Methodenartikel

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

DOI:

10.3791/52823

⸱

14 mei 2015

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om muizen embryonale stamcellen differentiëren (ESC) neurale voorlopercellen maakt het onderzoek mogelijk van de mechanismen die neurale specificatie evenals de vorming van volwassen neurale celtypes voor verdere studie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor de differentiatie van ESC neurale progenitors behulp serumvrij monolaagkweek. De werkwijze is schaalbaar, efficiënt en resulteert in de productie van ~ 70% neurale cellen in 4-6 dagen. Het kan worden toegepast op ESC uit verschillende stammen onder verschillende omgevingsomstandigheden. Neurale voorlopercellen kunnen worden toegestaan ​​verder te differentiëren naar functionele neuronen en glia en geanalyseerd door microscopie, flowcytometrie of moleculaire technieken. Het differentiatieproces vatbaar is voor time-lapse microscopie en kan gecombineerd worden met het gebruik van reporter lijnen naar de neurale specificatie te monitoren. Wij bieden gedetailleerde instructies voor media voorbereiding en celdichtheid optimalisatie om het proces naar be op de meeste ESC lijnen en diverse cel kweekvaten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embryonale stamcellen zijn pluripotente cellen afkomstig van het vroege embryo met het vermogen om oneindig prolifereren in vitro behoud van het vermogen om te differentiëren in alle volwassen celtypes na herintroductie in een passend stadium embryo (door vorming van een chimeer), injectie in syngene of immuungecompromitteerde (door vorming van een teratoma) hetzij in vitro onder geschikte 1 cues. De in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen tot neurale lineages werd eerst beschreven in 1995 en omvatte de vorming van multicellulaire aggregaten suspensie (embryoid lichamen, EBS) in serum-bevattende media waaraan het morfogeen retinoïnezuur 2-4. Sindsdien is een aantal protocollen ontwikkeld om neurale differentiatie 5 toestaan. Velen nog gebruik aggregatie andere co-kweek met inducerende celtypes en verschillende gebruik worden gemaakt van serumvrij medium. Alle protocollen hebben voordelen van eennd nadelen en de precieze aard van neurale of neuronale cellen produceerde ook afhankelijk van het gebruikte protocol.

De ideale protocol zou robuust, schaalbaar en maak gebruik van volledig gedefinieerde media en substraten, zijn ontvankelijk voor non-invasieve bewaking van het differentiatieproces en resulteren in de vorming van zuivere populaties van neurale voorlopercellen kunnen worden gevormd door externe stimuli en differentiëren in alle neuronale en gliale subtypes met een hoog rendement en opgevangen in een relatief korte tijd. In de afgelopen tien jaar hebben we met een methode voor het genereren van neurale voorlopers en neuronen van de muis ESC in een lage dichtheid, serumvrije aanhangend monolaagcultuur 6-10. Dit protocol voldoet aan veel van de hierboven uiteengezette criteria: in onze handen de efficiëntie van differentiatie heel consequent gedurende vele jaren en een verscheidenheid van cellijnen is geweest, kan het worden opgeschaald of omlaag (we met succes gebruik van schepen van 96-well platen 15 cm diameter dishes) en de gebruikte media zijn goed gedefinieerd. Het proces vatbaar is voor timelapse microscopie voor de monitoring van de differentiatie en verschillende patronen signalen kunnen worden toegevoegd aan de vorming van verschillende typen neuronale subtypes induceren (bijv Shh en Fgf8 voor dopaminerge neuronen 6).

