Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand kan worden uitgeschakeld in discrete hersengebieden terwijl ratten bezig zijn met leren en geheugentaken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedragsparadigma (zintuiglijke voorconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen verschillende componenten van leren.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand zwijgen in discrete hersengebieden terwijl dieren zijn betrokken bij leren en geheugen taken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-receptoren-Uitsluitend-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedrags-paradigma (zintuiglijke preconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van leren. Specifiek wordt viraal-bemiddelde aflevering gebruikt om een ​​genetisch gemodificeerde remmend G-proteïne gekoppelde receptor (de ontwerpers receptor) in een afzonderlijk gebied van de hersenen bij knaagdieren tot expressie. Drie weken later, wanneer ontwerper receptor expressieniveaus zijn hoog, een farmacologisch middel (de ontwerpers Drug) wordt systemisch toegediend 30 min vóór een bepaalde gedrags-sessie. Het geneesmiddel heeft affiniteit voor de ontwerper receptor en dus resulteert in remming van neuronen die de ontwerper receptor tot expressie maar anderszins biologisch inert. De hersenen regio blijft zwijgen voor 2-5 uur (afhankeding van de dosis en wijze van toediening). Na voltooiing van de gedrags- paradigma wordt hersenweefsel beoordeeld op correcte plaatsing en receptor expressie. Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bepalen van de bijdrage van afzonderlijke hersengebieden bepaalde onderdelen van gedrag en kan worden gebruikt in willekeurig aantal gedragsparadigma's.

Inleiding

Een uitdaging op het gebied van Behavioral Neuroscience is het neurale substraat van complexe gedrag te bepalen. Een aantal technieken zoals permanente laesies, tijdelijke inactivering hersenen via canules implantaten en optogenetics zijn gebruikt om de bijdrage van discrete hersengebieden identificeren subcomponenten van complexe gedragingen. Hoewel deze benaderingen te informeren ons begrip van regionale specificiteit tijdens het leren, elke techniek is niet zonder beperkingen. Specifiek worden permanent laesies gewoonlijk uitgevoerd vóór gedragstesten, waardoor het effect gedurende de duur van het paradigma aanwezig. Canulatie studies dat de presentatie van een korte-termijn neurale inactivator (bijv tetrodotoxin) te betrekken kan aanzienlijke schade aan hersenweefsel te produceren en kan stress in proefpersonen vlak voor gedrags testen induceren. Verder wordt inactivering door middel canulatie beperkt tot het gebied van weefsel dat rond detopje van de canules. Tot slot, terwijl optogenetics biedt een scala van flexibiliteit voor de tijdelijke controle van de activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, het is onbetaalbaar en technisch veeleisend.

Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van een farmacogenetische aanpak (Designer-receptoren Uitsluitend-Activated-by-Ontwerper-Drugs, DREADDs) ^1,2. Belangrijk, terwijl het begrip farmacogenetica is verfijnd, de uitvoering van de techniek is eenvoudig. Vergelijkbaar met traditionele stereotaxische chirurgische methoden die infusie toxine (bijvoorbeeld NMDA, iboteenzuur) in discrete hersengebieden omvat deze techniek infusie een adeno-geassocieerd virus (AAV), die een DNA-fragment dat voor een gemodificeerd remmend G-proteïne gekoppelde receptor bevat betrekken (hM4Di, de ontwerper receptor) in het interessegebied van standaard laboratorium knaagdieren (zie figuur 1). De virale vector bevat ook een fluorescerende reporter (mcitrine). Eenmaal opgenomen incellen, worden de designer receptor (en reporter proteïne) maximaal tot expressie ~ 3 weken na infusie en kan selectief worden geactiveerd voor 2-5 uur met de systemische toediening van de anderszins biologisch inert ontwerperdrug, clozapine-N-oxide (CNO) ^{1 , 3.} Omdat de experimentator is begiftigd met precieze, maar remote temporele controle over de neurale activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, farmacogenetica combineert bijzonder goed met gedragsproblemen paradigma's die worden uitgevoerd in meerdere fasen. In dit voorbeeld is de bijdrage van de retrospleniale cortex (RSC) naar stimulus stimulus learning vergeleken met zijn rol in Pavlov leren evenwel deze combinatie van benaderingen is zeer geschikt om een ​​aantal vragen die proberen te bepalen hoe specifieke hersengebieden bijdragen aan complex gedrag.

