Method Article

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

DOI:

10.3791/52824

⸱

July 3rd, 2015

 , 
1Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Department of Pharmacology, University of California Irvine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptoren, met name G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), routinematig intracellulair verhandeld, en naar het celoppervlak 1. Deze complexe, georkestreerd en strak gecontroleerde processen dicteren beschikbaar receptor complementen cellen 'en reguleren receptor tijdelijke activiteit, desensibilisatie, en resensitization 2-4. Belangrijk, deze processen reageren op cellulaire omgevingen zoals drugs geïnduceerde receptor activiteit of inactiviteit. Dat wil zeggen, kan de acties van liganden aan receptoren intracellulaire mensenhandel van die receptoren te veranderen, waardoor de cel responsiviteit veranderen. Op deze wijze extern liganden heb....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Dit protocol is grotendeels compatibel met verschillende monolaag-plated cel / weefselkweek modellen, medicamenteuze behandeling regimes, en etikettering doelen. Zo is in het werkelijke gebruik, zullen veel specifieke parameters variëren op basis van experimenteel design. Hier, verwijzingen naar deze door de gebruiker gedefinieerde parameters zijn generiek. Voorbeeld omstandigheden, zoals gebruikt voor de representatieve resultaten te verkrijgen, zijn cursief weergegeven.

1. Oplossingen

  1. Bereid wasbuffer door het mengen van 0,1 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) Zoutoplossing en 0,05% polysorbaat 20; pH 7,4 bij ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met deze techniek is het mogelijk om veranderingen in post-receptor internalisatie handel na zowel chronische / acute en langdurige behandeling met medicijnen te kwantificeren. Na medicamenteuze behandelingen, fixatie, en etikettering, zijn hoge-resolutie tweekanaals microfoto gevangen van elke cel van belang. Representatieve beelden kunnen gecombineerd worden met valse kleuren colocalization naar illustratieve figuren (figuur 1) te genereren. Latere colocalizational analyse, zoals beschreven, opbrengst.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben dit protocol voor de analyse van primaire kweken van volwassen dorsale wortel ganglion neuronen (primaire sensorische neuronen) geoptimaliseerd. Het kan ook worden toegepast met weinig of geen wijziging, voor monolaag gekweekte cellen uitgeplaat lijnen. De colocalizational analyse is ook mogelijk in het weefsel plakjes en andere dergelijke preparaten 11, maar de behandeling met geneesmiddelen en weefsel fixatie / voorbereiding componenten zou niet passend zijn.

Interessa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van CIHR (MOP394808) en een Canada Research Chair aan CMCEWO was de ontvanger van een Post-Graduate Scholarship van NSERC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma BaseSigma AldrichT1503-500G
Sodium ChlorideSigma AldrichS9888-500G
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Hydrochloric AcidSigma Aldrich258148
Albumin from Bovine SerumSigma AldrichA7906-100G
Gelatin from cold water fish skinSigma AldrichG7041-100G
Corning Costar Cell Culture Plates: 24-wellFisher Scientific720084
12 circle Microscope Cover GlassFisher Scientific1254580
Aqua/Poly-MountPolysciences18606-20
Sodium Phosphate MonobasicSigma AldrichS9638-500G
Sodium Phosphate DibasicSigma AldrichS9763-500G
ParaformaldehydePolysciences00380-1
Dumont #5 Forceps - Standard/DumoxelFine Science Tools11251-30
Rabbit anti-DOR antibodyMyBioSourceMBS316175Used at 1:1,500
Mouse anti-Rab5 antibodySigma AldrichR7904Used at 1:750
Mouse anti-Rab11 antibodyMillipore05-853Used at 1:500
Goat anti-LAMP1 antibodySanta CruzSC8098Used at 1:750
Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibodyLife TechnologiesA-21206Used at 1:200 to 1:2,000
Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibodyLife TechnologiesA-11005Used at 1:200 to 1:2,000
Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibodyLife TechnologiesA-11058Used at 1:200 to 1:2,000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
  2. Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. T....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor TraffickingColocalization AnalysisConfocal MicroscopyDrug TreatmentImmunolabelingIntracellular CompartmentsQuantitative AnalysisSequential ImagingDelta Opioid ReceptorRecycling Endosomes

Related Articles