Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Summary

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Abstract

De intracellulaire traffic van receptoren is een verzameling van complexe en zeer gecontroleerde processen. Receptor-traffic moduleert signalering en de algehele celresponsiviteit op liganden en wordt zelf beïnvloed door intra- en extracellulaire omstandigheden, inclusief ligand-geïnduceerde signalering. Geoptimaliseerd voor gebruik met monolaag-gecultiveerde cellen, maar uitbreidbaar naar vrij zwevende weefselsneden, gebruikt dit protocol immunolabeling en colocalisatie-analyse om veranderingen in intracellulaire receptor-traffic te volgen na zowel chronische/langdurige als acute interventies, inclusief exogene medicamenteuze behandeling. Na medicamenteuze behandeling worden cellen dubbel geïmmunolabeld voor de receptor en voor markers voor de intracellulaire compartimenten van belang. Sequentiële confocale microscopie wordt vervolgens gebruikt om twee-kanaals fotomicrografen van individuele cellen vast te leggen, die worden onderworpen aan gecomputeriseerde colocalisatie-analyse om kwantitatieve colocalisatiescores op te leveren. Deze scores worden genormaliseerd om het poolen van onafhankelijke replica's mogelijk te maken vóór statistische analyse. Representatieve fotomicrografen kunnen ook worden verwerkt om illustratieve figuren te genereren. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geïnduceerde receptor-traffic.

Introduction

Receptoren, met name G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), routinematig intracellulair verhandeld, en naar het celoppervlak ^1. Deze complexe, georkestreerd en strak gecontroleerde processen dicteren beschikbaar receptor complementen cellen 'en reguleren receptor tijdelijke activiteit, desensibilisatie, en resensitization ^2-4. Belangrijk, deze processen reageren op cellulaire omgevingen zoals drugs geïnduceerde receptor activiteit of inactiviteit. Dat wil zeggen, kan de acties van liganden aan receptoren intracellulaire mensenhandel van die receptoren te veranderen, waardoor de cel responsiviteit veranderen. Op deze wijze extern liganden hebben nog meer effecten op celfunctie, zelfs buiten klassieke messenger-to-effector cascades ^5,6.

Het onderzoeken van dergelijke wijzigingen in geïnduceerde receptor mensenhandel is moeilijk. Alle beschikbare technieken te betrekken beperkingen. Bescherming Biotine assays werden gebruikt Monitor oppervlak receptoren populaties. Deze receptoren worden gebiotinyleerd en een tijdsverloop van immunoprecipitaties uitgevoerd om de vermindering van gebiotinyleerde receptoren tijd kwantificeren. Deze techniek ziet wezen geleidelijke afbraak van een aanvankelijk, gelabeld populatie receptoren ⁷ en is zeer nuttig bij het ​​construeren tijdsverloop van dit proces. Helaas is deze test kan niet anders dan de afbraak van de oorspronkelijke pool van receptoren, zoals internalisatie, recycling of nieuwe receptoren te monitoren. Ook kan de toevoeging van een antilichaam van de 150kDa bereik voor een receptor in het bereik van de 50 kDa receptor handel ^8,9 wijzigen en deze techniek moeilijk te gebruiken met een lage expressie-niveau receptoren.

Andere procedures gebruiken verschillende methoden om intracellulaire mensenhandel compartimenten (bv endosomen, etc.) te identificeren en hun colokalisatie beoordelen met de receptoren van belang. Dit omvat de onse van heterologe systemen uiten fluorescerend eiwit-tag chimere constructen van de receptoren en compartiment markers (bijv Rab-familie GTPasen). Dit maakt mogelijk het gebruik van de live-cell imaging, het verwijderen van kwesties in verband met fixatie en permeabilisatie. Terwijl krachtige dergelijke strategie vertoont dezelfde beperkingen van heterologe systemen in het algemeen: tag en expressieniveau effecten op trafficking gedrag en onverenigbaarheid met fysiologisch representatieve celtypen. Meer in de volksmond, worden kleurstoffen gebruikt om eenvoudig intracellulaire compartimenten labelen (bijvoorbeeld lysosomen, ogenschijnlijk) ^10. Kleurstoffen kunnen echter specificiteit (alle zure organellen bij kleurstoffen voor lysosomen) ontbreekt en geen handel niet beoordelen via andere compartimenten. Toch zijn deze technieken maken een aanzienlijke controle over het systeem en de experimentele omstandigheden en kunnen profiteren van de colocalization analysemethoden hier gepresenteerde, hieronder.

