Methodenartikel

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52827

⸱

15 september 2015

 , 
1Department of Biology, Concordia University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Samenvatting

Meta-omische technologieën zoals metagenomica, metatranscriptomics en metaproteomics kunnen helpen bij het begrijpen van de microbiële gemeenschapsstructuur en het metabolisme. Hoewel krachtig, kan metagenomica alleen het functionele potentieel verduidelijken. Aan de andere kant maakt metaproteomics de beschrijving van het tot expressie gebrachte in situ metabolisme en de functie van een gemeenschap mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor cellyse, eiwit- en DNA-isolatie, evenals peptide-digestie en extractie uit mariene microbiële cellen verzameld op een cartridge-filterunit (zoals de Sterivex-filterunit) en bewaard in een RNA-stabilisatieoplossing (zoals RNAlater). In massaspectrometrie-gebaseerde proteomics-studies wordt de identificatie van peptiden en eiwitten uitgevoerd door peptide-tandemmassaspectra te vergelijken met een database van vertaalde nucleotidesequenties. Het opnemen van het metagenoom van een monster in de zoekdatabase verhoogt het aantal peptiden en eiwitten dat kan worden geïdentificeerd uit de massaspectra. Daarom wordt in dit protocol DNA geïsoleerd uit dezelfde filter, die vervolgens kan worden gebruikt voor metagenomica-analyse.

Inleiding

Micro-organismen zijn alomtegenwoordig en spelen een essentiële rol in de aarde biogeochemische cycli 1. Momenteel zijn er tal van moleculaire benaderingen beschikbaar voor het karakteriseren van microbiële gemeenschappen structuur en functie. Meestal wordt de analyse van 16S rRNA gensequenties PCR-geamplificeerd van milieu DNA 2 - 4. Een nadeel van 16S rRNA gen analyse is dat het alleen informatie over de identiteit en fylogenetische Gemeenschapsstructuur weinig informatie over metabolische functie. In tegenstelling, benaderingen zoals metagenomica, transcriptoomstudie en MetaProteomics geven informatie over de gemeenschap structuur en de stofwisseling. Metagenomica, of de analyse van het gen inhoud van een verzameling van organismen, geeft informatie over de structuur en de functionele mogelijkheden van de gemeenschap 5-8. Hoewel krachtig kan deze functionele potentie niet overeenstemmen met de metabolischeactiviteiten van organismen. Genotype van een organisme wordt vertegenwoordigd door de genen, die elk kunnen worden getranscribeerd naar RNA en verder vertaald naar eiwit, wat resulteert in een fenotype. Dus, om te helpen bij het ​​begrijpen van microbiële functionele activiteit in een omgeving moet postgenomische analyse uitgevoerd 9. Transcriptoomstudie of de analyse van RNA-transcripten is nuttig omdat het toont welke genen worden getranscribeerd in een bepaalde omgeving. Echter, mRNA niet altijd overeenkomen met hun overeenkomstige proteïne verhogen door translationele regulering, RNA halfwaardetijd, en het feit dat meerdere kopieën eiwit kan worden gegenereerd voor iedere 10 mRNA.

Om deze redenen MetaProteomics wordt nu erkend als een belangrijk instrument voor het milieu microbiologie. Gemeenschappelijke metaproteomic analyseert gebruik een shotgun proteomics aanpak waar de buurt volledige aanvulling van eiwitten in een complex monster worden gezuiverd en tegelijkertijd geanalyseerd, meestal door middel van een eigenzymatic spijsvertering in peptiden en analyses over een massaspectrometer. Daaropvolgende tandem massaspectrometrie (MS / MS) "peptide fingerprinting" wordt gebruikt om de peptidesequentie en potentiële eiwit van oorsprong door proteïne-database zoeken (zie voor een overzicht 11) te bepalen. Proteomics werk heeft een lange weg afgelegd in de afgelopen 25 jaar, dankzij de stijging van de genomische beschikbaarheid van gegevens en de toename van de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van massaspectrometers waardoor high-throughput identificatie en kwantificatie 11,12 eiwit. Aangezien eiwitten zijn het eindproduct van genexpressie, kan metaproteomic gegevens te bepalen welke organismen actief zijn in een bepaalde omgeving en welke eiwitten ze tot expressie zijn. Dit is voordelig wanneer het proberen om te bepalen hoe een bepaalde set van omgevingsvariabelen het fenotype van een organisme of de gemeenschap zal beïnvloeden. Vroeg, MS / MS-gebaseerde metaproteomic studies in de oceaan werden gebruikt om specifieke eiwitten te identificeren in gerichtemicrobiële lineages, eerste studie gericht op het licht aangedreven proton pomp proteorhodopsin in SAR11 mariene bacteriën 13. Recenter zijn vergelijkende analyses metaproteomic differentiële eiwit expressiepatronen tussen gemeenschappen die toegelicht. Voorbeelden zijn onder meer de identificatie van temporele verschuivingen in de stofwisseling in de kust Noordwest-Atlantische Oceaan 14 of het Antarctisch Schiereiland 5. Andere studies hebben veranderingen beschreven in eiwitexpressie patronen in ruimtelijke schalen, bijvoorbeeld langs een geografisch transect een lage nutriënt ocean wervel een hoogproductieve kust opwelling systeem 15. Voor verdere beoordelingen van MetaProteomics raden wij Schneider et al. (2010) 9 en Williams et al. (2014) 16. Gerichte proteomics is ook werkzaam in de afgelopen jaren expressie van specifieke metabole pathways kwantificeren milieu 17,18.

There zijn drie belangrijke fasen in metaproteomic analyse. De eerste fase is monstervoorbereiding die monsterneming, cellysis en concentratie van eiwit bevat. Monsterverzameling in mariene microbiologie leidt vaak filtratie van zeewater door een voorfilter grotere eukaryotische cellen, deeltjes en deeltjes geassocieerde bacteriën te verwijderen, gevolgd door filtreren voor het afvangen van vrij levende microbiële cellen, gewoonlijk met behulp van een 0,22 um cartridge filterinstallatie 19,20. Deze filters zijn ingegoten in een kunststof cilinder en een cellyse en eiwit-extractie protocol dat binnen de filtereenheid kan worden uitgevoerd, kunnen een waardevol instrument zijn. Zodra biomassa wordt verkregen, moeten de cellen worden gelyseerd om voor eiwitextractie. Verschillende werkwijzen kunnen worden toegepast, zoals guanidine-HCl lysis 21 en natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis gebaseerde methoden. Hoewel wasmiddelen als SDS zijn zeer efficiënt bij het verstoren van membranen en het oplosbaar maken vele soorten eiwitten, concentratiONS zo laag als 0,1% kunnen interfereren met stroomafwaartse eiwit vertering en MS-analyse 22. Van groot belang is de negatieve effecten van SDS voor trypsinedigestie efficiency, oplossend vermogen van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en ion onderdrukking of accumulatie in de ionenbron 23.

De tweede fase fractionering en analyse, waarbij eiwitten worden onderworpen aan enzymatische digestie gevolgd door LC MS / MS analyse, waardoor am / z fragmentatiepatroon die kunnen worden gebruikt voor de primaire aminozuursequentie van het tryptische peptide initiële bepalen. Verschillende digestiemethoden kunnen worden gebruikt afhankelijk van de soorten reinigingsmiddelen gebruikt, evenals de stroomafwaartse massaspectrometrie workflow. In het protocol wordt 1-D PAGE elektroforese, gevolgd door verwijdering van SDS uit de gel gebruikt om eventuele verontreinigingen te verwijderen detergens. De analyse van eiwitten moeilijk oplosbaar, zoals membraaneiwitten zijn, vereist het gebruik van hoge concentraties van SDS of andere schoonmaakmiddelen. Dit leidt tot compatibiliteitsproblemen met SDS-gelelektroforese. Wanneer het doel van onderzoek vereist het oplossen van deze harde eiwitten oplosbaar te maken, kan de buis-gelsysteem gebruikt 22,24. De buis-gel methode omvat eiwitten in de gel matrix zonder het gebruik van elektroforese. Vervolgens elke reinigingsmiddelen gebruikt voor het oplosbaar zijn voor de vertering van eiwitten verwijderd.

