Ontwerp en constructie van kunstmatige extracellulaire matrix (AECM) Eiwitten uit Escherichia coli Voor Skin Tissue Engineering

Samenvatting

Recombinante technologieën hebben materiaalontwerpers in staat gesteld om nieuwe kunstmatige eiwitten te creëren met aangepaste functionaliteit voor toepassingen in weefselengineering. Bijvoorbeeld, kunstmatige extracellulaire matrix-eiwitten kunnen worden ontworpen om structurele en biologische domeinen te bevatten die zijn afgeleid van natuurlijke ECM's. Hier beschrijven we de constructie en zuivering van aECM-eiwitten die elastine-achtige herhalingen bevatten.

Samenvatting

Recombinante technologie is een veelzijdig platform om nieuwe kunstmatige eiwitten met instelbare eigenschappen te creëren. In het afgelopen decennium zijn er veel kunstmatige eiwitten gemeld die functionele domeinen bevatten die afkomstig zijn uit de natuur (of de novo zijn gecreëerd). In het bijzonder zijn kunstmatige extracellulaire matrix (aECM) eiwitten ontwikkeld; deze aECM eiwitten bestaan uit biologische domeinen die zijn ontleend aan fibronectine, lamininen en collageen en worden gecombineerd met structurele domeinen, inclusief elastine-achtige herhalingen, zijde en collageen herhalingen. Tot op heden zijn aECM eiwitten uitgebreid onderzocht voor toepassingen in weefselengineering en wondgenezing. Onlangs ontwikkelden Tjin en collega's integrine-specifieke aECM eiwitten die zijn ontworpen voor het bevorderen van de aanhechting en proliferatie van humane huidkeratinocyten. In hun werk bevatten de aECM eiwitten celbindende domeinen die zijn ontleend aan fibronectine, laminine-5 en collageen IV, evenals flankerende elastine-achtige herhalingen. Ze toonden aan dat de aECM eiwitten die in hun werk zijn ontwikkeld, veelbelovende kandidaten zijn voor gebruik als substraten in kunstmatige huid. Hier beschrijven we het ontwerp en de constructie van dergelijke aECM eiwitten evenals hun zuiveringsproces met behulp van de thermoresponsieve eigenschappen van elastine.

Inleiding

Al enkele decennia worden zowel synthetische als natuurlijke materialen onderzocht voor gebruik als scaffolds in weefsel engineering^1,2. Terwijl synthetische materialen zoals polymeren uitstekende structurele integriteit en instelbare mechanische eigenschappen bieden, hebben ze vaak onvoldoende bioactiviteit om groei en infiltratie van weefsels te bevorderen. Aan de andere kant hebben natuurlijke materialen zoals extracellulaire matrix (ECM) eiwitten uitstekende biologische activiteit, maar hebben ze beperkingen zoals variabiliteit tussen batches, snelle degradatie en immunogeniciteitsproblemen. Daarom zijn recombinante eiwitten gewenst, omdat ze ontworpen kunnen worden om alleen de gewenste eigenschappen van natuurlijke eiwitten na te bootsen^3,4.

Recombinant eiwit engineering heeft brede interesse gewekt als een veelzijdig platform voor het ontwerp en de productie van nieuwe kunstmatige eiwit biopolymeren. Door de genetische sequentie te beheersen, kunnen de functionaliteiten van de kunstmatige eiwitten worden aangepast voor een breed scala aan toepassingen^5,6. In het bijzonder kunnen kunstmatige extracellulaire matrix (aECM) eiwitten worden aangepast om meerdere functionaliteiten te hebben voor toepassingen in weefsel engineering, regeneratie en wondherstel^2,7. Belangrijker nog, vorderingen in klonerings- en zuiveringstechnologieën hebben de schaalbaarheid verhoogd en de productiekosten van recombinante eiwitten enorm verlaagd. Het is mogelijk om grote hoeveelheden recombinante eiwitten te produceren tegen lage productiekosten die economisch zijn voor gebruik in de kliniek⁵.

Kunstmatige extracellulaire matrix eiwitten zijn ontwikkeld voor weefsel engineering toepassingen^8-11. Bijvoorbeeld, Tirrell et al. ontwierpen een vaatgraft met kleine diameter met behulp van kunstmatige eiwitten die fibronectine CS5-sequentie en elastine-achtige herhalingen (ELP-CS5) bevatten. Ze toonden aan dat humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVECs) in staat waren om op deze materialen te hechten en te groeien¹². Anderen hebben ook korte bioactieve sequenties uit fibronectine, collageen, laminine, fibrinogeen en vitronectine opgenomen, evenals structurele domeinen die elastine, spinzijde en collageen nadoen om een verscheidenheid aan fusie-eiwitten te creëren¹⁰. Bulk cross-linked films gemaakt van elastine-gebaseerde aECM-eiwitten vertoonden ook mechanische eigenschappen vergelijkbaar met die van natuurlijke elastine (elastische moduli variëren tussen 0,3-0,6 MPa)¹³. Vervolgens werd ook gerapporteerd dat aECM-eiwitten die langere fibronectine-fragmenten bevatten, de wondgenezing in vitro versnelden vanwege verhoogde integrine bindingsaffiniteiten⁸.

Recentelijk zijn integrine-specifieke kunstmatige ECM-eiwitten ontwikkeld door Tjin en collega's¹⁴. Elk aECM-eiwit bevat een bioactieve celbindende domein afkomstig van ECM-componenten van natuurlijke menselijke huid^2,7,15, zoals laminine-5, collageen-IV en fibronectine. Bijvoorbeeld, de integrine α₃Β₁ is aangetoond dat het de PPFLMLLKGSTR-sequentie bindt die wordt gevonden in het laminine-5 alfa-3-ketting globulaire domein 3 (LG3)^16,17. In hun rapport toonden ze aan dat primaire humane epidermale keratinocyten verschillende integrinen gebruiken voor binding aan elk van de aECM-eiwitten, afhankelijk van het type celbindende domein dat aanwezig is.

De aECM-eiwitten die in het werk van Tjin et al. worden besproken, bevatten flankerende elastine-achtige domeinen {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ die elasticiteit verlenen die de mechanische eigenschappen van menselijke huid nabootst. Bovendien verhoogt de opname van lysine-residuen binnen de elastine-achtige herhalingen ook de algehele eiwit oplosbaarheid in waterige oplosmiddelen. Bovendien dienen de lysine-residuen ook als crosslinking-plaatsen om de vorming van crosslinked aECM-films te vergemakkelijken¹². Opname van elastine-achtige herhalingen binnen de aECM-eiwitsequentie maakt het mogelijk om de eiwitten gemakkelijk te zuiveren via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastinen ondergaan een scherpe en omkeerbare faseovergang bij een specifieke temperatuur bekend als de lagere kritische oplostemperatuur (LCST) of de omgekeerde overgangstemperatuur (T_t)^18-20. Elastinen en elastine-achtige herhalingen nemen hydrofiele willekeurige coil-conformatieën aan onder hun LCST en worden oplosbaar in water, terwijl boven hun LCST elastinen snel aggregaten tot micron-grootte deeltjes. Dergelijke faseovergangen zijn omkeerbaar en kunnen dus worden gebruikt om elastine-gebaseerde aECM-eiwitten gemakkelijk te zuiveren via de ITC-techniek²¹.

In dit werk rapporteren we een gegeneraliseerde procedure om kunstmatige ECM-eiwitten te ontwerpen, constructeren en zuiveren die bioactieve celbindende domeinen bevatten, gefuseerd met elastine-achtige herhalingen. Het proces om de plasmiden te ontwerpen en te klonen die coderen voor de aminozuursequenties voor de aECM-eiwitten wordt beschreven. De stappen die betrokken zijn bij het zuiveren van de aECM-eiwitten met behulp van ITC worden geschetst. Ten slotte worden de methoden om de zuiverheid van de verkregen aECM-eiwitten te bepalen met behulp van SDS-PAGE elektroforese en Western Blotting besproken.

