Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Samenvatting

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Samenvatting

Meta-omische technologieën zoals metagenomica, metatranscriptomics en metaproteomics kunnen helpen bij het begrijpen van de microbiële gemeenschapsstructuur en het metabolisme. Hoewel krachtig, kan metagenomica alleen het functionele potentieel verduidelijken. Aan de andere kant maakt metaproteomics de beschrijving van het tot expressie gebrachte in situ metabolisme en de functie van een gemeenschap mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor cellyse, eiwit- en DNA-isolatie, evenals peptide-digestie en extractie uit mariene microbiële cellen verzameld op een cartridge-filterunit (zoals de Sterivex-filterunit) en bewaard in een RNA-stabilisatieoplossing (zoals RNAlater). In massaspectrometrie-gebaseerde proteomics-studies wordt de identificatie van peptiden en eiwitten uitgevoerd door peptide-tandemmassaspectra te vergelijken met een database van vertaalde nucleotidesequenties. Het opnemen van het metagenoom van een monster in de zoekdatabase verhoogt het aantal peptiden en eiwitten dat kan worden geïdentificeerd uit de massaspectra. Daarom wordt in dit protocol DNA geïsoleerd uit dezelfde filter, die vervolgens kan worden gebruikt voor metagenomica-analyse.

Inleiding

Micro-organismen zijn alomtegenwoordig en spelen een essentiële rol in de aarde biogeochemische cycli ^1. Momenteel zijn er tal van moleculaire benaderingen beschikbaar voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen structuur en functie. Meestal wordt de analyse van 16S rRNA gensequenties PCR-geamplificeerd van milieu DNA ^{2 - 4.} Een nadeel van 16S rRNA gen analyse is dat het alleen informatie over de identiteit en fylogenetische Gemeenschapsstructuur weinig informatie over metabolische functie. In tegenstelling, benaderingen zoals metagenomica, transcriptoomstudie en MetaProteomics geven informatie over de gemeenschap structuur en de stofw....

Protocol

1. Bereid reagentia

1. Bereid SDS-extractie-oplossing: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA en 1% SDS. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
2. Bereid voorraad reagentia die nodig zijn voor de polyacrylamidegel.
   1. Bereid 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
   2. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
   3. Bereid 10% SDS. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
3. Bereid oplossingen nodig ....

Resultaten

Als een demonstratie, voerden we het protocol over twee zeewater monsters van het oppervlak en de chlorofyl maximum van de kust oceaan in Noord-Canada. Op zee, 6-7 liter zeewater werd door een 3 urn GF / D prefilter, dan microbiële cellen werden verzameld op een 0,22 urn filter cartridge apparaat volgens het protocol van Walsh et al. ^20. Cellen werden onmiddellijk opgeslagen in een RNA-stabilisatie oplossing totdat verdere verwerking. Bij terugkeer naar het lab, voerden we het protocol zoals het hier.......

Discussie

Monster behoud is de sleutel tot metaproteomic studies en eerdere werk heeft aangetoond dat een RNA stabilisatie oplossing is een handig opslag buffer voor het opslaan van de cellen voorafgaand aan eiwitextractie ^28. Idealiter zouden de monsters worden geconserveerd in situ verschuivingen in eiwitexpressie teniet tijdens hantering ^33,34. In feite, in situ sampling en fixatie technologieën ontwikkeld, waarmee de autonome verzamelen en bewaren van monsters per schip ingezet instrume.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 of TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5 ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO vial 9 mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest