Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp In Vivo En In Vitro Testen

Summary

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Abstract

Karakteriseren thymus regelen voorlopercellen van belang te begrijpen van de pre-thymus stadia van T cel ontwikkeling essentieel strategieën voor T-cel vervanging lymfopenische patiënten ontwikkelen. We bestudeerden thymus afwikkeling progenitoren murine embryonale dag 13 en 18 thymi twee complementaire in vitro en in vivo technieken, beide gebaseerd op de "opknoping drop" methode. Deze methode toegestaan ​​koloniseren bestraalde foetale thymus lobben met E13 en / of E18 thymus voorlopers onderscheiden door CD45 allotypische markers en dus na hun nageslacht. Kolonisatie met gemengde bevolking maakt het analyseren cel autonome verschillen in de biologische eigenschappen van de voorouders, terwijl kolonisatie met ofwel bevolking verwijdert mogelijk concurrerende selectieve druk. De gekoloniseerde thymus lobben kan ook geënt in mannelijke immunodeficiënte ontvangende muizen waardoor de analyse van het rijpe T cel nakomelingen in vivo, zoals populatiedynamica van tHij perifere immuunsysteem en kolonisatie van verschillende weefsels en organen. Foetale thymus orgaankweken gebleken dat E13 voorlopers snel ontwikkeld in alle volwassen CD3 ⁺ cellen en leidde tot de canonieke γδ T cel subsets, zogenaamde dendritische epitheliale T cellen. Ter vergelijking, E18 voorlopers een vertraagde differentiatie en konden dendritische epitheliale T cellen te genereren. De controle van perifeer bloed-thymus geënte CD3 ^{- / -} muizen voorts gebleken dat E18 thymus regelen voorlopers genereren, tijd, grotere aantallen mature T cellen dan hun tegenhangers E13, een eigenschap die niet konden worden gewaardeerd in de foetale thymus korte termijn orgaankweken.

Introduction

T-lymfocyten, met het αβ of γδ T-celreceptor (TCR), differentiëren in een gespecialiseerd orgaan, de thymus. De volledig ontwikkelde thymus is georganiseerd in twee verschillende gebieden: de cortex, waar de thymus voorouders ontwikkelen en waar de thymocytes dat productief herschikken de TcR β en α-keten genen worden gered van de dood geprogrammeerd (een proces dat bekend staat als positieve selectie); en het merg, waar de geselecteerde thymocyten met te sterke reactiviteit op self-liganden worden verwijderd (negatieve selectie) ^1,2. De thymus is afkomstig van de endodermale laag van het derde faryngeale zak die later wordt omgeven door mesenchymale celle....

Protocol

Ethiek statement: alle experimenten werden uitgevoerd volgens het Pasteur Instituut Ethic Charter, door het Franse ministerie van Landbouw goedgekeurd en aan de EU-richtlijnen. Een manipulator met een opleiding op kleine knaagdieren chirurgie, gecertificeerd door het Franse ministerie van Landbouw, voert alle chirurgische ingrepen.
OPMERKING: Zie bijlage Tabel 1 toont het 5-stappenplan procedure.

1. Selectie van de embryo's

1. Gebruik 36 C57BL / 6 vrouwtjes CD45.2, CD45.1 12 vrouwen, 12 C57BL / 6 mannetjes en CD45.1 12 C57BL / 6 mannetjes CD45.2. Overschrijding van de vrouwen met mannelijk genotype prod....

Results

Om een ​​methode thymus lobben van endogene thymocyten waardoor betere ontwikkeling koloniseren progenitors afbrekende kiezen, vergeleken we de niveaus van T-cel reconstitutie thymus lobben gekoloniseerd na bestraling of een 5-daagse deoxy-guanosine (d-Gua) behandeling. De resultaten tonen dat, terwijl er geen verschil op dag 9 van kweek, bestraald kwabben bevatte meer T-cellen dan behandeld met d-Gua, op dag 12. Aldus bestraling geschikter dan d-Gua behandeling om T cel ontwikkeling verzoekt nadat thymus kolonisatie

Discussion

Twee belangrijke testen kunnen worden gebruikt om T-celdifferentiatie ex vivo te analyseren. De laatst gerapporteerde de co-cultuur van hematopoiëtische progenitors met BM stromale cellen, OP9, de uiting van de liganden van Noth1, delta zoals 1 of 4 ^12. Het 2-D test is gemakkelijk uit te voeren zeer efficiënte en gevoelige, waardoor analyse op de single cell niveau. Echter geen ondersteuning T cel ontwikkeling dan het stadium van DP noch de vorming van γδ DETC ^13, die beide vereisen direct.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility actions
Ketamine 100 mg/ml (stock solution)	MERIAL		Anesthesic
Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution	AXIENCE		Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health		Eye protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fetal calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2-Mercaptoethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine iris scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment