Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Multiciliated ependymale cellen lijn de ventrikels in de volwassen hersenen. Abnormale functie of structuur van ependymale cilia wordt geassocieerd met verschillende neurologische stoornissen. De huidige ex vivo voor live beeldvorming van beweeglijke ependymale cilia techniek maakt het mogelijk om een gedetailleerde studie van ciliaire dynamiek na verschillende stappen. Deze stappen omvatten: muizen euthanasie met kooldioxide volgens de protocollen van de Universiteit van Toledo Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC); craniectomy gevolgd door de hersenen te verwijderen en sagittale hersenen dissectie met een vibratome of scherp mes om zeer dunne secties te verkrijgen door de hersenen laterale ventrikels, waar de ependymale cilia kunnen worden gevisualiseerd. Incubatie van plakjes van de hersenen in een aangepaste glazen bodemplaat bevattende Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) / hoog-glucose bij 37 ° C in aanwezigheid van 95% / 5% O 2 / CO 2 mengsel is essentieel voor het weefsel in leven gedurendehet experiment. Een video van de trilharen kloppend wordt vervolgens opgenomen met een hoge resolutie differentiële interferentie contrast microscoop. De video wordt vervolgens geanalyseerd frame voor frame aan de ciliaire kloppend frequentie te berekenen. Dit maakt aparte indeling van de ependymale cellen in drie categorieën of types op basis van hun ciliaire kloppend frequentie en de hoek. Bovendien is deze techniek maakt gebruik van high-speed fluorescentiebeeldvorming analyse om de unieke intracellulaire calcium oscillatie eigenschappen van ependymale cellen en het effect van farmacologische middelen op calcium oscillaties en de ciliaire slaan frequentie karakteriseren. Bovendien is deze techniek geschikt voor immunofluorescentie beeldvorming voor ciliaire structuur en ciliaire eiwit lokalisatie studies. Dit is vooral belangrijk bij de diagnose van ziekte en fenotype studies. De grootste beperking van deze techniek is toegeschreven aan de vermindering van levende beweeglijke cilia beweging als het hersenweefsel begint te sterven.
Inleiding
Trilharen sensorische microtubule gebaseerde organellen die zich uitstrekken van het celoppervlak naar de extracellulaire omgeving. Afhankelijk van de microtubuli organisatie kan cilia worden onderverdeeld in twee types - "9 + 0" of "9 + 2". Functioneel, op basis van hun beweeglijkheid, kunnen deze worden beschouwd als beweeglijk of onbeweeglijk cilia 1. Primaire cilia is een term die vaak gebruikt om aan te geven "9 + 0" niet-beweeglijke trilharen. Deze negen parallel doublet microtubules (aangeduid met "9") en een centraal paar microtubuli ontbreekt in de centrale schacht (aangeduid met "0"). Echter, sommige "9 + 0" cilia, zoals nodale cilia, die embryo lateralisatie reguleren zijn beweeglijk 2. Anderzijds zijn beweeglijke cilia kenmerk, naast de negen parallelle microtubule doubletten, met een bijkomend centraal paar microtubuli doubletten en onderworpen aan dynein motoreiwitten motiliteit vergemakkelijken. Bovendien hebben sommige "92 "cilia zoals olfactorische cilia onbeweeglijk 3. Ependymale cellen die de hersenen ventrikels en het centrale kanaal van het ruggenmerg gekenmerkt door beweeglijke trilharen de cerebrospinale vloeistof (CSF) langs de hersenen ventrikels 4 voortbewegen.
Het algemene doel van deze methode is om te vergemakkelijken het bestuderen van de beweeglijke trilharen dynamiek en structurele afwijkingen. Gezondheid en ontwikkeling van de hersenen sterk afhankelijk van een efficiënte verspreiding van CSF in de hersenen ventrikels. Bijvoorbeeld, normale CSF stroming vochtbalans vereisen normaal kloppen en functionele ependymale cilia 5,6, wat weer spelen cruciale rol bij het reguleren van de gerichte beweging van neuronale cellen en stamcellen celmigratie 7. Als zodanig abnormale ependymale cilia functie of structuur kan leiden tot abnormale liquorcirculatie, die wordt geassocieerd met hydrocephalus, een medische aandoening waarbij er een abnormale ophoping van CSF in de ventrikels van de bregen. Dit kan dus leiden tot verhoogde intracraniële druk en progressieve uitbreiding van het hoofd, stuiptrekkingen, tunnelvisie en mentale handicap 8.
