Methodenartikel

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution In Situ Hybridisatie

DOI:

10.3791/52799

⸱

17 juni 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA's worden vaak gelokaliseerd op gewervelde axonen en hun lokale vertaling nodig is voor axon pathfinding of vertakking tijdens de ontwikkeling en voor onderhoud, reparatie of neurodegeneratie in postdevelopmental periodes. High throughput analyses hebben onlangs onthuld dat axonen hebben een meer dynamische en complexe transcriptoom dan eerder werd verwacht. Deze analyse, maar zijn meestal gedaan in gekweekte neuronen wanneer axonen kunnen worden geïsoleerd uit de somato-dendritische compartimenten. Het is vrijwel onmogelijk om dergelijke scheiding bereiken geheel weefsels in vivo. Aldus, teneinde de werving van mRNA en hun functionele relevantie verifiëren in een geheel dier, transcriptoom analyse idealiter worden gecombineerd met technieken die de visualisatie van mRNA in situ mogelijk. Onlangs hebben roman ISH technologieën die RNA's in een enkel-molecuul niveau te detecteren ontwikkeld. Dit is vooral belangrijk wanneer de analyse van de subcellulaire lokalisatie van mRNA, Omdat gelokaliseerde RNA's zijn doorgaans te vinden op een laag niveau. Hier beschrijven we twee protocollen voor de detectie van axonally-mRNA gelokaliseerd met behulp van een nieuwe ultragevoelige RNA ISH techniek. We hebben samen RNAscope ISH met axonen tegenkleuring met behulp van fluorescentie immunohistochemie of histologische kleurstoffen voor de aanwerving van ATF4 mRNA om axonen in vivo in de volwassen muis en menselijke hersenen te controleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axonal mRNA werving en lokale vertaling staat axonen te reageren op extracellulaire stimuli in een tijdelijk en ruimtelijk acute manier 1. Intra-axonen eiwitsynthese wordt het best begrepen in de context van neurodevelopment waar het speelt een cruciale rol in de groei kegel gedrag 2-8, axon pathfinding 9-11 en retrograde signalering 12,13. Maar veel minder bekend over de functionele betekenis van axonale eiwitsynthese in post-ontwikkelings neuronen bij axonale mRNA en ribosoom niveaus sterk gereduceerd 14,15. Volwassen gewervelde axonen hebben lange tijd gedacht translationeel inactief 16 te zijn. Echter, recente studies tonen aan dat de lokale vertaling wordt geactiveerd in volwassen axonen onder pathologische omstandigheden. Zo wordt een gedeelte van mRNA's gerekruteerd voor regenererende axons na zenuwletsel en intra-axonale eiwitsynthese is die voor een doelmatige regeneratie van axons die 17. Bovendien, onze groep has aangetoond dat specifieke mRNAs worden gerekruteerd voor axons na plaatselijke blootstelling aan de ziekte van Alzheimer Aß peptide 1-42 en lokale translatie van de transcriptiefactor ATF4 moet het neurodegeneratieve effect van Aß 1-42 propageren van axonen in de neuronale soma 18. Tenslotte hebben high throughput analyse bleek dat de volwassen axonen een complexer en dynamische transcriptoom dan verwacht 18-21, in het bijzonder onder pathologische omstandigheden. Gezien deze studies, een zeer gevoelige en specifieke methode voor het opsporen axonally gelokaliseerde mRNA's in het volwassen zenuwstelsel nodig.

Veel van het werk op mRNA werving en lokale vertaling in het volwassen axonen is uitgevoerd op gekweekte neuronen. Dit geldt vooral voor transcriptoom analyse sindsdien gespecialiseerd kweekmethoden bestaan ​​die de isolatie van axonen van de somato-dendritische compartimenten 18-20 toe. Hoewel dergelijke studies waardevolle ins hebben gegevenechts in de rol van de lokale vertaling in volwassen axonen, de vraag of gekweekte neuronen getrouw beeld geeft van de situatie in vivo of als mRNA recruitment is een adaptieve reactie van axonen te kweken voorwaarden is nog open. Weinig studies hebben het bewijs van mRNA rekrutering axonen rijpen in vivo voorzien. Zo is het transcript coderend voor het olfactorische markereiwit aangetroffen in neuronen van volwassen sensorische neuronen 22. Een transgen met de 3 'UTR van β-actine mRNA wordt getransporteerd naar axonen in het perifere en centrale zenuwstelsel neuronen bij muizen en lokaal vertaald naar ontwikkelings- periode 23. Lamin b2 mRNA is gelokaliseerd op het netvlies axonen in Xenopues laevis kikkervisjes en de uitputting van invloed axon onderhoud na axonale ontwikkeling 21. Interferentie met het axonale transport van het mRNA dat codeert voor cytochroom C oxidase IV verandert muisgedrag 24. Tenslotte ATF4 mRNA wordt gevonden bij volwassen eenXON van muizen en menselijke hersenen in het kader van Aß 1-42 geïnduceerde neurodegeneratie 18.