Bovendien, terwijl in het onderhavige protocol beschreven, virale en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om type-specifieke cel DREADD expressie ² bereiken. Zoals iks inherent aan gedragsparadigma's die farmacologische en / of andere vormen van experimentele manipulaties, zorgvuldige afweging van proefopzet en daaropvolgende kwantitatieve bepalingsmethoden kunnen nodig bij gebruik van de DREADD benadering. Onderzoekers nieuw voor de DREADD benadering worden verwezen naar een uitgebreid overzicht van de huidige DREADD technologie ^2.

Dagelijks organismen informatie over nieuwe impulsen en gebeurtenissen en hun onderlinge relaties. Zelfs in een vertrouwde omgeving, zoals thuis, men snel veranderingen detecteren in de relatie tussen stimuli, die veranderingen voorspellende betekenisvolle gebeurtenissen zijn. Dergelijke stimulus-stimulus (ie, relationeel) leren betreft de samenvoegende van meerdere stimuli en is van oudsher geassocieerd met de hippocampus, die centraal woont binnen de mediale temporale kwab ^4. Echter, de hippocampus niet bestaat of geïsoleerd optreden; corticale gebieden, zowel binnen als buitenkant van de mediale temporale kwab bieden kritische zintuiglijke informatie naar de hippocampus formatie ^5-7. Traditionele permanent letsel studies dwingend bewijs voor de betrokkenheid van een aantal corticale gebieden (bijvoorbeeld de retrospleniale, postrhinal en entorhinale cortex) in hippocampus-afhankelijk leren, maar zijn beperkt in hun vermogen om de functie van een bepaald gebied te onderscheiden in afzonderlijke fasen leren ^8-10.

Het onderhavige protocol test de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor stimulus-stimulus leren door silencing de RSC tijdens een fase van een 3-fasen sensorische preconditionering paradigma ^11,12. In het kort, ratten infusies krijgen van een AAV dat de ontwerper receptor bevat en ~ 3 weken later toegediend de ontwerperdrug (CNO) 30 minuten voor aanvang van gedragsonderzoek. In het huidige protocol, experimentele ratten ontvangt CNO tijdens de eerste fase van het testen (als stimulus-stimulus learning optreedt) en ze het voertuig ontvangt gedurende de volgende 2 fasen van het testen. Om te controleren voor onbedoelde effecten van CNO op het gedrag, bezielen ratten met de ontwerper receptor (hM4Di) en injecteren met het voertuig in plaats van CNO. Om rekening te houden algemene gevolgen van virale infusie en receptor expressie, trekken een controlevirus dat de ontwerper receptor bevat en beheren CNO.

Een aantal verschillende serotypen van AAV worden gebruikt om genetisch materiaal. De huidige NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant of synthetische moleculen stelt dat AAV (alle serotypes) en recombinant of synthetische AAV constructen, waarbij het transgen niet of potentieel tumorigene genproduct of een toxine molecuul coderen en worden geproduceerd in afwezigheid van een helper virus, vereisen BSL-1 voorzorgsmaatregelen (Bijlage B-1. Risk Group 1 (RG1) gemachtigden) ^13. Een aantal beoordelingen met betrekking tot de AAV structuur, het nut en de veiligheid zijn beschikbaar ^14,15. Opmerkelijk is dat de, Als gevolg van bezorgdheid met betrekking tot mogelijke reproductie ^16,17 potentiële carcinogene mechanismen ^18-20 in knaagdieren, sommige instellingen vereisen het gebruik van BSL-2 bij het ​​werken met AAV. Controleer de juiste BSL voor gebruik door overleg met de commissies van toezicht op individuele instellingen waar het onderzoek zal worden uitgevoerd, de Centers for Disease Control en de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA-moleculen ¹³ bij het ​​gebruik van virale vectoren voor genetische manipulatie in de Verenigde Staten. Persoonlijke bescherming, onderzoeker opleiding, vector insluiting, ontsmetting, de verwijdering van ontsmet materialen, en post-injectie dierverblijven eisen worden gespecificeerd door deze richtlijnen. Bovendien, raadplegen en geschikte Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen comité of gelijkwaardige richtlijnen institutionele commissie van toezicht op de veilige behandeling, het beheer en de verwijdering van AAV waarborgen.

Protocol

Het gebruik van dieren worden goedgekeurd door het Oberlin College Institutional Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren ^21.

1. Voorbereiding voor Virale Infusion

Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van BSL-1 voorzorgsmaatregelen. Bij toepassing van BSL-2 voorzorgsmaatregelen, een wegwerp laboratoriumjas, handschoenen, schoenen covers, oog bescherming en een stofmasker (type N95) zijn verplicht. Alle individuen omgaan met BSL-2 verbindingen moeten passen getest voor een stofmasker door een lokale volksgezondheid agentschap. Raadpleeg Lowery & Majewska (2010) ²² voor meer informatie over de behandeling en opslag van virale vectoren.

1. Bij het eerste gebruik, hoeveelheid en op te slaan ongebruikte virus in 20 ul microcentrifugebuizen herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden.
2. Bereid het werkoppervlak van onnodige voorwerpen verwijderen en steriliseren van het oppervlak met 70% ethanol. Bereid een 10% bleekwater oplossing voor het reinigen van AAV afval. Plaats een beker vol van de bleekwater oplossing en een steriele 10 ul injectiespuit op het werkvlak. Plaats de microcentrifugebuis met de AAV in een container met crushed ijs tijdens set-up.
3. Plaats de microcentrifugebuis met het virus in een standaard bankschroef. Laad een 10 gl spuit met tenminste 4 pl AAV. Let erop dat de punt van de spuit tegen de onderzijde van de microcentrifugebuis buigen tijdens het laden. Zorg dat er geen luchtbellen in de 4 gl AAV oplossing in de injectiespuit.
4. Gooi de lege virus buis in de beker met 10% bleekmiddel. Bewaar ongebruikte delen van het virus, zoals gespecificeerd door de leverancier.
5. Voeg extra 10% bleekwater naar de afvalcontainer, en laat afval te zitten voor 30 min voor het weggooien van de ontsmet vloeibaar afval.
6. Gooi alle beschermingsmiddelen en plastic afval in een biohazard container in opdracht van institutionele richtlijnen. Decontaminate alle apparatuur en oppervlakken die in contact komen met het virus middels 10% bleekwater kwam.