Het voordeel van deze techniek boven bestaande werkwijzen is dat het toegestaan voor het eerst drie verschillende ependymale celtypes bericht: I, II en III op basis van hun unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan. Deze ependymale cellen zijn gelokaliseerd in bepaalde gebieden in de hersenen ventrikels. Bovendien kunnen de effecten van leeftijd en farmacologische middelen zoals alcohol en cilostazol op het veranderen van de ependymale celtypen of de lokalisaties aangetoond, die voorheen niet mogelijk deze classificatie van ependymale cellen. Cilostazool is een remmer van fosfodiesterase-3, een enzym dat cAMP metaboliseert AMP en regelt tevens intracellulair calcium 9. Met behulp van high-speed fluorescentiebeeldvorming analyse maakt beeldvorming en kwantificeren van de unieke intracellulairecalcium oscillatie eigenschappen van de ependymale cellen. Bijvoorbeeld, zowel alcohol als cilostazool significant de ependymale ciliaire kloppende frequentie en de intracellulaire calcium oscillaties eigenschappen, wat weer kan leiden tot een verandering in de cerebrospinale vloeistof volume vervanging door ependymale cilia 10 veranderd. Kortom, deze techniek was de sleutel tot het eerste bewijs van drie verschillende types van ependymale cellen met verschillende calcium oscillatie eigenschappen.
In het volgende hoofdstuk wordt een gedetailleerde stap-voor-stap overzicht van de procedure, met veel aandacht voor het prepareren van weefsels en handling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures voor het gebruik van dieren werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Toledo goedgekeurd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de National Institutes of Health en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Brain Extraction, Sectioning en Tissue Voorbereiding
- Sacrifice wild-type muis stam C57BL / 6 door diep euthanasie met CO 2 stikken voor 5 min. Verzeker dood door cervicale dislocatie.
- Maak de muis hoofd met 70% ethanol.
- Voer craniectomy met steriele schaar en pincet door eerst trekken de huid af, te beginnen met de bovenkant van het hoofd om de schedel bloot te leggen.
- Dan, wanneer de schedel bloot, verwijdert de schedel door het afpellen het beenstuk per stuk, uitgaande van het achterste kant en verplaatsen naar de voorste zijde. Wees voorzichtig niet naar de hersenen ventrikels vernietigen.
- Verzamel de hele hersenen.
- Plaats de hersenen in een 100 mm petrischaal met DMEM / hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine-oplossing die 10.000 eenheden / ml penicilline en 10000 ug / ml streptomycine en voorverwarmd tot 37 ° C.
- Snijd de hersenen op de mediane sagittale vlak met de hand met een scherp mes, en de eerste 100-200 mm doorsnede van elke helft met een vibratome verkrijgen.
- Spoel het hersenweefsel met voorverwarmd 37 ° C fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) oplossing.
- Het onmiddellijk plaatsen hersenpreparaat in DMEM / High-glucose media voorverwarmd tot 37 ° C.
2. Live-Imaging Configuratie en instellingen
- Plaats het hersenweefsel secties 30 mm glazen bodem kweekschalen met 1 ml DMEM / hoge-glucose media. Stel de microscoop gesloten kamer omgeving 37 ° C, 95% / 5% O 2 / CO 2 gehalte (figuur 1 ).
- Met behulp van een 60X objectief olie-immersie lens, het verzamelen van de ependymale cellen / cilia beelden door eerst een olie druppel op de 60X objectief en zich te concentreren op de cellen met regelmatige DIC doorgelaten licht.
- Volg dan de richting van de DMEM bubble beweging als een leidraad voor de locatie van de beweeglijke ependymale cilia als ciliary afranselingen creëren een soort zeepbel beweging in het gebied. Kies een gebied met gezonde cellen met beweeglijke cilia in de hersenen van de laterale ventrikel met behulp van de DIC filter. Zodra de ependymale cilia zijn gevonden, pas het licht en focus om een bevredigend resultaat krijgt.