Toch zijn er een aantal uitdagingen voor de succesvolle toepassing van dit protocol. Een van de belangrijkste aspecten is een zorgvuldige voorbereiding van de media. We bereiden altijd media interne ondanks de beschikbaarheid van commerciële alternatieven. Een van de supplementen gebruikte (N2; zie Protocol) heeft wijzigingen in de standaard commercieel beschikbare versies. Tenslotte, een van de belangrijkste stappen voor een succesvolle toepassing van deze werkwijze is de optimale celdichtheid bij plating. Dit komt vooral omdat, terwijl de autocrine karakter van één van de inducerende signalen (Fgf4 11) vereist dat er voldoende cellen aanwezig om een optimale levensvatbaarheid mogelijk zijnteit en differentiatie, bij een te hoge dichtheden differentiatie is aangetast (eventueel gedeeltelijk te wijten aan autocriene productie van LIF 12). Het is daarom belangrijk dat beide media preparaat en cellen plating zorgvuldig uitgevoerd en consistent optimaal resultaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mediavoorbereiding

Opmerking: Het protocol gebaseerd op het gebruik van een combinatie van twee afzonderlijke media: DMEM / F12 aangevuld met gemodificeerde N2 supplement en Neurobasal aangevuld met B27 supplement, typisch in een 1: 1 ratio.

  1. Bereid de gemodificeerde N2 supplement door mengen van de componenten in een 15 ml buis. Niet vortex of filteren dit; meng door de buis totdat de oplossing helder is.
    1. Begin pipetteren 7,2 ml DMEM / F12, voeg 1 ml van 25 mg / ml insuline (bestaande in 0,01 M HCl) en meng goed door het buisje. Het duurt een paar minuten tot de oplossing helder is.
    2. Voeg 1 ml van 100 mg / ml apo-transferrine (bestaande in water), 33 pl 0,6 mg / ml progesternone (bestaande in ethanol), 100 ul 160 mg / ml (1 M) putrescine (bestaande uit in water ), 10 pi 3 mM natrium- seleniet (bestaande in water) en 666 ul van 7,5% runderserumalbumine en meng de buis ook. Aliquot in 2,5 ml en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 2 maanden.
  2. Bereid de media.
    1. Aan 250 ml van DMEM / F12 voeg 2,5 ml N2. Meng goed, maar niet schudden of filter.
    2. Aan 250 ml van Neurobasal media voeg 5 ml B27 supplement. Meng goed, maar niet schudden of filter.
    3. Meng de media uit stappen 1.2.1 en 1.2.2 in een 1: 1 verhouding. In sommige gevallen een 1: 3 mengsel kan noodzakelijk zijn (aangevuld zoals het 1: 1 mengsel in stap 1.2.4).
    4. Aan het mengsel wordt 0,5 ml L-glutamine (eindconcentratie 0,2 mM) en 3,5 pl 2-mercaptoethanol (eindconcentratie 0,1 mM) en meng goed zonder schudden. Bewaar de media bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken en bloot aan licht. Dit eindmix heet N2B27.
  3. Bereid de gelatine-oplossing.
    1. Bereid een 1% gelatine oplossing in ultrazuiver water en autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 15 min. Het is van belang dat de fles voor dit volledig vrij van detergenten en desinfecterende middelen, zodat het wordt aanbevolen dat een nieuwe flesgebruikt voor dit en wordt alleen maar gespoeld in ultrapuur water tussen toepassingen. Aliquot de 1% oplossing in 50 ml porties en bewaar bij 4 ° C gedurende maanden.
    2. Warm een ​​hoeveelheid van 1% gelatine in een 37 ° C waterbad opgelost en aan 500 ml warm fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meng goed en pipet genoeg om de bodem van elk goed te dekken of plaat. Laat de gelatine het bekleden van de oppervlakte ten minste 30 min.

2. Plating de cellen

NB: Dit protocol geldt evenzeer voor de muis ESC gegroeid in 10% serum met leukemie remmende factor (LIF), serum vervanging door LIF of serum vrije media met LIF en bot morfogenetische eiwit 4 (BMP4) of MEK en GSK3 remmers (2i media) met of zonder LIF. Echter de timing en de efficiëntie van de differentiatie afhankelijk van het medium en cellen (zie bespreking). Voor de hier getoonde experimenten gebruikten we de 46C muis ESC lijn (dat heeft een EGFP reporter klopte in one van de endogene SOX1 allelen), gekweekt in GMEM met 10% serum en LIF. Voor een optimaal resultaat is het belangrijk dat cellen worden gedissocieerd en opnieuw uitgeplaat in N2B27 media; simpelweg het veranderen van de media uit GMEM / serum / LIF om N2B27 altijd resulteert in een verminderde efficiëntie differentiatie ten opzichte opnieuw platen van de cellen.