Werkwijze we hier aanwezig verfijnt het volgen van receptor mensenhandel door colocalization. Met behulp van immunocytochemie (ICC) passende markers label, is het mogelijk om meerdere verschillende intracellulaire compartimenten identificeren. Dit maakt ook het gebruik van fysiologisch relevante primaire celculturen in plaats van heterologe systemen. Deze ICC-protocol gaat vaststelling van de cellen van belang voorafgaand aan de etikettering; Dit maakt de etikettering op een bepaald tijdstip na behandeling met geneesmiddelen (s). Dit levert een 'snapshot' van de wereldwijde receptor-compartiment verenigingen op dat tijdstip. Met meerdere tijdstippen, kan een tijdsverloop van mensenhandel veranderingen ook worden gebouwd.

In het kort, cellen zijn drug-behandelde, gelabeld voor de receptor en intracellulaire compartiment van belang, confocally afgebeeld, en de microfoto's worden geanalyseerd om mathematisch kwantificeren colokalisatie van de receptor en compartiment ^11. In onze toepassing, onderzochten we de colokalisatie van een receptor met Rab5, Rab11 en Lysosomale-geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1). Deze markers te identificeren vroege endosomen, recycling endosomen en lysosomen, respectievelijk. Deze colocalization maatregelen fungeren als proxy voor de overkoepelende processen van internalisatie, recycling, en degradatie ^12.

Zoals bij alle technieken moeten enige beperkingen worden overwogen. Vanwege de noodzaak beeld elk individu neuron geanalyseerd, kan deze techniek zeer arbeidsintensief zijn naargelang het aantal condities en tijdstippen betrokken. Alle immunokleuring moet ook kampen met de effecten op de cellulaire ultrastructuur, eiwit lokalisatie en epitoop toegankelijkheid veroorzaakt door fixatie en permeabilisatie ^13.

Niettemin oorspronkelijk geoptimaliseerd voor primaire kweken van primaire sensorische neuronen, deze methode is grotendeels verenigbaar met andere monolaag uitgeplaat kweekmodellen.

Het gebruik van een mathematisch gekwantificeerde MEASURe van colocalization is, in het bijzonder, veel meer methodologisch strenger dan de vorige technieken die worden gebruikt om receptor mensenhandel veranderingen, die vaak hebben vertrouwd op vage, subjectieve maatregelen zoals visueel geïnspecteerd multi-channel overlays ¹⁴ beoordelen.

Deze techniek is bijzonder bruikbaar voor de brede compatibiliteit met in vivo acties (vóór primaire kweek generatie), in vitro interventies (in groeicultuur) en diverse kenmerken ¹⁵ richt. Als zodanig kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksvragen.

Protocol

Opmerking: Dit protocol is grotendeels compatibel met verschillende monolaag-plated cel / weefselkweek modellen, medicamenteuze behandeling regimes, en etikettering doelen. Zo is in het werkelijke gebruik, zullen veel specifieke parameters variëren op basis van experimenteel design. Hier, verwijzingen naar deze door de gebruiker gedefinieerde parameters zijn generiek. Voorbeeld omstandigheden, zoals gebruikt voor de representatieve resultaten te verkrijgen, zijn cursief weergegeven.

1. Oplossingen

1. Bereid wasbuffer door het mengen van 0,1 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) Zoutoplossing en 0,05% polysorbaat 20; pH 7,4 bij kamertemperatuur.
2. Bereid blokkerende buffer. Tot 0,05 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) Saline voeg 0,05% polysorbaat 20, 3% runderserumalbumine (BSA) en 0,1% koud vissenhuid gelatine en breng de pH op 7,4 bij kamertemperatuur.
3. Bereid antilichaamverdunner door toevoeging van 0,05% polysorbaat 20, 1% BSA, 0,1% koude vissenhuid gelatine 0,05 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) en zoutoplossing op pH 7,4 bij 4 ^oC
   Opmerking: De pH van Tris-buffers temperatuurafhankelijk is. Dat wil zeggen, een verandering in temperatuur zal de pH van de oplossing te veranderen. Voor samenhang moeten deze buffers steeds pH afgesteld bij de temperatuur waarop ze zullen worden gebruikt.