2. Chirurgie

1. Bereid de chirurgische gebied door het plaatsen van absorberend bankje papier onder de stereotaxische apparaat en op een aangrenzende ruimte aangewezen als een speciale virus handling gebied.
   1. Plaats een 10% bleekmiddel afvalcontainer in de speciale virus handling in de buurt van de chirurgische apparatuur.
2. Leiden tot een stabiel niveau van de anesthesie en de voorbereiding van de rat voor een operatie.
   1. Plaats de rat in een inductiekamer met een mengsel van isofluraan gas (traject van 1-3%) en zuurstof (100% bij ongeveer 1 l / min) bevat totdat er een verlies van bewustzijn en gebrek aan grove doelgerichte beweging. Handhaaf isofluraan anesthesie gedurende de chirurgische procedure.
   2. Na 6 diepe narcose is bereikt, scheren de rat van tussen de ogen om iets achter de oren.
   3. Plaats de rat weer in de inductie kamer voor eenAanvullende 1-3 min.
   4. Controleer of de isofluraan anesthesie is aangesloten op de neuskegel van de stereotaxische chirurgie. Open de plugkraan op de isofluraan buis om de stroom van isofluraan de stereotax beginnen. Handhaving van de isofluraan en zuurstof op het hierboven aangegeven niveau.
   5. Plaats de rat in een stereotaxische apparaat door het veiligstellen van de mond naar de beet bar en het veiligstellen van het oor bars.
   6. Breng oogzalf voor de ogen en betadine op de chirurgische lokatie vóór incisie.
3. Wordt 2,4 cm middellijn incisie van de huid op het dorsale oppervlak van de schedel vanaf ongeveer 2 mm caudaal van de ogen. Trek de huid aan de schedel bloot te leggen. Periodiek inboezemen steriele 0,9% steriele zoutoplossing in de marge van de chirurgische site om weefsel van uitdroging te voorkomen.
4. Clear membraneuze weefsel van de schedel tot bregma en lambda zijn duidelijk zichtbaar.
5. Zorg ervoor dat de schedel is niveau door het meten van de dorsale-ventrale coördinaten opbregma en lambda. Stel het stereotaxische apparaat dienovereenkomstig tot dorsale-ventrale coordinaten bregma en lambda verschillen niet meer dan 0,04 mm.
6. Op dit moment beperken de isofluraan gas tussen 2 en 2,5%.
7. Zet de boormachine aan bregma, ReZero de coördinaten en verplaats de boor op de gewenste mediale-laterale en de voorste-achterste coördineren.
8. Boor een gat in het coördineren van het gebruik van een 0,9 mm boor als het produceert een passende omvang gat voor een 28 G infuus spuit.
9. Stel de infusiepomp tegen virus te leveren met een snelheid van 0,2 ul / min. Plaats de injectiespuit in de arm infusie van het stereotaxische apparaat en laat de spuit in de gewenste coördinatie. Levert de gewenste hoeveelheid virus (spreiding 0,1-0,8 pl). Zo levert 0,8 gl AAV dan 4 min.
   Opmerking: voeren proefonderzoeken het ideale infusievolume en de typische verspreiding van virus in elk gebied van belang te bepalen.
   1. Na levering van virus complete laat de spuit in de plaats voor 10 min om terugstromen in de naald-darmkanaal te voorkomen. Langzaam verhogen van de spuit met een snelheid van ongeveer 5 mm / min. Herhaal dit tot alle coördinaten zijn doordrenkt met AAV.
10. Sluit de wond met chirurgische nietjes en de vacht van de wond met actuele antibiotische zalf.
11. Volg de institutionele richtlijnen voor postoperatieve pijnbestrijding.
12. Plaats de rat in een kooi met beddengoed, een deksel en een goede bewegwijzering en de terugkeer van de rat om het dier faciliteit.
    1. Als het werken onder BSL-2 voorzorgsmaatregelen, verzamel beddengoed voor de hoeveelheid tijd (meestal 48-72 uur) die door institutionele richtlijnen. Plaats beddengoed in een biologisch gevaarlijk afval container.
    2. Gooi alle AAV-verontreinigde materialen zoals gespecificeerd door richtlijnen voor veilige verwijdering.

3. Behavioral Apparatuur

Opmerking: De sensorische preconditionering apparaat bestaat uit een standaard operante conditionering chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) met een roestvrij stalen rooster vloer, 2 Plexiglas zijwanden en 2 metalen wanden.

1. Monteer een 2,8 W licht op een van de aluminium wanden om te dienen als het huis licht en de visuele stimulus toen flitste op 2 Hz. Monteer een luidspreker op de kamer naar de auditieve stimuli te leveren (10 sec, 1500 Hz, 78 dB zuivere toon en een 10 sec 78 dB witte ruis).
   1. Gebruik een voedsel hopper tot 45 mg voedsel pellets leveren in het voedsel beker. Binnen het voedsel kopje, infrarood fotocellen de totale tijdsduur in het voedsel kopje vóór, tijdens en na presentatie van stimuli en levensmiddelen punten.
   2. Het huis van de kamers in-geluiddempende kasten (22 "W x 22" H x 16 "D) uitgerust met afzuigventilatoren (~ 68 dB).
   3. Gebruik een PC computer met Med Associates software om de operante kamer van de gegevens te controleren en te verwerven. Tijdens de sessies Conditioning, data te verzamelen over de totale tijd doorgebracht met het hoofd in het voedsel beker tijdens presentatiestie van het licht stimulus (5 sec tijdperk) en tijdens de presentatie van het eten beloning (5 sec tijdperk). Tijdens de testsessie gegevens verzameld over de totale tijdsduur in de voedselkop in reactie op de presentatie van auditieve stimuli (10 sec epoch begin als de auditieve stimuli worden beëindigd).