- De Directe imaging parameters volgens een specifiek doel behulp Metamorph beeldverwerkingssoftware. In de huidige demonstratie verwerven vierentwintig-bits afbeeldingen met de camera binning ingesteld op 1 x 1 in combinatie met 60X objectieve en 5-10 msec belichtingstijd.
- Verzamel de DIC beelden van het oog tot een minimum exp hebben openen van de microscoop opening tot een optimaalComposure tijd. Observeer live beelden streamen naar de camera snel en onmiddellijke beeldacquisitie leveren zonder vertraging. Bereken de snelheid van cilia slaan op basis van het vereiste van de minimale blootstellingstijden onvoldoende beeldcontrast te verkrijgen.
3. Data Visualization en Analyse
- Bereken het aantal trilharen afranselingen door het tellen van het aantal slagen in 1 min. Doe dit door het verlagen van de snelheid van het beeld en het tellen van het aantal slagen met een celteller of iets dergelijks.
- Om de frequentie van de slagen Vermenigvuldig de belichtingstijd waarin de video wordt opgenomen door het aantal frames of time-lapse beelden die het aantal seconden krijgen. (Voorbeeld: belichtingstijd 5 msec 200 frames = 1000 msec of 1 sec).
- Bereken het aantal slagen in één seconde op de frequentie die wordt uitgedrukt als het aantal verslagen per één seconde te verkrijgen. Doe dit door het delen van het aantal cilia slagen meer dan een one-tweede keer interval (Voorbeeld: cilia slaat 50 keer in een 200 frames video opgenomen met belichtingstijd van 5 msec ie 5 msec x 200 frames = 1 seconde; nu verdelen 50 slagen per 1 sec = 50 Hz).
- Bereken de ciliaire kloppend hoek door het evalueren van de weg die door de ependymale cilia tijdens zowel de kracht en het herstel beroertes. Voer deze volgens een eerder beschreven werkwijze, met kleine modificaties 11. De precieze beweging van de individuele cilia wordt waargenomen tijdens de volledige slag cyclus.
- Op een acetaat vel geplaatst over de monitor, trek een horizontale lijn langs de ependymale rand en een verticale lijn door de middellijn positie van de trilharen in het begin van de macht beroerte.
- Plot de precieze positie van het cilium frame per frame als het beweegt naar voren tijdens de arbeidsslag. Op soortgelijke wijze plot de beweging van de trilharen in de herstel slag.
- Bereken de ciliaire kloppende hoek van de maximale afwijking van de cilium van de middellijn in tHij macht beroerte, evenals het herstel beroerte.
4. Calcium Signal Recording
- Na het doorsnijden van de hersenen, even uitspoelen hersenen slice met 1x PBS of Dulbecco's PBS (pH 7,0). Bereid vers Fluo-2 fluorescentie quenching voorkomen en een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
- Bereid 1 mM voorraadoplossing van Fluo-2-oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO), meng en vortex de oplossing gedurende ten minste 5 minuten zodat Fluo-2 homogeen opgelost in DMSO.
- Verdun de Fluo-2 voorraadoplossing in 500 ml DMEM / hoog glucosegehalte aangevuld met 2% B27 voorverwarmd tot 37 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg / ml.
OPMERKING: B-27 is een geoptimaliseerde serumvrij supplement met vitamine A, antioxidant cocktail en insuline gebruikt korte- of lange-termijn overleving van de hippocampus en andere CZS-neuronen te ondersteunen. - Onmiddellijk incubeer de hersenen segment met 20 mg / ml Fluo-2 gedurende 30 min bij 37 ° C in een glazen bodemplaat.
- Om de optimale belading calciumconcentratie fluorofoor Fluo-2 te bepalen en calcium kleurstof cel toxiciteit, challenge cellen met ATP te vermijden, en controleer de cellevensvatbaarheid door het bepalen van het tijdsverloop en de piekwaarde van calciumsignalen in reactie op ATP.