  1. Groeien de cellen in GMEM met 10% serum, 1 mM natriumpyruvaat, 1 x niet-essentiële aminozuren, 0,1 M 2-mercaptoethanol, en 100 eenheden / ml LIF 13. Om een subconfluente cultuur van muis ESC, plaat krijgt 1 x 10 6 cellen in een T25 kolf waarvan 2 zal nemen - 3 dagen.
  2. Observeer cellen onder bright-field microscoop. Wanneer de cellen zijn subconfluente en klaar om passage, spoel ze twee keer in PBS. Voeg 1 ml van de cel dissociatie reagens en terug naar de incubator gedurende 2-5 min. Hoewel trypsine en andere enzymen kunnen ook worden gebruikt voor celdissociatie, kunnen ze een negatieve invloed op celhechting dus de beplating dichtheden moeten worden adjusted.
  3. Zodra de cellen beginnen te tillen van de plaat, tikt het vaartuig om ze los te maken in een enkele celsuspensie. Verzamel de cellen in een totaal van 10 ml van media en cellen dissociatie reagens en pipet in een 15 ml centrifugebuis.
  4. Draai de cellen bij 300 g gedurende 3 min bij RT.
  5. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van voorverwarmd N2B27 door en neer te pipetteren 3-5 keer. Wanneer pipetteren de suspensie beneden pipet tegen de zijkant van de buis te voorkomen dat luchtbellen. Tel de cellen met een geautomatiseerde celtelinrichting of een hemocytometer en noteer de concentratie.
  6. Bereid een celsuspensie met het gewenste aantal cellen per volume-eenheid wordt per putje in voorverwarmde N2B27. Een dichtheid van 10.500 cellen per cm2 in een 6-well gerecht (dat wil zeggen, 1 x 10 5 cellen per putje van een 6-well gerecht) is optimaal. Zie tabel 1 voor suggereerde aantal cellen per cm2 en plating mediavolumes voor verschillende cel kweekvaten.
  7. Zuig het gelatine uit het kweekvat en de plaat de celsuspensie overeenkomstig de voorgestelde dichtheid en volume in tabel 1. Niet zwenk de platen omdat dit de cellen geconcentreerd naar het midden. Plaats de kweken in een vochtige incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
  8. Wijzig media elke 1 - 2 dagen door het vervangen van alle media met verse N2B27. Pipet voorzichtig als het doorspoelen van de cellen kunnen beïnvloeden dichtheid en het verminderen van de differentiatie efficiëntie in de volgende dagen. Wanneer initiële levensvatbaarheid na plateren slecht, plaat cellen in een 1: 3 mengsel van N2 en B27-aangevuld medium en dit veranderen N2B27 na de eerste twee dagen. Cellen zal beginnen te differentiëren en moeten SOX1 expressie (zichtbaar door groene fluorescentie van de reporter in de 46C cellijn die hier gebruikt) binnen 4 tonen - 6 dagen.

3. immunofluorescentiekleuring

NEETE: Het protocol kan worden toegepast op elk type vaartuig. Het volume van elk reagens wordt beschreven per putje van 6-well plaat en kan worden geschaald tot een oppervlaktegebied. Replating wordt niet aanbevolen vanwege de lage levensvatbaarheid achteraf.