Protocol

1. Klonering van recombinant plasmiden die coderen voor eiwitten AECM

1. Ontwerp van de aminozuursequentie van de functionele domein (bijvoorbeeld celbindende domein en elastine-achtige herhalingen). Ontwerp restrictieplaatsen flankeren de uiteinden van de functionele domeinen te vergemakkelijken sub-kloneren met behulp van gratis software volgens de instructies van de software (bijv http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Select unieke restrictieplaatsen die niet in de functionele domein digestie beperken tot de beoogde sites. Kies restrictieplaatsen die in de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de gastheer vector verschijnt (bijvoorbeeld, pET22b (+)) te subkloneren.
2. Reverse vertalen de aminozuur- sequentie in de nucleotidesequentie behulp vrij websites volgens instructies van de software. (Bijv http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Controleer codons zijn geoptimaliseerd voor E. coli gastheren.
3. Gen van belang kan zijn purchased commercieel als enkelstrengs oligonucleotiden (bijvoorbeeld, indien de oligonucleotiden <100 baseparen (bp)) en voer DNA annealing (zie stap 1.4) de kosten te verlagen. Anders naar genen die groter zijn dan 100 bp, ze kunnen worden gekocht via commerciële bedrijven.
4. DNA hybridisatie van de oligonucleotiden
   1. Hybridiseren de DNA oligomeren aan de gewenste gensequentie te verkrijgen. Los DNA oligonucleotiden in een DNA-oligomeer buffer (10 mM Tris: 2-amino-2- (hydroxymethyl) propaan-1,3-diol, pH 8,0, gefilterd) tot een eindconcentratie van 1 ug / ul.
   2. Voeg 4 pi van elk oligomeer tot 32 pl DNA hybridisatie buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCI en 100 nM _MgCl2) tot totaal 40 pi mengsel te bereiken.
   3. Kook een bekerglas water met een kookplaat en onderdompelen gedurende 5 min, 95 ° C het mengsel. Verwijder de beker en geleidelijk afkoelen de set-up in een piepschuim doos O / N gehele. De oligomeren zijn getemperd en zijn klaar voor de spijsvertering.
5. Voeg de overeenkomstige restrictie-enzymen om de gegloeide oligomeren (bijv genoemd insert) en gastheer vector (bijv pET22b (+)) afzonderlijk verteren. Met het volgende recept (1-2 pg DNA, 2 pi van elk restrictie-enzym, 5 ui 10X restrictie-enzym buffer en water tot in totaal 50 pi mengsel) gedurende 3-4 uur bij 37 ° C.
   OPMERKING: De pET22b (+) plasmide-vector is ampicilline antibiotica-resistente en bevat een 6x His-tag aan het C-terminus. De 6x His-tag aanwezig in pET22b (+) kunnen we-His-gemerkte antilichamen gebruiken om het doeleiwit in stap 7 identificeren via Western blotting.
6. Voeg 6x loading dye elke digestiemengsel. Voer de digestie af- zonderlijk omvattende een DNA ladder op 1,2% agarosegels DNA bevattende een UV-fluorescerende DNA kleuring gedurende 1 uur bij 100 V. visualiseren 1,2% DNA agarose gel met UV licht belichtingstoestel.
