wordt geboord. Dit te bereiken met behulp van een zig-zag patroon. Om te voorkomen dat de warmte opbouwen, stelt de boor snelheid te laag en neem regelmatig pauze.
6. Als de schedel schedel wordt shinny in verschijning, blijven het dunnervan de schedel met een scalpel die dezelfde zigzagpatroon op het dun maaiveld houden vlotte verwijdering van dunne lagen craniale schedel vergemakkelijken. De tip van de scalpel te kleine lineaire slagen met lichte druk om dunne lagen been per keer verwijderen. Herhaal dit totdat het vaatstelsel is duidelijk zichtbaar door de dissectiemicroscoop.
7. Wanneer de experimentator prikt met of breken schedel tijdens de verdunningswerkwijze, inslapen het dier wegens waarschijnlijk schade aan de onderliggende cortex.
   Opmerking: De muis schedel is ongeveer 300 urn dik en bestaat uit twee dunne lagen compacta (een externe en een interne laag) en een laag sponsachtig bot ingeklemd tussen twee lagen compacta. De deklaag van compacta en het merendeel van het sponsachtige bot verwijderd in de 5 mm boring zone resulteert in een ongeveer 50 pm laag van compacta resterende (zie figuur 2B). Visualizatie van de vasculatuur zal ervoor zorgen dat de uiteindelijke intact verdunde schedel is ongeveer 50 urn dik. De schedel is dus nog steeds aanwezig is wanneer verdund tot deze dikte.

3. Microscoop Set-up

1. Gebruik een omgekeerde microscoop systeem (conventioneel, confocale of twee-foton systemen) die een doel omvormer heeft. Opmerking: Het is ook mogelijk een standaard microscoop rechtop gebruiken. De beperkende factor is de ruimte tussen de trap en de doelstellingen. Wijzigingen aan het podium kan nodig zijn om deze opstelling te verwezenlijken.
2. Zet de chirurgische / imaging platform een ​​maat fase die zich terzijde de onderkant van de microscoop. Opmerking: Het platform wordt gedaan met een klinisch aansluiting om verticale beweging van de chirurgische / imaging platform van de doelstelling mogelijk. Het laboratorium aansluiting is gemonteerd op een plaat bevestigd aan vier cilindrische palen. (Zie Figuur 2).
3. Plaats de doelstelling omvormer met een 20Xobjectieve over de schedel raam. Gebruik een externe lichtbron op de schedel raam te vinden door te kijken door de oculairs van de microscoop en plaats de doelstelling in het beeldgebied. Opmerking: Het opnamegebied wordt aangeduid door de aanwezigheid van de vasculatuur.
4. Voor watergedragen doelstellingen nog kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) (130 mM NaCl, 30 mM KCI, 12 mM KH _{2PO 4;} 200 mM NaHCO _3; 30 mM HEPES en 100 mM glucose) als medium vanwege mogelijke lekkage in de schedelholte tijdens beeldvorming (figuur 3).