2. Celkweek

Opmerking: Geschikte celkweek protocollen zal variëren op basis van celtype (s) gebruikt. Deze procedures moeten afzonderlijk worden geoptimaliseerd. Gedetailleerde celcultuur methoden zijn direct beschikbaar, waaronder ^16. Een soortgelijke procedure werd gebruikt om de representatieve resultaten, met als belangrijke verschillen te vinden:

1. Cultuur achterwortelganglia neuronen van volwassen dieren, zoals beschreven ^12. Gebruik adult-neuron groeimedium aan de cultuur van de cellen. Verminder de gliale cel dichtheid van preplating, in plaats van glutamaat. Dit resulteert in een gemengde gliale neuron-kweek gekweekt op 12-ronde glazen dekglaasjes met ten minste 30-60 neuronen per plaat en bijbehorende gliale cellen gekweekt tot approximatEly 40% confluentie. Opgemerkt wordt dat neuronen in een primaire kweek niet zal repliceren en gaat uit van de plaat worden gedrukt door co-gekweekt glia als de glia mogen overmatig groeien. Om te voorkomen dat die de neuronen, fysische vermindering van gliale getallen de voorkeur chemisch / farmacologische methodes.
   Opmerking: Voor de toepassing van dit protocol, nemen we aan dat de cellen van belang worden gekweekt om hun experimenteel gewenste toestand en-monolaag vergulde. We vinden dat uitplaten op 12-ronde glazen dekglaasjes in 24 putjesplaten meeste handig. Alle volumes en procedures beschreven zijn geschikt voor een dekglaasje in een putje van een 24 wells plaat.

3. Drug Behandeling van gekweekte cellen

Opmerking: Meerdere sequentiële, of overlappende, medicamenteuze behandelingen zijn mogelijk. De drugs, doses / concentraties en duur van de blootstelling zal afhangen van het specifieke experiment.

1. Verwijder het originele groeimedium ¹⁶ en vervang het medium dat de drug (s) van belang bij de gekozen concentratie (s). In dit geval gebruikt 10 uM morfine opgelost in zoutoplossing of zoutoplossing als controle gebruikt.
   Opmerking: Het is van belang dat elke onafhankelijke herhaalde (gewoonlijk een 24-well plaat cultuur) bevatten hetzelfde gemeenschappelijke controleconditie. Dit zal normalisering van data over replica, die corrigeert voor inter-proces variabiliteit mogelijk te maken.
2. Incubeer de cellen in de oorspronkelijke groeiomstandigheden ¹⁶ voor 48 uur.
3. Voor de daaropvolgende drug behandelingen, herhaalt u de stappen 3.1 en 3.2 met deltorfine 1 uM, SNC80 1 uM, of voertuig en incubeer gedurende 60 min ^12. Oplosbaar deltorfine II in water en oplosbaar SNC80 bij 10 mM in 40 uM HCl en ultrasone trillingen, verdund tot 1 mM in water.
   Opmerking: Dit protocol veronderstelt het geneesmiddel (en) zijn opgelost zodanig dat zij kunnen worden opgelost in de gewenste concentratie (s) in het gekozen groeimedium. Passende procedures voorzoals oplosbaar is afhankelijk van het betreffende geneesmiddel en moet apart worden geoptimaliseerd.
4. Was de cellen voorzichtig driemaal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt. Voer elke wasbeurt door voorzichtig opzuigen van de vloeistof uit de put, dan snel, en voorzichtig, het vullen van de goed met verse oplossing, zoals gewenst (in dit geval met het wassen buffer).

4. Fixatie en Immunocytochemie

Opmerking: De specifieke etikettering doelstellingen zullen verschillen per experiment. In onze toepassing kan er gelabelde delta opioïdereceptoren (DOR) en Rab5, Rab 11 en LAMP1, zoals besproken. De specifieke antilichamen zal afhangen van het specifieke experiment. Optimale etiket nader zijn afhankelijk van de specifieke antilichamen (s) gebruikt. Een veel vollediger bespreking van dit onderwerp is hieronder.