  1. Verwijder differentiatiemedium en zet de cellen door toevoeging van 500 pl 4% (v / v) paraformaldehyde, laat gedurende 15 min.
  2. Was en permeabel de cellen met 2 ml PBS-T (fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,5% (v / v) Tween-20) tweemaal. Cellen kunnen in PBS-T worden gedurende maximaal 2 maanden bij 4 ° C.
  3. Vervang PBS-T met 1 ml van PBS-T met 10% (v / v) serum (van dezelfde soort als secundair antilichaam). Incubeer 1 uur op de plaat wip bij KT elke niet-specifieke binding te blokkeren.
  4. Na 1 uur was de cellen tweemaal met 2 ml PBS-T, en geïncubeerd in 500 pl muis IgG tegen βIII-tubuline (verdund 1: 1000 in PBS-T met 10% serum). Zet op het bord rocker, en laat O / N bij 4 ° C.
  5. Vanaf deze stap altijd het vat te beschermentegen licht. Was de cellen tweemaal met PBS-T, voeg 500 ul van fluorescent gelabelde anti-muis IgG-antilichaam (verdund tot 2 ug / ml in PBS-T met 10% serum). Zet het op de plaat rocker gedurende 1 uur bij RT.
  6. Spoel de cellen tweemaal met PBS-T, voeg 500 pl DAPI (verdund tot 0,5 ug / ml in PBS-T) en laat gedurende 5 min.
  7. Was de cellen weer en bewaar ze in PBS-T. Cellen zijn klaar om te fotograferen en kan maximaal 2 weken bewaard bij 4 ° C. Merk op dat GFP signaal verdwijnt na verloop van tijd, dus het is ongepast om te vergelijken GFP intensiteit van vaste en levende cellen of van cellen op verschillende tijdstippen vast.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit experiment gebruikten we de 46C cellijn 14, muis embryonale stamcellen met een endogeen SOX1-GFP reporter, neurale differentiatie volgen. Door deze cellijn expressie van SOX1, een merker voor neurale voorlopercellen kunnen worden gedetecteerd door groene fluorescentie. Plating dichtheid is een kritische factor om neuronale differentiatie bereiken. Muis embryonale stamcellen werden uitgeplaat in 6-well plaat bij verschillende dichtheden variërend van 10.500 tot 88.500 cellen / cm 2. F...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De monolaag neurale differentiatie protocol is in gebruik voor meer dan een decennium 6. Het protocol is zeer efficiënt, samengesteld als beschreven medium en uitgevoerd in een monolaag systeem dat het systeem toepasbaar voor preklinische maakt (bijvoorbeeld screening van geneesmiddelen) gebruikt. Er zijn echter een aantal belangrijke factoren die differentiatie efficiëntie te bepalen. Dit artikel wijst deze factoren en de oplossing voor elk obstakel.

Dichtheid van de cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gefinancierd door een beurs voor Ontwikkeling en Promotie van Wetenschap en Technologie van het Thaise Ministerie voor Onderwijs aan W.W. en subsidies van Tenovus en de Anonymous Trust aan M.P.S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fetaal bovien serumLife Technologies10270-106
DMEM/F12Life Technologies11320-074
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA11105-01
B-27 Supplement, serumvrijLife Technologies17504-044
InsulinSigmaI6634Reconstitueer met steriele 0,01 M HCl
Apo-transferrineSigmaT1147Reconstitueer met steriele water
ProgesteronSigmaP8783Reconstitueer met ethanol
PutrescineSigmaP5780Reconstitueer met steriele water
NatriumselenaatSigmaS5261Reconstitueer met steriele water
Bovine albumine fractie VLife Technologies15260-037
L-GlutamineLife Technologies25030-081Zorg ervoor dat het volledig is opgelost voor gebruik, omdat glutamine meestal ge sedimenteerd
GelatineSigmaG1890
6-wells weefselkweekschaalThermo Scientific140675
24-wells weefselkweekschaalThermo Scientific142475
96-wells weefselkweekschaalThermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM Niet-essentiële aminozuren oplossingLife Technologies11140-050
NatriumpyruvaatLife Technologies11360-070
2-mercaptoethanolSigmaM7522
Leukemie-remmende factorBereidt in huis zoals in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20SigmaP1379
4',6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI)SigmaD9542Bescherm tegen licht
Muis anti βIII tubulin IgG antilichaamCovanceMMS-435P
Fluorescentie-gelabeld anti-muis IgG antilichaamLife TechnologiesA31571Bescherm tegen licht
25 cm2 weefselkweekkolfThermo Scientific156367

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Serumvrije kweekgelatinen coatingoptimalisatie van celdichtheidimmunofluorescentiemicroscopieflowcytometrieSOX1 GFP reporterb ta III tubuline

Gerelateerde artikelen