RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
mRNA's worden vaak gelokaliseerd op gewervelde axonen en hun lokale vertaling nodig is voor axon pathfinding of vertakking tijdens de ontwikkeling en voor onderhoud, reparatie of neurodegeneratie in postdevelopmental periodes. High throughput analyses hebben onlangs onthuld dat axonen hebben een meer dynamische en complexe transcriptoom dan eerder werd verwacht. Deze analyse, maar zijn meestal gedaan in gekweekte neuronen wanneer axonen kunnen worden geïsoleerd uit de somato-dendritische compartimenten. Het is vrijwel onmogelijk om dergelijke scheiding bereiken geheel weefsels in vivo. Aldus, teneinde de werving van mRNA en hun functionele relevantie verifiëren in een geheel dier, transcriptoom analyse idealiter worden gecombineerd met technieken die de visualisatie van mRNA in situ mogelijk. Onlangs hebben roman ISH technologieën die RNA's in een enkel-molecuul niveau te detecteren ontwikkeld. Dit is vooral belangrijk wanneer de analyse van de subcellulaire lokalisatie van mRNA, Omdat gelokaliseerde RNA's zijn doorgaans te vinden op een laag niveau. Hier beschrijven we twee protocollen voor de detectie van axonally-mRNA gelokaliseerd met behulp van een nieuwe ultragevoelige RNA ISH techniek. We hebben samen RNAscope ISH met axonen tegenkleuring met behulp van fluorescentie immunohistochemie of histologische kleurstoffen voor de aanwerving van ATF4 mRNA om axonen in vivo in de volwassen muis en menselijke hersenen te controleren.
Inleiding
Axonal mRNA werving en lokale vertaling staat axonen te reageren op extracellulaire stimuli in een tijdelijk en ruimtelijk acute manier 1. Intra-axonen eiwitsynthese wordt het best begrepen in de context van neurodevelopment waar het speelt een cruciale rol in de groei kegel gedrag 2-8, axon pathfinding 9-11 en retrograde signalering 12,13. Maar veel minder bekend over de functionele betekenis van axonale eiwitsynthese in post-ontwikkelings neuronen bij axonale mRNA en ribosoom niveaus sterk gereduceerd 14,15. Volwassen gewervelde axonen hebben lange tijd gedacht translationeel inactief 16 te zijn. Echter, recente studies ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC van Columbia University en de geldende richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd. Opmerking: Bereid alle buffers gebruikt voor de ISH procedures in RNase-vrij of-DEPC behandeld water. Deze aanbeveling is niet strikt noodzakelijk nadat ISH is voltooid, maar het wordt gesuggereerd dat buffers nog steeds worden bereid in geautoclaveerde dubbel gedestilleerd water en / of gesteriliseerd door filtering.
1. Detectie van ATF4 mRNA gelokaliseerd Cholinerge axonen in de volwassen hersenen van muizen met behulp van fluorescentie in situ hyb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een korte samenvatting van de hierboven beschreven werkwijzen is weergegeven in figuur 1.
Optimale detectie van ATF4 mRNA korrels in cholinerge axonen het gebruik van warmte-geïnduceerde ontmaskering
Bij de beoordeling axonale lokalisatie van mRNA, is het essentieel om te kunnen axonen identificeren en kunnen lage overvloedige RNAs visualiseren. Het RNA ISH techniek beschreven maakt de detectie van RNA in een enkel molecuul resolutie. St.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit rapport beschrijven we het gebruik van een hoge-resolutie ISH techniek voor de detectie van axonally gelokaliseerde ATF4 mRNA. Deze en eerdere gepubliceerde studies tonen aan dat deze technologie is compatibel met de antilichaam-gebaseerde eiwit detectie in weefsels of zelfs hele embryo 33. Belangrijk is onlangs gebruikt voor de detectie van mRNA in Arc dendrieten van hippocampale neuronen 34. Het kan ook worden gecombineerd met histologische kleurstoffen voor weefselkleuri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; aan U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; aan U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; aan C.M.T.), en pilootstudieprijzen van het door het National Institute on Aging gefinancierde Alzheimer's Disease Research Center aan de Columbia University (AG008702; aan J.B. en Y.Y.J.) dat ook de New York Brain Bank ondersteunt. We danken de leden van het Hengst-laboratorium voor hun opmerkingen en discussies
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| custom probe targeting residues 20-1,381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| custom probe targeting residues 15-1,256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | - | probe |
| negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
| positive control probe-mouse Polr2A (optioneel) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
| positive control probe-human PPIB (optioneel) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (voor fluorescentie detectie) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | in situ hybridisatie kit |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (voor chromogene detectie) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | in situ hybridisatie kit |
| Geiten polyklonaal anti-ChAT antilichaam | Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify clearing agent (xyleen vervanger) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| ProLong Gold mounting medium met DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX montage medium | Sigma | 6522 |
Referenties
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