1. Fixeer de cellen door onderdompeling in ~ 300 pi 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
   Opmerking: Het is van belang dat het 4% paraformaldehyde vers bereid vanwege de autofluorescentie veroorzaakt door het gebruik van eerder ingevroren paraformaldehyde.
2. Was de cellen voorzichtig 3 maal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
3. Incubeer de cellen in 300 ul blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij KT.
4. Incubeer de cellen met primaire antilichamen in 300 gl antilichaam verdunningsmiddel voor 48 uur bij 4 * C. In onze toepassing, primaire antilichamen tegen DOR (konijn anti-DOR) en een van: Rab5 (muis anti-Rab5), Rab 11 (muis anti-Rab11) en LAMP1 (geit anti-LAMP1).
5. Was de cellen voorzichtig driemaal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
6. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan verschillende fluoroforen (zie bespreking hieronder) in 300 gl antilichaam verdunningsmiddel gedurende 1 uur bij KT. In deze en alle volgende stappen beschermt de cellen tegen licht. Om representatieve resultaten te verkrijgen, gebruikt green-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-konijn en either een rood-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-muis of rood-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-geit.
7. Was de cellen voorzichtig 3 maal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
8. Verwijder de 12-round dekglaasjes van 24 putjes door het verlaten ~ 1 ml wasbuffer in elk putje, die de plaat bij ~ 45 ° en wip het dekglaasje af van de put vloer met behulp van fijn pincet. Het dekglaasje komt te rusten tegen de putwand, van waaruit het gemakkelijk kan worden verwijderd met de pincet.
9. Monteer de dekglaasjes, cel-side-down, op microscoopglaasjes met anti-fading montage medium.

5. Microscoop Instellingen

1. Het gebruik van een hoge vergroting doelstelling (100X), eerst een representatieve cel worden afgebeeld met behulp van epifluorescentie lokaliseren.
2. Het beeld vast te leggen instellingen configureren om 8-bit ongecomprimeerde TIFF-afbeeldingen van elk gemerkt kanaal opnemen (voor detectie van elk fluorofoor bijvoorbeeld gebruikt, 488 nm en 594 nm), aan te elk kanaal na elkaar (door lijn of frame), en gemiddeld 4-6 scans voor het uiteindelijke beeld. Optimale beeldresolutie zal microscoop-specifiek zijn, maar 1024 x 1024 levert meestal goede resultaten.
3. Schakel de confocale beeldvorming pad en focus naar een z-vlak door het midden van de cel.
4. Optimaliseren pinhole (typisch 1 Airy eenheid), laservermogen en fotomultiplier buis voltage (gain) en offset voor elk kanaal. Opslaan / opnemen deze instellingen. Gebruik dezelfde microscoop instellingen voor het afbeelden alle cellen gelabeld voor een gegeven doel pair in dezelfde repliceren.
   Opmerking: Dit proces zal gewoonlijk resulteren in voldoende fotobleken dat deze cel niet worden afgebeeld voor analyse.

6. Imaging

1. Het gebruik van een hoge vergroting doel (bijvoorbeeld 100X), eerst een cel die moet worden afgebeeld met behulp van epifluorescentie lokaliseren.
2. Schakel de confocale beeldvorming pad en focus naar een z-vlak door het midden van de cel. Ikf beschikbaar zijn, gebruiken software zoom / gewas om de scan gebied om de cel van belang te beperken.
3. Maak foto's voor elk gemerkt kanaal met de instellingen eerder vastgestelde. Herhaal stap 6,1-6,3 om de afbeelding 15 of meer cellen per conditie per repliceren naar een voldoende steekproef te waarborgen.

7. colocalization Analyse

1. Open het paar afbeeldingen (bijvoorbeeld, "groene" en "rode") van een cel in ImageJ. Gebruik de Afbeelding> Kleur> Kanalen Samenvoegen ... commando om een ​​RGB-afbeelding te genereren.
2. Trek een selectie rond de cel van belang. Gebruik ImageJ plugin "PSC colocalization" ^(11; verkrijgbaar van https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) tot colokalisatie van de doelstellingen kwantificeren de geselecteerde cel.
3. Noteer de gewenste colocalization maatregel (meestal Pearson's r ^17). Herhaal stap 7,1-7,3 voor elke cel afgebeeld.