Hoge doorvoer transcriptoom analyses hebben bewezen nuttig te zijn om mRNA profielen in geïsoleerde axonen in vitro te identificeren, maar hebben beperkingen voor in vivo studies sinds geheel weefsels axonen zijn nooit gevonden in afzondering, maar vermengd met neuronale cellichamen, gliacellen en andere celtypen. Derhalve dergelijke analyses moeten worden gecombineerd met beeldvormende technieken die de subcellulaire lokalisatie van mRNA te bevestigen. RNA in situ hybridisatie (ISH RNA) maakt de detectie en visualisatie van specifieke RNA sequenties in cellen en weefsels. Echter, originele RNA ISH assays alleen geschikt voor de identificatie van zeer overvloedige RNAs 25, hetgeen zelden het geval axonally gelokaliseerde mRNA's. Voor de laatste decennia toenemende inspanningen hebben in het ontwikkelen van nieuwe technologieën die de detectie van mRNA mogelijk maken bij de single-molecule niveau gezet 25,26. Zo hebben Singer en collega ISH probes ontwikkeld om mRNA te detecteren in enkele cellen, bestaande uit 5 niet-overlappende fluorescent gelabelde 50-meren (voor details zie 27). Het belangrijkste verschil tussen de hierboven genoemde technieken en de hier beschreven dat de hoger gebruikt 20 double Z-structuur (lineair) probes die doorgaans gericht ~ 1 kb gebied van het RNA van belang te zorgen specificiteit en lage achtergrondniveaus. Probes worden vervolgens gehybridiseerd met voorversterker en versterker sequenties die uiteindelijk fluorescent gelabeld of geconjugeerd met chromogene enzymen die reacties mogelijk maken. Deze amplificatiestappen betere signaal-ruisverhouding vergeleken met andere technologieën ISH 28. Hier beschrijven we twee protocollen gebruiken RNAscope gecombineerd ofwel met fluorescentie immunocytochemie of met histologische kleurstoffen waardoor axonen tegenkleuring. Beide protocollen zijn geschikt om axonale lokalisatie van ATF4 mRNA in volwassen mo visualiserenGebruik en menselijke hersenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC van Columbia University en de geldende richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd. Opmerking: Bereid alle buffers gebruikt voor de ISH procedures in RNase-vrij of-DEPC behandeld water. Deze aanbeveling is niet strikt noodzakelijk nadat ISH is voltooid, maar het wordt gesuggereerd dat buffers nog steeds worden bereid in geautoclaveerde dubbel gedestilleerd water en / of gesteriliseerd door filtering.

1. Detectie van ATF4 mRNA gelokaliseerd Cholinerge axonen in de volwassen hersenen van muizen met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) Gevolgd door immunohistochemie