7. Snijd de gel om verteerd DNA-producten met behulp van commerciële gel zuivering kits te halen. Elute met de minimaal volume van de kolom tot ten minste DNA concentratie van 50-100 ng / pl te bereiken.
8. Combineer het gen van belang achtereenvolgens door het ligeren van het gedigereerde DNA insert (bijv elastine repeats of celbinding domeinen verkregen DNA annealing) in de plasmidevector toepassing van T4 ligase met het volgende recept: (2 pl vector, 1 pi T4-ligase, 1,5 pl T4 ligatiebuffer, x pi insert, 10,5-x pi water gedurende in totaal 15 pi mengsel). Incubeer het ligatiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
   OPMERKING: Molaire concentratie vector te voegen moet variëren om ligatie te optimaliseren. Hoeveelheid inzetstuk genaamd x in het recept is afhankelijk van het geëlueerde DNA-concentratie van stap 1.7.
9. Thaw E. coli DH5a chemisch competente cellen (of klonen stam) op ijs. Warm 2xYT agar-platen (Tabel 1) dat ampicilline (25 gg / ml) tot 37 ° C.
10. Transformeer de cellen met behulpheat shock:
    1. Aliquot 50 pi competente cellen in schone, pre-gekoelde micro-centrifuge buizen. Pipetteer 5 ul (tussen 100 pg tot 100 ng) van het ligatiemengsel in de cellen voorzichtig pipetteren en neer te mengen. Laat het mengsel op ijs gedurende 20 minuten.
    2. Dompel de micro-centrifuge buis met de cel mengsel in een 42 ° C waterbad gedurende 2 minuten en keerde terug naar op ijs gedurende 2 minuten. Tijd de onderdompeling duur om warmte schade aan de cellen te minimaliseren.
    3. Voeg 500 gl SOC medium (tabel 1) in de micro-centrifugebuis en incubeer bij 37 ° C onder schudden gedurende 1 uur.
    4. Verspreid 50 500 pi van de cellen / ligatiemengsel op een 2 x YT agar plaat die is voorverwarmd tot KT, dat ampicilline (25 ug / ml) en incubeer platen omgekeerd bij 37 ° CO / N (12-16 uur) .
11. De volgende dag, pick DNA kolonies van de agar plaat met schoon pipet tips. Groeien de kolonies in 5 ml 2YT medium (Tabel1) dat ampicilline (25 ug / ml) O / N bij 37 ° CO / N (12-16 uur) onder schudden (225 rpm).
12. De volgende dag gebruikt een plasmide isolatiekit het DNA plasmiden extraheer gedurende elke kolonie opgepikt volgens het protocol van de fabrikant. Elueer het DNA met 50 ui water.
13. Voer een test digest met restrictie-enzymen met het volgende recept: (5 ul DNA, 0,2 pl van elk restrictie-enzym, 1 gl 10x restrictie-enzym buffer bijvullen water gedurende in totaal 10 pi mengsel), incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C voor het screenen op kolonies die waarschijnlijk bevatten de insert en run op 1,2% DNA agarosegel zoals in stap 1.6.
    OPMERKING: Bij digestie, een succesvolle ligatie moet resulteert in twee banden, een voor elk van vector en insert die aan hun respectievelijke molecuulgewicht (figuur 1).
14. Stuur de waarschijnlijke kolonies voor DNA-sequencing met behulp van T7 promotor voorwaartse en achterwaartse primers commerciële sequencers.

2. Transformatie van recombinant plasmide in bacteriële expressiegastheer

1. Uit de sequencing resultaat, selecteer een kolonie die met succes geligeerd en gebruik de DNA-plasmide voor transformatie in een E. coli expressie gastheer.
2. Thaw E. coli-expressie stam (BL21 (DE3) pLysS) op ijs. Ondertussen warme agar platen die ampicilline (25 gg / ml) en chlooramfenicol (34 ug / ml) tot kamertemperatuur.
   OPMERKING: De pLysS plasmide aanwezig bacteriestam BL21 (DE3) pLysS bevat een chloramfenicol resistentiegen. De pLysS plasmide bevat een T7 repressor gen dat constitutief tot expressie wordt gebracht om lekkende expressie van het eiwit AECM beperken. Chloramphenicol noodzakelijk te selecteren op bacteriecellen die pLysS bevat tijdens kweken.
3. Herhaal stap 1,10 te verkrijgen getransformeerde E. coli-cellen die klaar zijn om de kunstmatige eiwitten tot expressie zijn. Wikkel agar platen in Parafilm en opslaan ondersteboven in 4 6; C gedurende maximaal één maand.

3. Bacteriële Expressie van AECM Eiwitten

1. Zie Figuur 2, kies een kolonie van de getransformeerde agarplaat met een pipetpunt en beënt in 10 ml steriel Terrific Broth (TB) medium (tabel 1) die zowel ampicilline en chlooramfenicol antibiotica in een reageerbuis. Incubate dit starter cultuur bij 37 ° CO / N (12-16 uur) onder schudden bij 225 rpm.
2. Breng 10 ml van de startercultuur in 1 L verse en steriele media TB aangevuld met dezelfde antibiotica in een 3 L Erlenmeyer kolf. Incubeer de kweek bij 37 ° C onder schudden bij 225 rpm gedurende 2-3 uur en observeer de optische dichtheid van de kweek (OD ₆₀₀₎ bereikt 0,6-0,8 pipetteren 1 ml kweek in een lege cuvet te lezen. Sla 1 ml van de cultuur voorafgaand aan de inductie voor SDS-PAGE karakterisering.
   1. Om OD ₆₀₀ van de celkweek te meten, voor te bereiden 1 flacon van TB media in een cuvetvoor een blanco meting. Afzonderlijk, overdracht 1 ml van de cultuur van de kolf in een nieuwe lege cuvet. Meet de optische dichtheid van de kweek onder toepassing van een spectrofotometer tegen de blanco controle bij een absorptie van 600 nm.
   2. Sla het monster (voor volgende SDS-PAGE-analyse) in door de 1 ml cultuur monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis, centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 2 min, en decanteer supernatant.
3. Braken de kweek met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 225 rpm gedurende nog 4 uur. Sla 1 ml kweek eind inductie bij 4 uur voor SDS-PAGE karakterisatie.
4. Oogst de cellen door overdracht van de cultuur aan 1 L centrifugeflessen en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, wegen de celpellets en resuspendeer in TEN buffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) en 0,5 g / ml.

4. Lysis van bacterieculturen

1. Freeze de re-opgeschort celcultuur bij -80 ° CO / N. Ontdooi de bevroren celkweek in een waterbad bij kamertemperatuur of op ijs om de cellen te lyseren. Voeg 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 ug / ml ribonuclease A (RNase I), en 50 ug / ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), terwijl ontdooien en homogeniseer de oplossing langzaam roeren.
2. Immers geresuspendeerde cellen zijn ontdooid, stel de oplossing op pH 9,0 om de oplosbaarheid in water ¹² eiwit te verhogen. Voeg 6 N NaOH druppelsgewijs onder roeren op ijs een homogene consistentie. Lyse door ultrasone verstoring gedurende 20 min op ijs met behulp van een 2 mm diameter platte tip, 5 sec puls.
3. Centrifugeer de cellen oplossing bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de supernatant naar een schone, lege fles en bewaar bij 4 ° C voor zuivering later.
4. Ondertussen, resuspendeer de celpellet opnieuw met TEN buffer en opnieuw invriezen bij -80 ° C. Naarvolledige cellyse herhalen invriezen / ontdooien en sonificatie proces tot drie maal. Bespaar 20 ul cellysaat voor SDS-PAGE karakterisering.

5. Zuivering van AECM eiwitten met behulp van Inverse Transition Fietsen

1. Sorteren het cellysaat uit stap 4.3 en naar de AECM eiwitten met behulp ITC, vergelijkbaar met die toegepast voor de zuivering van elastine-gebaseerde eiwitten ²¹ te zuiveren. Cycles zal geschieden met de verschillende temperaturen die 4 ° C (aangeduid als "cold") en 37 ° C (aangeduid als "warm") cycli.
2. Verdeel het cellysaat in 50 ml centrifuge flessen en centrifugeer bij 40.000 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C. Het uiterlijk van de cel pellet moet donkerbruin zijn en kijken loopneus.
3. Verwijder het supernatant door pipetteren een schone scheiding van de pellet krijgen. Verzamel de bovenstaande vloeistof in schone centrifugeflessen en voeg NaCl tot een eindconcentratie van 1 M (maximaal 3 M). Warmde oplossing tot 37 ° C gedurende 2 uur onder schudden bij 225 rpm.
   OPMERKING: toevoeging van NaCl de overgang van de elastine component van de AECM veroorzaken aggregatie veroorzaken. De supernatant wordt ingeschakeld troebel. Wanneer de eiwitconcentratie hoog genoeg is, kunnen witte schuimachtige eiwit te zien aan de zijkanten van de centrifugefles.
4. Centrifugeer de supernatant van stap 5,3 bij 40.000 xg gedurende 2 uur bij 37 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof. Plet de pellet met een metalen spatel en resuspendeer de pellet bits in ijskoud geautoclaveerd gedestilleerd water (50 mg / ml) onder krachtig roeren O / N bij 4 ° C met een magnetische roerstaaf en plaat. De pellet moet volledig worden opgelost.
5. Herhaal stap 5,2-5,4 nog drie tot vijf keer een hogere zuiverheid van het eiwit te verkrijgen.
6. Na de laatste cyclus van zuivering, ontzouten de eiwitoplossing door dialyseren tegen gedestilleerd water bij 4 ° C. Dialyseren eiwit oplossing tegen water voor 2-3 dagen met veranderingen in het water elke 4uur of 8 uur voor O / N. Bewaar 20 pl van het gezuiverde eiwit van SDS-PAGE en lyofiliseren de rest van het gezuiverde eiwit en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.

6. Karakterisering van AECM eiwitten door SDS-PAGE elektroforese

1. Bereid een 12% SDS-PAGE-gel (wanneer het molecuulgewicht groot is, gebruiken 8% SDS-PAGE gels betere scheiding). Voeg 2x SDS loading buffer aan elk monster, verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C en laat monsters op de gel gedurende 1 uur bij 100 V of totdat de proteïneladder overeenkomt met het molecuulgewicht van het eiwit AECM het midden van het bereiken gel.
2. Haal de gel uit de SDS-PAGE zetten en registreer Coomassie Brilliant Blue kleuring (Tabel 2) met een volume van de gel gedurende 1 uur onderdompelen in een petrischaal. Spoel gel in een ontkleuroplossing (Tabel 2) gedurende 5 min op een rocker. Wijzig de ontkleuroplossing, en blijven de gel Destain met exponenten tot de achtergrond van tHij gel duidelijk. Eiwitbanden moet duidelijk zichtbaar.
3. Vergelijk de positie van het doeleiwit tegen proteïneladder om het molecuulgewicht van het beoogde eiwit te bepalen.
4. Om de aanwezigheid van het doeleiwit verder te bevestigen, voert western blotting zoals in stap 7.