De derde fase is de bio-informatica-analyse. In deze fase worden de MS / MS peptide data doorzocht tegen een databank van vertaald nucleotidesequenties te bepalen welke peptiden en proteïnen in het monster aanwezig zijn. De identificatie van peptiden is afhankelijk van de databank wordt doorzocht tegen. Marine metaproteomic gegevens worden vaak gezocht tegen databases bestaat uit referentie genomen, metagenomic gegevens zoals het Global Ocean Sampling dataset 25, evenals enkele cel versterkt genomen uit onontgonnen lineages 26,27. Eiwit identificatie kan ook worden verhoogd door het opnemen van metagenomic sequenties van hetzelfde monster als metaproteomic data afkomstig 5.

Hier geven we een protocol voor het genereren van peptiden die geschikt zijn voor MS / MS-gebaseerde analyse van microbiële biomassa door filtratie verzameld en opgeslagen in een RNA stabilisatie oplossing. De hier beschreven protocol zorgt voor DNA en eiwitten te worden geïsoleerd van hetzelfde monster, zodat alle stappen in de aanloop naar het eiwit en DNA neerslag zijn identiek. Vanuit praktisch oogpunt, minder filtering nodig omdat slechts één filter is vereist voor zowel eiwit- en DNA-extractie. We willen ook graag om te erkennen dat dit protocol werd gecreëerd door de combinatie, aanpassing en wijziging van de twee eerder gepubliceerde protocollen. De cellysis stappen worden aangepast van Saito et al. (2011) 28 en de in-gel trypsinedigest component wordt aangepast van ShevcheNKO et al. (2007) 29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid reagentia

  1. Bereid SDS-extractie-oplossing: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA en 1% SDS. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
  2. Bereid voorraad reagentia die nodig zijn voor de polyacrylamidegel.
    1. Bereid 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
    2. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
    3. Bereid 10% SDS. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 pm filter en bewaar bij kamertemperatuur.
  3. Bereid oplossingen nodig voor in-gel trypsine verteren en peptide extractie.
    1. Bereid 100 mM ammoniumbicarbonaat. Filter-steriliseren met behulp van een 0,22 um filter en bewaar bij 4 ° C.
    2. Bereid 1 M DTT voorraden. Gesuspendeerd in 100 mM ammoniumbicarbonaat en bewaar bij -80 ° C.
    3. Bereid 550 mm joodacetamide voorraden. Gesuspendeerd in100 mM ammoniumbicarbonaat en bewaar bij -80 ° C.
    4. Bereid 100 ng / ul trypsine voorraden. Aliquot 60 ul in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C.
    5. Bereid extractieoplossing: 1% mierezuur, 2% acetonitril.
    6. Bereid resuspensie oplossing: 5% acetonitril en 0,1% mierenzuur.