  1. Monstervoorbereiding voor paraformaldehyde vaste bevroren hersenen plakjes
    1. Voor het volgende voorbeeld bereiden segmenten van vaste bevroren muis hersenen.
      1. Kortom, offeren 9 maanden oude muizen door anesthesie met ketamine (100 mg kg -1 lichaamsgewicht) en xylazine (10 mg kg -1 lichaam Weight) gevolgd door transcardial infusie van 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7,4).
      2. Verwijder hersenen en post-fix in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij 4 ° C.
      3. Na fixatie, wassen monsters driemaal in PBS en cryoprotect in 30% sucrose in PBS (pH 7,4) gedurende 24 uur bij 4 oC
      4. Insluiten hersenen in OCT bevriezen verbinding, serieel gedeelte aan 20 urn op een cryostaat en monteren op poly-D-lysine behandelde microscoopglaasjes. Houd hersencoupes bij -20 ° C tot gebruik.
    2. Verwijder-paraformaldehyde vaste hersenen segmenten van vriezer en lucht drogen gedurende 30 min bij RT.
    3. Was driemaal met 1 x PBS.
    4. In een zuurkast, re-fix hersencoupes 20 min met 4% paraformaldehyde bij RT.
      LET OP: LET OP: 4% paraformaldehyde is giftig en moeten worden behandeld en weggegooid adequaat volgende protocollen.
    5. Was driemaal met 1 x PBS.
    6. Uitdrogen hersenen plakjes.
      1. Bereid 50%, 75% en 100%ethanoloplossingen.
      2. Dompel de glaasjes in 50% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Dompel de glaasjes in 75% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Dompel slides in vers 100% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als alternatief kan objectglaasjes worden opgeslagen in 100% ethanol bij -20 o C tot 1 maand.
  2. FISH assay gevolgd door immunohistochemie met behulp van warmte-geïnduceerde antigen / RNA ontmaskering
    1. Voordat u begint te bereiden alle benodigde materialen:
      1. Verwarm de oven voor hybridisatie 40 o C en plaats een bak met gedistilleerd water in de oven om een vochtige omgeving te creëren.
      2. Neem een ​​dia doos en plaats papieren handdoeken gedrenkt in gedestilleerd water naar binnen om de doos dia bevochtigen. Plaats de doos dia in de hybridisatie oven.
      3. Verwijder probes (zowel negatief als doel probes) vanaf koelkast en verwarm ze in de hybridisatie-oven gedurende 10 min. Laat de sondes afkoelen down bij KT.
      4. Equilibreren amplificatiereagentia AMP 4/1 (in het Fluorescent Multiplex Reagent Kit) bij kamertemperatuur.
      5. Bereid antigen retrieval oplossing: 10 mM natriumcitraat (pH 6), 0,05% Tween 20. Opmerking: Solution kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen en voor onbepaalde tijd worden gebruikt voor toekomstige kleuring.
      6. Bereid 1x wasbuffer verdunnen van de 50x voorraad-oplossing (opgenomen in de TL-Multiplex Reagent Kit) in RNase-vrij of-DEPC behandeld water.
        OPMERKING: 1x wasbuffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 1 maand en worden gebruikt voor toekomstige kleuring. 50x wasbuffer zou neerslaan. Dan hitte 50x wasbuffer bij 40 ° C gedurende 10 min voor het bereiden van de 1 x oplossing.
    2. Verwijder dia's van 100% ethanol en drogen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Bereid een Coplin potje met 50 ml van antigen retrieval oplossing. Dompel slides in antigeenterugtrekking oplossing en kook ze gedurende 10 min in een magnetron.
      OPMERKING: U plaats schuift horizontaal in een 100 mmdiameter ronde glazen schaaltje met 100 ml van retrieval oplossing.
      1. Vul een 1 L beker met gedestilleerd water en plaats het in de magnetron.
        LET OP: Het water zal 'buffer' van de warmte bij het uitvoeren van ontmaskering.
      2. Plaats de dia's in antigen retrieval oplossing in de magnetron. Kook glijdt op hoog vermogen gedurende 5 minuten. Onmiddellijk nadat de monsters zijn gestopt koken, hitte glijdt weer op hoog vermogen voor extra 5 min.
      3. Afkoelen glijbanen bij RT.
        OPMERKING: Kritische stap: kooktijd en de procedure moeten worden bepaald door de gebruiker, afhankelijk van de microgolf eigenschappen. Hoe sneller het koken begint hoe groter de kans op oplossing verdampen. In dit geval wordt aanbevolen dat de monsters worden gekookt gedurende kortere tijdsperioden meer dan tweemaal totaal ontmaskering tijd van 10 minuten voltooid. Integendeel, wanneer verwarming wordt uitgevoerd bij gemiddeld of laag vermogen, ontmaskering worden eenmaal uitgevoerd gedurende 10 min. Indien de monsters niet koken continuously voor een totaal van ongeveer 10 minuten, kan dit leiden tot partiële ontmaskering van zowel het doelwit RNA en eiwitten te detecteren.
    4. Was dia driemaal met 1 x PBS.
    5. Voeg 2-3 druppels (~ 100 ul) van de dapB probeset die hersenplakjes gebruikt om achtergrondkleuring te beoordelen. Opmerking: De dapB sonde set richt zich op een bacterieel gen en mag geen zoogdieren RNA herkennen.
    6. Voeg 2-3 druppels van de targeting probeset die hersenplakjes gebruikt om het RNA van belang te detecteren. Opmerking: a probe set targeting resten 20 - 1381 van de muis ATF4 mRNA wordt in dit voorbeeld.
    7. Cover dia's met parafilm om sonde verdamping te voorkomen, plaats ze in de dia doos bevochtigde in de hybridisatie oven en incubeer ze op 40 o C gedurende 2 uur.
      Opmerking: optionele: extra hersenen plakjes kan worden gehybridiseerd met een sonde set targeting muis Polr2A en gebruikt als positieve controles.
    8. Wash slides tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 1-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
    10. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 2-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
    12. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    13. Voeg 2-3 druppels amplificatiereagens AMP 3-FL elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
    14. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    15. Voeg 2 - 3 druppels amplificatiereagens AMP 4-FL op elke hersenen slice, dekken dia's met parafilm, plaats ze in dedia doos en incubeer bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
    16. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal met 1 x PBS.
    17. Naar 100-200 gl (of voldoende volume volledig te bedekken plakken) van een blokkerende oplossing die 3 mg / ml BSA, 100 mM glycine en 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) op de objectglaasjes, bedek ze met parafilm en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    18. Naar 100-200 ul anti-ChAT antilichaam verdund in blokkerende oplossing (1/100) op de objectglaasjes, bedek ze met parafilm en incubeer gedurende 2 dagen bij 4 oC Zorg ervoor dat de hersenen plakjes niet uitdrogen. Indien nodig, re-toepassing anti-ChAT antilichaam oplossing voor de hersenen plakjes 24 uur na incubatie.
    19. Was glijdt driemaal in 1x PBS gedurende 5 min bij RT.
    20. Voeg 100-200 ul van de juiste Alexa-geconjugeerd secundair antilichaam (bijv., Alexa-594 ezel anti-geit voor dit specifieke voorbeeld) naar de dia's, dek af met parafilm en incubaten gedurende 1 uur bij KT.
    21. Was glijdt driemaal in 1x PBS gedurende 5 min bij RT.
    22. Was de dia's één keer met gedestilleerd water.
    23. Mount dia's met DAPI met montage medium.
    24. Visualiseer hersenen plakjes onder een fluorescentiemicroscoop.