7. Karakterisering van AECM eiwitten met behulp van Western Blotting

1. Laat de monsters op een 12% SDS-PAGE gel zoals in paragraaf 6 zonder kleuring.
2. Knip nitrocellulose membraan iets groter dan de SDS-PAGE gel. Snij 4 filtreerpapiertjes dezelfde grootte.
3. Natte één stuk filterpapier met Western Transfer Buffer (20% v / v methanol, 25 mM Tris, 190 mM glycine, pH 8,3), plaatst de SDS-PAGE-gel bovenop het filterpapier, gevolgd door een stuk filtreerpapier vervolgens het nitrocellulosemembraan en een uiteindelijke andere twee stukken filtreerpapier. Zorg ervoor dat de hele set-up is ondergedompeld met voldoende westerse overdracht buffer.
   OPMERKING: De gel en het membraan niet in aanraking op dit tijdstip eiwitten kunnen binden aan het membraan bij contact.
4. Overdracht van de eiwitten op het nitrocellulosemembraan door twee filtreerpapier in een western halfdroge overdrachtseenheid, gevolgd door het nitrocellulosemembraan en voorzichtig plaats de SDS-PAGE-gel in en op het membraan, tenslotte plaatst de laatste twee natte filtreerpapier op de SDS-PAGE gel. Voer de westerse overdracht op 45 mA, 30 min. Voeg buffer als de spanning hoger is dan 30 V.
   OPMERKING: Bij voorkeur plaatst de SDS-PAGE gel op de membraan met verschillende pogingen vermijden het verschuiven van de gel onnodig op het membraan eiwitten bij contact kan binden aan het membraan.
5. Ophalen en blokkeren de nitrocellulose membraan met blokkeeroplossing (5% vetvrije melk in PBS pH 7,4, gefilterd met filtreerpapier) gedurende 2 uur bij KT. Gooi blokkeerbuffer en voeg PBS te spoelen.
   OPMERKING: Verander om nieuwe handschoenen om te voorkomen dat besmetting van de membraan met ongewenste proteins.
6. Incubeer primaire anti-His antilichaam met verdunning in PBS bij 1: 1000 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met schommelen. Maak een mengsel in een volume dat het gehele membraan kan dompelen, bijvoorbeeld met verdunningsverhouding 1: 1000, voeg 1 pl antilichaam (voorraadconcentratie: 1 mg / ml) met 999 ul PBS gedurende een 1 ml totaal mengsel.
7. Spoel het membraan met 5 ml PBST (PBS met 0,1% Tween 20).
8. Incubeer met secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (HRP) met verdunning in PBS bij 1: 5000 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met schommelen. Maak een mengsel in een volume dat het gehele membraan kan dompelen, bijvoorbeeld met verdunningsverhouding 1: 5000, voeg 1 pl antilichaam (voorraadconcentratie: 1 mg / ml) tot 4999 ul PBS gedurende een 5 ml totale mengsel.
9. Was het membraan met 5 ml PBST en tweemaal herhalen.
10. Breng de chemiluminescent substraat aan het membraan met een volume aan het membraan bedekken en incubeer door de instructies van het gebruikte substraat.
    OPMERKING: De gevoeligheid van de ondergrond om eiwitdetectie kan variëren, raden we aan een substraat met een maximale gevoeligheid voor zeer lage signalen in het geval toenemende antilichaam concentratie niet signalen toenemen.
11. Leg de chemiluminescerende signalen met behulp van een CCD-camera gebaseerd imager. Stel de primaire en secundaire antilichaamverdunning verhouding als signalen zijn zwak en niet-specifiek. Langer Incubeer in het blokkeren oplossing als achtergrond signaal hoog.

Resultaten

Bij het ​​ontwerpen van fusie-eiwitten die elastine-achtige herhalingen, is het belangrijk om een totaal elastine, voldoende groot deel van het fusie-eiwit ¹⁸ te handhaven. Dit is zodat het fusie-eiwit construct behoudt zijn elastine-achtige kenmerken, teneinde ITC gebruiken voor zuivering. De AECM eiwitten ontwerp en sequenties in dit hoofdstuk beschreven werden specifiek uit het werk genomen door Tjin et al. ^14. In dit werk werden drie AECM eiwitten met succes gekloond in de pET22b (+) e...

Discussie

Recombinant eiwit engineering is een veelzijdige techniek om nieuwe proteïne materialen met behulp van een bottom-up aanpak te creëren. De op eiwit gebaseerde materialen kunnen worden ontworpen om meerdere functionaliteiten, afgestemd op de toepassing van belang. Door de toenemende vooruitgang in kloneren en eiwitexpressie technologieën is het relatief eenvoudige (en kosteneffectieve) wordt een aantal kunstmatige eiwitten creëren op een reproduceerbare en schaalbaar. Het elastine-achtige domein is opgenomen in een aanta...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expressievectoren met resistentie tegen ampicilline
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	extra antibiotica - chlooramfenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stockoplossing met geautoclaveerd water, maak vers voor inductie.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmide isolatiekit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicilline	Affymetrix	11259
Chloramfenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA herstelkit	Zymo Research	D4001
XL10-gold stam	Agilent Technologies	200315