2. Voer cellysis in Cartridge Filter Unit met Cellen Bewaarde in RNA Stabilization Solution

  1. Verdrijf het RNA stabiliseren oplossing uit de cassette filtereenheid (1,5 ml) en in een 2 ml microcentrifugebuis met een 60 ml injectiespuit bevestigd aan de luer-lock uiteinde van het filter.
  2. Centrifugeer de 2 ml microcentrifugebuis gedurende 10 min bij 17.000 xg één celafval te pelleteren. Dit wordt gedaan zodat het filter in stap 2,3 niet verstoppen.
  3. Breng supernatant van een 10 K ultracentrifugale filtereenheid één eiwitten afkomstig van cellen die zijn gelyseerd door het bevriezen / tha vangenw van het monster. Laat de pellet niet weg. Het wordt gebruikt in stap 2,5. Voer centrifugeren van de ultracentrifugale filtereenheid bij 3270 g gedurende 30 minuten of totdat het volume teruggebracht tot ongeveer 600 pl.
  4. Smelt de punt van een p10 tip en blokkeert de niet luer-lock van het patroonfilter eenheid met het open uiteinde van de punt. Dit zal ervoor zorgen dat er geen extractiebuffer en biomassa ontsnapt tijdens stappen 2,5-2,7.
  5. Hang de pellet in 1 ml SDS-extractie-oplossing en pipet het in de originele cartridge filter. De eenvoudigste manier om pipet in de cartridge filter unit is om een ​​P200 tip stapelen op een P1000 tip en gebruiken deze dubbele tip voor pipetteren.
  6. Voeg 1 ml van SDS extractieoplossing de cartridge filtereenheid zodat het totale volume ongeveer 2 ml en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder roteren in een hybridisatieoven. Plaats 3 verfrommeld lab doekjes onderin een 50 ml conische buis. Parafilm beide uiteinden van de cartridge filtereenheid geslotenen zet de cartridge filter unit in de 50 ml buis. Sluit het deksel en zet de buis in de hybridisatie oven.
  7. Na 10 min plaats de Sterivex filteren op een schuim drijver en zet hem op zijn plaats met een 5 ml spuit op de luer-lock end. Zweven en incuberen in een 95 ° C waterbad gedurende 15 minuten.
  8. Laat de cartridge filtereenheid koel en roteren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (als in stap 2,6).
  9. Verdrijf de SDS extractieoplossing / cellysaat van het filter met een injectiespuit 60 ml in dezelfde ultracentrifugale filtereenheid zoals hierboven (stap 2,3). Voeg 1 ml vers SDS extractieoplossing de cartridge filtereenheid en meng gedurende 30 seconden met de hand, dan verdrijven in de ultracentrifugale filtereenheid met de injectiespuit 60 ml. Dit is de cartridge filtereenheid spoelen zodat alle eiwitten zijn verwijderd.
  10. Voer centrifugeren op de ultracentrifugale filtereenheid gedurende 45 min bij 3270 xg of totdat het volume in de filtereenheid is dan 600 pi.
  11. Discard doorstroming en vul de ultracentrifugale filter unit met verse SDS-extractie-oplossing.
  12. Centrifugeer de filtereenheid nog eens 45 min bij 3270 x g.
  13. Herhaal de stappen 2,11 en 2,12 keer meer. Zorg het eindvolume van de ultracentrifugale filtereenheid ten hoogste 600 ul aan het einde van de laatste centrifuge.
  14. Op dit moment het concentraat verdeeld in twee. Één fractie wordt gebruikt voor DNA precipitatie en een voor proteïneprecipitatie.
    Opmerking: De fractionering bedrag is afhankelijk van de hoeveelheid biomassa die werd gefiltreerd en het beoogde gebruik van de producten. In ons geval, we deelden het concentraat met 10% voor DNA precipitatie en 90% aan eiwit neerslag.

3. Eiwit neerslag

  1. Voeg 4 volumes methanol: aceton (50:50) om een ​​hoeveelheid concentraat en vortex gedurende 10 seconden. Incubeer overnacht bij -20 ° C.
  2. Spin neer op 17.000 xg gedurende 30 minuten. Schenk de bovenstaande vloeistofen laat de pellet drogen (kan onzichtbaar zijn) in een speedvac gedurende 1 uur (of tot het droog is).
    Let op: Niet te droog de korrel, omdat dit het moeilijk te mengen kunnen maken.
  3. Suspendeer de pellet in 25 pl SDS-extractievloeistof. Laat deze een uur daarna mengen door op en neer pipetteren.
  4. Kwantificeren eiwit met een eiwit assay kit en de fabrikant.

4. DNA Neerslag

  1. Add SDS-extractieoplossing aan het concentraat fractie wordt gebruikt voor DNA precipitatie tot 500 ul merk. Deze stap is slechts het volume van de oplossing te verhogen, waardoor het makkelijker te verwerken.
  2. Voeg 0,583 delen van een eiwit precipitatiereagens (zoals MPC eiwit precipitatiereagens) en vortex gedurende 10 seconden. Je moet een witte neerslag vorm zien.
    Opmerking: we hebben ook fenol: chloroform DNA-extractie werkwijzen, maar het is moeilijker vanwege de lage volumes. We verkregen DNA betere opbrengst met deMPC Protein precipitatiereagens.
  3. Centrifugeer bij 17.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min.
  4. Breng supernatant naar een andere 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 0,95 volumes isopropanol. Inverteer 30-40 keer.
  5. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C met maximale snelheid.
  6. Voorzichtig decanteren en gooi het supernatant.
  7. Tweemaal spoelen met 750 pl 70% ethanol.
  8. Verwijder zoveel ethanol als mogelijk door pipetteren, laat vervolgens aan de lucht drogen.
    Let op: Niet te droog het DNA als dit het moeilijk te mengen kunnen maken.
  9. Resuspendeer in 25 ui TE-buffer laag, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
  10. Kwantificeren DNA met een dsDNA testkit en de fabrikant. Voer agarosegel (1%) elektroforese op 3 gl van het DNA om de kwaliteit te controleren.

5. SDS-PAGE gel van eiwitten

  1. Bereid monsterbuffer (950 ui Laemmli monsterbuffer en 50 pl β-mercaptoethanol).
  2. Voeg de overeenkomstige volume van 15 ug eiwit, of een maximum van 20 gl gelijke volume monsterbuffer en kook 4 min. Monsters kunnen nu worden opgeslagen bij -80 ° C totdat SDS-PAGE worden uitgevoerd.
  3. Bereid 10% acrylamide oplossen gel met een 5% acrylamide stacking gel.
  4. Laad de gel met monsters en 4 pi van een proteïneladder. Voer de gel bij constante 120 V tot 250 kDa ladder marker heeft net bereikt het oplossend gel.
  5. Vlekken op de gel met behulp van een Coomassie beits volgens de instructies van de fabrikant.

6. In-gel trypsine Digest en Peptide Extraction

Opmerking: Alle stappen van hier tot 6.10 worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidskabinet om besmetting te minimaliseren.

  1. Snijd overtollige gel onder de 10 kDa ladder cijfer voor elke baan. Elke baan wordt geanalyseerd op MS / MS apart. Snijd elke baan in 1 mm x 1 mm pleinen oppervlakte te verhogen en zet alle squares van de baan in een lage-bindende micro-centrifugebuis. Herhaal dit voor alle rijstroken. (1% azijnzuur worden toegepast om de gel uitdroogt en steeds moeilijk te snijden).
    Opmerking: Het minimaliseren van besmetting is essentieel in dit stadium dus gel snijden wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast op het glas SDS-PAGE gel mal gebruikt om de gel te maken.
  2. De vlek
    1. Verdeel 50 ul van 100 mM ammoniumbicarbonaat in elk lage bindingsaffiniteit buis, sluit cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
    2. Verdeel 50 ul acetonitril nauwe cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min.
    3. Aspireren en gooi 150 pi.
    4. Herhaal de stappen 6.2.1 en 6.2.2.
    5. Aspireren en gooi 95 pl.
  3. Uitdroging
    1. Verdeel 50 ul acetonitril, dicht cap en wacht 5 min. Aspireren en gooi 45 ui en wacht 10 min.
  4. Reductie
    1. Verdeel 50 ul DTT (10 mM, verdund in 100 mM ammonium bicarbonaat), in de buurt cap en wacht 30 minuten bij 37 ° C.
  5. Alkylering
    1. Verdeel 50 ul joodaceetamide (55 mM, verdund in 100 mM ammoniumbicarbonaat), sluit kap en wacht 20 minuten bij 37 ° C.
    2. Pipetteer 100 ul acetonitril sluiten kap en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C. Aspireren en gooi 195 pi.
  6. Wassen
    1. Verdeel 50 ul ammoniumbicarbonaat, sluit cap en incubeer 10 minuten bij 37 ° C.
    2. Verdeel 50 ul acetonitril nauwe cap en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Aspireren en gooi 120 pl.
  7. Uitdroging
    1. Verdeel 50 ul acetonitril, dicht cap en wacht 5 min. Aspireren en gooi 45 pl.
    2. Verdeel 50 ul acetonitril, wacht 5 min.
    3. Aspireren en gooi 75 ul en wacht 5 min.
  8. Spijsvertering
    1. Verdeel 25-30 pl 6 ng / ul trypsine (until alle gel fragmenten zijn bedekt). Sluiten cap en wacht 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Incubeer overnacht (ten minste 4,5 uur) bij 37 ° C.
    3. Laat op kamertemperatuur gedurende 30 min.
  9. Extractie en Peptide Transfer
    1. Verdeel 30 ul van extractie-oplossing en bedek met deksel gedurende 30 minuten op ijs.
    2. Zuig 30 ul en afzien aangezogen volume in een nieuw label low-bindend buis.
    3. Verdeel 12 ul extractievloeistof en 12 ul acetonitril in de oorspronkelijke buis (met gel). Sluiten cap en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    4. Zuig 15 ul en storting in de nieuwe buis.
    5. Herhaal stappen (6.9.3 en 6.9.4).
  10. Plaats nieuwe buizen in een SpeedVac tot het droog is.
  11. Resuspendeer in 50 ul resuspensie oplossing. Vortex op medium voor 10 min te mengen.
  12. Pipetteer peptideoplossing in ofwel nano / LC flesjes of 96-well platen geschikt voor nano / LCMS / MS werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als een demonstratie, voerden we het protocol over twee zeewater monsters van het oppervlak en de chlorofyl maximum van de kust oceaan in Noord-Canada. Op zee, 6-7 liter zeewater werd door een 3 urn GF / D prefilter, dan microbiële cellen werden verzameld op een 0,22 urn filter cartridge apparaat volgens het protocol van Walsh et al. 20. Cellen werden onmiddellijk opgeslagen in een RNA-stabilisatie oplossing totdat verdere verwerking. Bij terugkeer naar het lab, voerden we het protocol zoals het hier...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Monster behoud is de sleutel tot metaproteomic studies en eerdere werk heeft aangetoond dat een RNA stabilisatie oplossing is een handig opslag buffer voor het opslaan van de cellen voorafgaand aan eiwitextractie 28. Idealiter zouden de monsters worden geconserveerd in situ verschuivingen in eiwitexpressie teniet tijdens hantering 33,34. In feite, in situ sampling en fixatie technologieën ontwikkeld, waarmee de autonome verzamelen en bewaren van monsters per schip ingezet instrume...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Marcos Di Falco bedanken voor zijn expertise en advies bij de voorbereiding van de monsters voor nano-LC MS/MS, evenals Dr. Zoran Minic van de University of Regina voor de LC MS/MS analyse. Dit werk werd ondersteund door NSERC (DG402214-2011) en CRC (950-221184) financiering. D.C. werd ondersteund door het Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems en FQRNT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sterivex -GP 0.22 μm filter unitMilliporeSVGP01050Sampling
RNAlater Stabilization SolutionAmbionAM7021Sampling
Tris Bio Basic77-86-1 of TB0196-500GProtein Extraction/ SDS PAGE gel
DTTSigma-AldrichD0632-1GProtein Extraction
SDSBio Basic15-21-3Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTABio Basic6381-92-6Protein Extraction
GlycerolFisher Scientific56-81-5Protein Extraction
10K Amicon FilterMilliporeUFC801024Protein Extraction
MethanolSigma-Aldrich179337-4LProtein Precipitation
AcetoneFisher Scientific67-64-1Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagentEpicentermmP03750DNA Precipitation
2-PropanolFisher Scientific67-63-0DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kitLife TechnologiesQ32850DNA Quantification
Qubit Protein Assay kitLife TechnologiesQ33211Protein Quantification
SucroseBio Basic57-50-1SDS PAGE gel
TEMEDBio Rad161-0800SDS PAGE gel
APSBio Rad161-0700SDS PAGE gel
30% AcrylamideBio Rad161-0158SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060SDS PAGE gel
GlycineBio Rad161-0718SDS PAGE gel
B-mercaptoethanolBio Basic60-24-2SDS PAGE gel
Laemmli Sample BufferBio Rad161-0737SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope LadderBio Rad161-0375EDUSDS PAGE gel
AcetonitrileVWRCABDH6044-4In-gel Trypsin digest
NH4HCO3Bio Basic1066-33-7In-gel Trypsin digest
DTTSigma-AldrichD0632-1GIn-gel Trypsin digest
Formic AcidSigma-AldrichF0507-500MLIn-gel Trypsin digest
HPLC grade H2OSigma-Aldrich270733-4LIn-gel Trypsin digest
IodoacetamideBio Basic144-48-9In-gel Trypsin digest
TrypsinPromegaV5111In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5 mlEppendorf22431081In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO vial 9 mmCandian Life ScienceVT009/C395SBIn-gel Trypsin digest
PP BM insert, No springCandian Life Science4025P-631In-gel Trypsin digest

Referenties

  1. Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
  2. El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
  3. Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
  4. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972(1986).
  5. Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
  6. Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
  7. Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
  8. Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
  9. Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
  10. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  11. Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
  12. Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
  13. Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
  14. Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
  15. Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
  16. Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
  17. Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
  18. Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
  19. Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
  20. Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
  21. Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
  22. Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
  23. Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
  24. Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
  25. Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77(2007).
  26. Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
  27. Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  28. Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215(2011).
  29. Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
  30. Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).
  31. Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
  32. Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
  33. Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
  34. Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote ne extractieDNA isolatiegeneratie van tryptische peptidenultracentrifugaal filterprote neprecipitatieDNA precipitatiein gel trypsineverteringmetagenomische analyse

Gerelateerde artikelen