2. Detectie van ATF4 mRNA gelokaliseerd Axons in Human Brain Monsters met Chromogene In Situ hybridisatie (CISH) Gevolgd door Luxol Fast Blue en cresylviolet Tegenkleuring

  1. Monstervoorbereiding voor formaline gefixeerd in paraffine ingebedde menselijke hersenmonsters
    1. Bak segmenten in een droogoven bij 60 ° C gedurende 1 uur.
    2. Deparaffinize hersenen plakjes in een zuurkast.
      LET OP: LET OP: reagentia zijn giftig en moeten worden behandeld en weggegooid na de juiste beveiliging richtlijnen
      1. Dompel de glaasjes in xyleen alternatief clearing-agent tweemaal gedurende 10 min.
      2. Dompel de glaasjes in 100% ethanol tweemaal gedurende 1 minuut.
      3. EENir-droge schijfjes 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Als alternatief kunnen monsters worden gedroogd bij kamertemperatuur O / N maar moeten binnen 24 uur worden gebruikt.
  2. Diaminobenzidine (DAB) -gebaseerde chromogenic ISH assay gevolgd door Luxol snel blauw en cresylviolet vlek met behulp van warmte-geïnduceerde en protease-geïnduceerde RNA ontmaskering
    1. Voordat u begint te bereiden benodigde materialen:
      1. Verwarm de oven voor hybridisatie 40 o C en plaats een bak met gedestilleerd water om een vochtige omgeving te creëren.
      2. Neem een ​​dia doos en plaats papieren handdoeken gedrenkt in gedestilleerd water naar binnen om de doos dia bevochtigen. Plaats de doos dia in de hybridisatie oven.
      3. Bereid 1x voorbehandelen 2 door verdunning van de 10x voorraad-oplossing (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) in RNase-vrij of-DEPC behandeld water. Als voorbehandeling wordt uitgevoerd op een hete plaat, voeg 100 ml voorbehandelen oplossing voor een 100 mm diameter glazen schotel naar het contactvlak tussen de schotel en de verwarmingsplaat te verhogen (als voorbehandelingwordt uitgevoerd in een magnetron kan een Coplin pot in plaats daarvan worden gebruikt zoals gespecificeerd in 1.2.3). Verwarm oplossing 100 o C en houd het mengsel niet langer dan 30 minuten vóór onderdompeling samples.
      4. Warmte negatieve en positieve sondes 10 min bij 40 o C en afkoelen bij RT.
      5. Equilibreer amplificatiereagentia AMP 1-6 (inbegrepen in de CISH reagens Kit) bij RT.
      6. Bereid 1x wasbuffer verdunnen van de 50x voorraad-oplossing (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) in gedestilleerd water. Opmerking: 1 x wasbuffer kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende 1 maand en worden gebruikt voor toekomstige kleuring.
    2. Voeg ~ 4 druppels (~ 120 ul) van voorbehandeling 1 tot elke hersenplakje, dek af met parafilm en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    3. Was 3-5 maal in vers gedestilleerd water.
    4. Voer warmte-geïnduceerde ontmaskering:
      1. Overdracht dia's hot voorbehandelen 2 (inbegrepen in de CISH Reagent Kit) oplossing en kook gedurende 15 minuten. Opmerking: Boiling kan worden uitgevoerd op een hete plaat zorgencontinue koken of in een magnetron volgende kritische stappen gespecificeerd in 1.2.3).
    5. Onmiddellijk over objectglaasjes gedestilleerd water en was 3-5 keer.
    6. Wash slides 3-5 maal in vers 100% ethanol.
    7. Air-droge schijfjes 5 min bij RT. Opmerking: Als alternatief plakken kan worden gedroogd O / N.
    8. Voer-protease veroorzaakte ontmaskering:
      1. Voeg 4 druppels voorbehandelen 3 (opgenomen in het CISH Reagent Kit), dek af met parafilm en incubeer 30 minuten bij 40 ° C in hybridisatie oven.
    9. Wash slides 3-5 maal in vers gedestilleerd water.
    10. Voeg 4 druppels dapB probeset die hersenplakjes gebruikt om achtergrondkleuring te beoordelen.
    11. Voeg 4 druppels van de targeting probeset die hersenplakjes gebruikt om het RNA van belang te detecteren.
      Opmerking: Een probeset targeting resten 15 - 1256 van de menselijke ATF4 mRNA wordt in dit voorbeeld. OPTIE: extra hersenen plakjes kan hyb zijnridized met een sonde set targeting mens PPIB en gebruikt als positieve controles.
