Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Multiciliated ependymale cellen lijn de ventrikels in de volwassen hersenen. Abnormale functie of structuur van ependymale cilia wordt geassocieerd met verschillende neurologische stoornissen. De huidige ex vivo voor live beeldvorming van beweeglijke ependymale cilia techniek maakt het mogelijk om een gedetailleerde studie van ciliaire dynamiek na verschillende stappen. Deze stappen omvatten: muizen euthanasie met kooldioxide volgens de protocollen van de Universiteit van Toledo Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC); craniectomy gevolgd door de hersenen te verwijderen en sagittale hersenen dissectie met een vibratome of scherp mes om zeer dunne secties te verkrijgen door de hersenen laterale ventrikels, waar de ependymale cilia kunnen worden gevisualiseerd. Incubatie van plakjes van de hersenen in een aangepaste glazen bodemplaat bevattende Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) / hoog-glucose bij 37 ° C in aanwezigheid van 95% / 5% O 2 / CO 2 mengsel is essentieel voor het weefsel in leven gedurendehet experiment. Een video van de trilharen kloppend wordt vervolgens opgenomen met een hoge resolutie differentiële interferentie contrast microscoop. De video wordt vervolgens geanalyseerd frame voor frame aan de ciliaire kloppend frequentie te berekenen. Dit maakt aparte indeling van de ependymale cellen in drie categorieën of types op basis van hun ciliaire kloppend frequentie en de hoek. Bovendien is deze techniek maakt gebruik van high-speed fluorescentiebeeldvorming analyse om de unieke intracellulaire calcium oscillatie eigenschappen van ependymale cellen en het effect van farmacologische middelen op calcium oscillaties en de ciliaire slaan frequentie karakteriseren. Bovendien is deze techniek geschikt voor immunofluorescentie beeldvorming voor ciliaire structuur en ciliaire eiwit lokalisatie studies. Dit is vooral belangrijk bij de diagnose van ziekte en fenotype studies. De grootste beperking van deze techniek is toegeschreven aan de vermindering van levende beweeglijke cilia beweging als het hersenweefsel begint te sterven.
Inleiding
Trilharen sensorische microtubule gebaseerde organellen die zich uitstrekken van het celoppervlak naar de extracellulaire omgeving. Afhankelijk van de microtubuli organisatie kan cilia worden onderverdeeld in twee types - "9 + 0" of "9 + 2". Functioneel, op basis van hun beweeglijkheid, kunnen deze worden beschouwd als beweeglijk of onbeweeglijk cilia 1. Primaire cilia is een term die vaak gebruikt om aan te geven "9 + 0" niet-beweeglijke trilharen. Deze negen parallel doublet microtubules (aangeduid met "9") en een centraal paar microtubuli ontbreekt in de centrale schacht (aangeduid met "0"). Echter, sommige "9 + 0" cilia, zoals nodale cilia, die embryo ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures voor het gebruik van dieren werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Toledo goedgekeurd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de National Institutes of Health en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Brain Extraction, Sectioning en Tissue Voorbereiding
- Sacrifice wild-type muis stam C57BL / 6 door diep euthanasie met CO 2 stikken voor 5 min. Verzeker dood door cervicale dislocatie.
- Maak de muis hoofd met 70% ethanol.
- Voer craniectomy met steriele schaar en pincet ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Meten ependymale cilia functie in levende muis hersenen
De werkwijze beschreven in dit protocol wordt gebruikt om ependymale cilia en structuur in het verse weefsel losgesneden van muizenhersenen en te controleren en te bestuderen cilia slaan frequentie luisteren. De stappen gevolgd om volledig experiment bereiken afgebeeld op schematische stroomdiagram (figuur 1). Het wordt sterk aanbevolen dat het experiment wordt uitgevoerd binnen een kort tijdsbestek om de beweeglijke ci.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven is een protocol voor de voorbereiding van de muis hersenweefsel voor zowel live beeldvorming en fluorescentiemicroscopie dat een snelle en gevoelige nauwe observatie van de ependymale cilia biedt in de hersenen ventrikels. Deze techniek is niet beperkt tot de laterale ventrikel; het kan worden gebruikt om de cilia andere hersenventrikels observeren. Deze beeldvormende techniek zorgt voor een live stream, dat de beweging van de CSF door ciliaire kloppend lijkt in een ex vivo setting. Bovendien ma.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Charisse Montgomery bedanken voor haar redactionele diensten. Het werk van A. Alomran voldoet gedeeltelijk aan de vereisten voor een masterdiploma in farmacologie. Dit werk wordt gefinancierd door het intramural start-upfonds van The University of Toledo voor W.A.A en een NIH-subsidie (DK080640) voor S.M.N.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Montage Medium met DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antilichaam | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-muis antilichaam | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Cultuur plaat | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Dekglas (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Omgekeerde Fluorescerende Microscoop | Nikon | Nikon TE2000 | 60X olie |
| Microscoop dekglaas 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Montage Medium met DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter kubus | Chroma Technology |
Referenties
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