4. Rose Bengal Dye Voorbereiding, Administratie en Inductie van Stroke

1. Bereid een frisse 20 mg / ml oplossing van Rose Bengal in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF); filteren en steriliseren vóór toediening. Niet hergebruiken of bewaar de Bengaals als het eenmaal is gemengd. Maak een verse oplossing voor elk experiment.
2. Geef een 0,1 ml staartader injectie van Rose Bengal, terwijl scanning de craniale raam met een 561 nm laser voldoende injectie van de oplossing te waarborgen. Opmerking: Rose Bengal wordt gevisualiseerd binnen 5 seconden na injectie in het vaatstelsel van de hersenen. Het gehele schip moet worden gevuld met Rose Bengal.
3. Na een adequate injectie van kleurstof Rose Bengal kiezen een geschikt schip voor trombose op basis van diameter vat (40-80 micrometer) om de reproduceerbaarheid van een bepaalde laesie volume zorgen. Onderscheid tussen slagaders en aders door te kijken naar de richting van de bloedstroom: slagaders zal verhuizen van grotere diameter tot schepen kleinere diameter, aders verplaatsen van kleinere schepen tot grotere diameter. Dit is eenvoudig te realiseren door visualisatie keer Rose Bengal wordt geïnjecteerd.
4. Wijzig de microscoop instelling als volgt:
   1. Verhoog de verblijftijd. Opmerking: Dit is afhankelijk van de microscoop systeem wordt gebruikt.
   2. Verhoog het laservermogen tot 100%.
   3. Verzamel tijdsequentie beelden op 1 beeld / sec met behulp van demaximale scansnelheid.
5. Scan de muis tot een stabiele stolsel gevormd in het vat. Opmerking: Dit wordt typisch bereikt binnen 5 min continu scannen (zie figuur 4).
6. Na de inductie van stolselvorming met Rose Bengal, verwijdert u de muis van de beeldvorming gebied terug naar de dissectiemicroscoop. Verwijder de roestvrij stalen ring voorzichtig uit de schedel schedel. Onderzoek de craniale venster voor bloeden. Als bloeden optreedt, beëindigen het experiment.
7. Gebruik 6.0 monofilament hechtdraad om de incisie te sluiten over de schedel. Plaats antibiotische zalf langs de hechtdraad lijn om infectie te voorkomen. Injecteer Buprenex (0,05 mg / kg) subcutaan om de 12 uur gedurende drie dagen voor pijnbestrijding.
8. Zet de muis op een herstel kamer na verwijdering uit de narcose tot helemaal wakker en vrij bewegen.
9. Breng de muis een schone kooi voor verder onderzoek op een later tijdstip.

5. Longitudinale Imaging op volgende dagen

1. Maken gebruik van de volgende methoden om longitudinale beeldvorming uit te voeren op de volgende dagen na de photothrombosis.
   1. Verdoven van de muis, zoals beschreven in artikel 1 van de methoden.
   2. Bij voldoende verdoving opnieuw te openen op de hoofdhuid door het verwijderen van alle resterende hechtingen aan de huid bovenop de eerder geboorde imaging gebied te heropenen.
   3. Gebruik een steriele katoenen applicator om eventuele resterende fascia bovenop de schedel te verwijderen.
   4. Lijm een maat roestvrij stalen ring (figuur 1) met weefsellijm het bot ligt over het vorige veld imaging.
   5. Bevestig de ring een stereotaxische houder (figuur 2) aan de muis te stabiliseren en om beweging te voorkomen tijdens de beeldvorming.
   6. Zoek het vaatstelsel grondslag liggen aan de eerder uitgedund schedel. Gebruik staartader injectie van FITC-dextran aan de aanwezigheid van de eerder opgewekte stolsel verifiëren.
   7. Gebruik 6.0 monofilament hechtdraad aan de in te sluitenCision over de schedel. Plaats antibiotische zalf langs de hechtdraad lijn om infectie te voorkomen. Injecteren Buprenex (0,05 mg / kg) subcutaan om de 12 uur gedurende drie dagen voor pijnbestrijding.
   8. Zet de muis op een herstel kamer na verwijdering uit de narcose tot helemaal wakker en vrij bewegen.

6. Keuring van Stroke Inductie (Post-mortem)

1. Bij de conclusie van een studie, controleren slagvolume met 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) vlekken zoals weergegeven in figuur 5. De volledige methode kan worden gevonden in ^12.

Resultaten

Het doel van deze werkwijze was een ischemische beroerte in diermodellen (muis en rat) na een bolus injectie van RB met de staartader en daaropvolgende belichting van een schedel verdund met 561 nm laserlicht induceren. De afbeeldingen in figuur 4 tonen de voortgang van stolselvorming in een enkel vat na bestraling van het gebied van 0, 1, 1,5 en 2 minuten. Voorafgaand aan de vorming van een stolsel het hele schip is wit te wijten aan vrij stromende Rose Bengal. Na de inductie van bestraling van het vat...

Discussie

De mogelijkheid om experimentele beroerte pathofysiologie vertalen van dier op mens applicatie is geplaagd door mislukking. Het gebruik van diermodellen, zoals photothrombosis model zorgt voor beter begrip van beroerte pathofysiologie en de exploratie van nieuwe therapeutische benaderingen voor neurobescherming na een beroerte. Kleine corticale beroertes en microinfarctions door de fototrombotisch model is klinisch relevant subklinische of "stille" stroke ^13-15, die een hoge prevalentie en treft ong...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose en 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)