    12. Plaats objectglaasjes in de schuifkast en incubeer gedurende 2 uur. bij 40 o C in hybridisatie oven.
    13. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    14. Voeg 4 druppels AMP 1 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
    15. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    16. Voeg 4 druppels AMP 2 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
    17. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    18. Voeg 4 druppels AMP 3 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 30 min in hybridisatie oven.
    19. Wassen dia tweemaal met 1 x wash buffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    20. Voeg 4 druppels AMP 4 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm, plaats ze in de schuifkast en incuberen bij 40 ° C gedurende 15 min in hybridisatie oven.
    21. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    22. Voeg 4 druppels AMP 5 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
    23. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    24. Voeg 4 druppels AMP 6 reagens aan elk hersenplakje, dekglaasjes met parafilm en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
    25. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    26. Meng gelijke volume van BROWN-1 en 2-BROWN reagentia (in het CISH Reagent Kit), voeg ~ 120 ul oplossing aan elke hersenplakje, dek af met parafilm en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
    27. Wassen dia tweemaal met 1 x wasbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en eenmaal spoelen met gedestilleerd water.
      OPMERKING: kritische stappen: de volgende stappen zijn cruciaal voorEen optimale axonale tegenkleuring verkrijgen zonder het maskeren van de aanwezigheid van RNA granules.
    28. Voor het uitvoeren van tegenkleuring de aanwezigheid van mRNA van belang te controleren onder een helderveld microscoop. Definieer referentiegebieden in de hersenen monsters om de aanwezigheid van puncta gehele tegenkleuring procedure te volgen.
    29. Verwarm Luxol snel blauwe oplossing bij 60 o C.
    30. Plaats de glaasjes in Luxol snel blauw en incubeer 30 minuten bij 60 o C.
    31. Spoel verschillende keren in gedestilleerd water.
    32. Dip dia meermaals 0,05% lithiumcarbonaatoplossing differentiatie starten.
    33. Dip dia's twee keer in vers 75% ethanol.
    34. Spoel in gedestilleerd water.
    35. Controleer de hersenen plakjes onder een helderveld microscoop. Merk op dat de grijze en witte stof moet beginnen te onderscheiden en RNA korrels nog steeds zichtbaar als donkerblauw / zwart puncta zijn. Controleer of axonen start verschijnen als het licht blauwe vezels.
    36. Herhaal stap 2.2.28 tot 2.2.32. Perform incubaties met Luxol snelle blauwe oplossing in 10-20 min stappen zorgvuldig toezicht op de tegenkleuring en de aanwezigheid van RNA korrels. Opmerking: Doorgaans wordt een optimale tegenkleuring verworven in 60-90 min (totale incubatietijd), maar kan worden verkort als het vermoeden bestaat dat RNA korrels kunnen worden gemaskeerd door de Luxol snelle blauwe vlek (zie figuur 2 voor voorbeelden).
    37. Incubeer dia's in cresylviolet oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    38. Spoel de dia's in gedestilleerd water.
    39. Dip dia 5-10 maal in 70% ethanol.
    40. Uitdrogen hersencoupes tot 3 snelle veranderingen van 100% ethanol.
    41. In een zuurkast, duidelijk hersencoupes door tweemaal te incuberen in xyleen alternatieve klaringsmiddel gedurende 2 min en een derde keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    42. Mount hersenen plakjes in-xyleen gebaseerde permanente montage medium.
    43. Analyseer monsters onder een helderveld microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een korte samenvatting van de hierboven beschreven werkwijzen is weergegeven in figuur 1.