8. gegevens Normalisatie

1. Bereken het gemiddelde van de geregistreerde colocalization waarden van de gemeenschappelijke controlecondities van elk exemplaar van elk labeling conditie.
   Opmerking: Bijvoorbeeld, het gemiddelde van de waarden colocalization van neuronen in de "48-hr voertuig 60-min voertuig" drug toestand in elk van 3 onafhankelijke herhalingen van iedere 3 labeling omstandigheden (receptor en elk van 3 compartimenten).
2. Vermenigvuldig het middel (-1) teneinde de verschuiving voor elke replicaat elk labeling conditie. Voeg de offset voor elke repliceren in elke etikettering voorwaarde om elke colocalization waarde in die repliceren.
   Opmerking: Dit zal de gegevens normaliseren, zodanig dat de gemiddelde colocalization maatregel voor de gemeenschappelijke controle conditie is 0 in elk exemplaar van elk etikettering conditie.
3. Verzamel de gegevens van alle replicaten van elke labeling conditie.
   Opmerking: Veranderingen in colocalization kan nu worden geanalyseerd over replica. Statistische analetion zal afhangen van experimentele opzet, maar zal doorgaans betrekken analyse-van-variantie (ANOVA), gevolgd door de juiste post-hoc tests (bv, Tukey). Voor statistische bronnen, zie bijvoorbeeld ^18.

Results

Met deze techniek is het mogelijk om veranderingen in post-receptor internalisatie handel na zowel chronische / acute en langdurige behandeling met medicijnen te kwantificeren. Na medicamenteuze behandelingen, fixatie, en etikettering, zijn hoge-resolutie tweekanaals microfoto gevangen van elke cel van belang. Representatieve beelden kunnen gecombineerd worden met valse kleuren colocalization naar illustratieve figuren (figuur 1) te genereren. Latere colocalizational analyse, zoals beschreven, opbrengst...

Discussion

We hebben dit protocol voor de analyse van primaire kweken van volwassen dorsale wortel ganglion neuronen (primaire sensorische neuronen) geoptimaliseerd. Het kan ook worden toegepast met weinig of geen wijziging, voor monolaag gekweekte cellen uitgeplaat lijnen. De colocalizational analyse is ook mogelijk in het weefsel plakjes en andere dergelijke preparaten ^11, maar de behandeling met geneesmiddelen en weefsel fixatie / voorbereiding componenten zou niet passend zijn.

Interessa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503-500G
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S9888-500G
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	258148
Albumin uit runderserum	Sigma Aldrich	A7906-100G
Gelatine uit huid van koudewatervissen	Sigma Aldrich	G7041-100G
Corning Costar celcultuur platen: 24-well	Fisher Scientific	720084
12 cirkel Microscoop Dekglas	Fisher Scientific	1254580
Aqua/Poly-Mount	Polysciences	18606-20
Natriumfosfaat monobasic	Sigma Aldrich	S9638-500G
Natriumfosfaat dibasic	Sigma Aldrich	S9763-500G
Paraformaldehyde	Polysciences	00380-1
Dumont #5 Pincet - Standaard/Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30
Konijn anti-DOR antilichaam	MyBioSource	MBS316175	Gebruikt bij 1:1.500
Muis anti-Rab5 antilichaam	Sigma Aldrich	R7904	Gebruikt bij 1:750
Muis anti-Rab11 antilichaam	Millipore	05-853	Gebruikt bij 1:500
Geit anti-LAMP1 antilichaam	Santa Cruz	SC8098	Gebruikt bij 1:750
Ezel anti-konijn Alexa 488 geconjugeerd antilichaam	Life Technologies	A-21206	Gebruikt bij 1:200 tot 1:2.000
Geit anti-muis Alexa 594 geconjugeerd antilichaam	Life Technologies	A-11005	Gebruikt bij 1:200 tot 1:2.000
Ezel anti-geit Alexa 594 geconjugeerd antilichaam	Life Technologies	A-11058	Gebruikt bij 1:200 tot 1:2.000