- Noteer de video calcium oscillatie bij een opnamesnelheid van 5 msec gedurende minstens 1 seconde (200 frames per seconde), met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 515 nm respectievelijk (Film 2).
- Om de Fluo-2 calcium signaal van autofluorescentie of beweging artefacten te onderscheiden, ervoor zorgen dat de intensiteiten uitgezonden bij 515 nm afzonderlijk wordt gecontroleerd.
OPMERKING: Fluo-2 niet de calcium fluoremetric geschikte intracellulaire calcium kwantificeren. Het is echter een uitstekend dynamisch calcium kleurstof snel calcium verandert, zoals calcium oscillaties te detecteren. Voor nauwkeurigere calcium kwantificering, Fura-2 aanbevolen. De dynamische veranderingen van Fura-2 wordt beperkt door de ratiometrischeaard van de kleurstof. - Volg de formules van de fabrikant naar de exacte intracellulaire calcium te berekenen. Voorbeeld [Ca2 +] = K x d (R - R min) / (Rmax - R). Waar Kd de dissociatieconstante van de kleurstof uit de vrijgegeven calcium, R de gemeten fluorescentie bij 488 en Rmin en Rmax zijn het fluorescentie verhoudingen bij minimale en maximale ionenconcentratie 12.
5. immunofluorescentiemicroscopie
- Bevestig de hersencoupes met fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 4% paraformaldehyde (PFA) en 2% sucrose gedurende 10 min. Als alternatief, bevestig de hele hersenen met 4% PFA en vervolgens sectie in 50 mm delen met behulp van een cryostaat.
- Was het weefsel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen slice met een solution van 0,1% Triton-X in 1x PBS gedurende 5 minuten en spoel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen segment met muis primair antilichaam, antiacetylated a-tubuline, gebruikt bij een verdunning van 1: 5000 in 10% FBS in 1x PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur (KT) of overnacht bij 4 ° C.
- Was het weefsel driemaal met 1x PBS gedurende 5 min per keer.
- Incubeer de hersenen slice in secundair antilichaam, fluoresceïne anti-muis-IgG bij een verdunning van 1: 500 in 10% FBS in 1x PBS oplossing gedurende 1 uur bij KT.
- Voordat observatie onder een fluorescentiemicroscoop, tegenkleuring het gedeelte met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 5 min naar de nucleus (of DNA) 13 bevlekken. Om fotobleken, imago van de secties onmiddellijk te minimaliseren met een minimale blootstelling mogelijke tijd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Meten ependymale cilia functie in levende muis hersenen
De werkwijze beschreven in dit protocol wordt gebruikt om ependymale cilia en structuur in het verse weefsel losgesneden van muizenhersenen en te controleren en te bestuderen cilia slaan frequentie luisteren. De stappen gevolgd om volledig experiment bereiken afgebeeld op schematische stroomdiagram (figuur 1). Het wordt sterk aanbevolen dat het experiment wordt uitgevoerd binnen een kort tijdsbestek om de beweeglijke ci...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschreven is een protocol voor de voorbereiding van de muis hersenweefsel voor zowel live beeldvorming en fluorescentiemicroscopie dat een snelle en gevoelige nauwe observatie van de ependymale cilia biedt in de hersenen ventrikels. Deze techniek is niet beperkt tot de laterale ventrikel; het kan worden gebruikt om de cilia andere hersenventrikels observeren. Deze beeldvormende techniek zorgt voor een live stream, dat de beweging van de CSF door ciliaire kloppend lijkt in een ex vivo setting. Bovendien ma...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Charisse Montgomery bedanken voor haar redactionele diensten. Het werk van A. Alomran voldoet gedeeltelijk aan de vereisten voor een masterdiploma in farmacologie. Dit werk wordt gefinancierd door het intramural start-upfonds van The University of Toledo voor W.A.A en een NIH-subsidie (DK080640) voor S.M.N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Montage Medium met DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antilichaam | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-muis antilichaam | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Cultuur plaat | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Dekglas (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Omgekeerde Fluorescerende Microscoop | Nikon | Nikon TE2000 | 60X olie |
| Microscoop dekglaas 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Montage Medium met DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter kubus | Chroma Technology |
Referenties
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476(2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