Optimale detectie van ATF4 mRNA korrels in cholinerge axonen het gebruik van warmte-geïnduceerde ontmaskering

Bij de beoordeling axonale lokalisatie van mRNA, is het essentieel om te kunnen axonen identificeren en kunnen lage overvloedige RNAs visualiseren. Het RNA ISH techniek beschreven maakt de detectie van RNA in een enkel molecuul resolutie. St...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit rapport beschrijven we het gebruik van een hoge-resolutie ISH techniek voor de detectie van axonally gelokaliseerde ATF4 mRNA. Deze en eerdere gepubliceerde studies tonen aan dat deze technologie is compatibel met de antilichaam-gebaseerde eiwit detectie in weefsels of zelfs hele embryo 33. Belangrijk is onlangs gebruikt voor de detectie van mRNA in Arc dendrieten van hippocampale neuronen 34. Het kan ook worden gecombineerd met histologische kleurstoffen voor weefselkleuri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; aan U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; aan U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; aan C.M.T.), en pilootstudieprijzen van het door het National Institute on Aging gefinancierde Alzheimer's Disease Research Center aan de Columbia University (AG008702; aan J.B. en Y.Y.J.) dat ook de New York Brain Bank ondersteunt. We danken de leden van het Hengst-laboratorium voor hun opmerkingen en discussies

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)Advanced Cell Diagnostics-probe
custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)Advanced Cell Diagnostics-probe
negative control probe-DapBAdvanced Cell Diagnostics310043probe
positive control probe-mouse Polr2A (optioneel)Advanced Cell Diagnostics312471probe
positive control probe-human PPIB (optioneel)Advanced Cell Diagnostics313901probe
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (voor fluorescentie detectie)Advanced Cell Diagnostics320850in situ hybridisatie kit
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (voor chromogene detectie)Advanced Cell Diagnostics310035in situ hybridisatie kit
Geiten polyklonaal anti-ChAT antilichaamMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify clearing agent (xyleen vervanger)American MasterTechCACLEGAL
ProLong Gold mounting  medium met DAPILife TechnologiesP36935
DPX montage mediumSigma6522

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

Gerelateerde artikelen