4. Overzicht van de Sensory Voorconditionering Paradigm

1. Na herstel van de operatie geleidelijk voedsel beperken ratten 85% van het voedingssysteem lichaamsgewicht. Raadpleeg veterinaire personeel naar een geschikte voedsel beperking paradigma.
   Noot: De 3-fasen sensorische preconditionering paradigma is weergegeven in figuur 2.
2. Preconditionering Sessions (fase 1; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 4 opeenvolgende dagen):
   1. Present ratten met 12 vermengd proeven die bestaan ​​uit de levering van auditieve en visuele stimuli. Omvatten inter-proces intervallen die na elk een gemiddelde van 4,5 min (range 4,0-5,0 min)uditory presentatie.
   2. Op 6 van de proeven, het heden een toon (geconditioneerd stimulus) gedurende 10 sec, onmiddellijk gevolgd door een 5 sec presentatie van het knipperlicht stimulus.
   3. Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (ongepaard stimulus) alleen al voor 10 sec.
3. Conditioning sessies (fase 2; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 5 opeenvolgende dagen):
   1. Present ratten met 8 proeven die bestaan ​​uit de levering van de visuele stimulus (het knipperlicht stimulus) voor 5 sec onmiddellijk gevolgd door levering van twee 45 mg voedsel pellets. Omvatten inter-proces intervallen die gemiddeld 7 min (range 6,0-8,0 min) na elke proef. Af en ratten vereisen meer dan 5 conditioning sessies om het licht voedsel vereniging leren.
4. Test Session (fase 3, een enkele 78 min sessie):
   1. Presenteer de ratten met 12 vermengd proeven die bestaan ​​uit de levering van de auditieve stimuli alleen. Omvatten inter-proces intervallen die average 4,5 min (range 4,0-5,0 min) na elke auditieve presentatie.
   2. Op 6 van de proeven, presenteren de toon stimulus (de geconditioneerde stimulus) alleen al voor 10 sec.
   3. Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (de ongepaarde stimulus) alleen al voor 10 sec.
5. Tegenwicht de stimuli door het invullen van de studie met een tweede set van ratten die de witte ruis als geconditioneerd stimulus en de toon als het ongepaarde stimulans krijgen.

5. farmacologische en Behavioral Procedure

1. Schakel de stroom naar de gedrags-apparaat en laad de Med-PC-code voor de juiste gedrags-sessie. Draad en het programma van de behavioral apparaat zodanig dat de fans die op de geluiddempende kasten zijn gemonteerd ingeschakeld wanneer de stroom wordt ingeschakeld.
2. Een 1 mg / ml oplossing van clozapine N-oxide (CNO) te bereiden, weeg 5,0 mg CNO in een 15 ml conische buis en voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% saline. Vortex tot de oplossing helder is.
   1. Als CNO niet oplost in oplossing of meer geconcentreerde oplossingen van CNO gewenst voeg een oplosbaar makend middel zoals DMSO ^23. Specifiek, een 1 mg / ml oplossing van CNO bereiden met 0,5% DMSO Weeg 5,0 mg CNO en voeg 25 pl van DMSO tot een 15 ml conische buis. Flick voorzichtig waarborgen dat de inhoud blijven op de onderkant van de buis. Wanneer de oplossing helder, voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% zoutoplossing. Verdere instructies voor het bereiden van oplossingen van CNO zijn beschikbaar op de DREADD wiki resource pagina ^25.
   2. Bereid een nieuwe CNO oplossing elke dag dat het wordt toegediend.
3. Injecteer de CNO intraperitoneaal in een dosis van 1 mg / kg op ongeveer 30 minuten voor gedragstesten. Bijvoorbeeld Injecteer 200 g rat met 0,2 ml van de 1 mg / ml CNO oplossing. De dosis en tijdsverloop van CNO administratie werden geselecteerd op basis van eerder gepubliceerde rapporten ^2,12.
   1. Injecteer CNO 30 min voor elke preconditionering zitting (Fase 1, totaal 4 dagen na injectie) maar vóór het voertuig dienen aan alle volgende behavioral sessies.
4. Na 30 min, plaatst de ratten in de gedragstesten kamers en inleiding van de computercode voor het betreffende gedrags- sessie.
5. Na voltooiing van de gedragstaak, onmiddellijk de ratten uit de kamers en de terugkeer van de ratten aan het dier kolonie.

6. Analyses van Behavioral gegevens

Opmerking: De afhankelijke variabele voor gedrags sessies de tijdsduur dat het hoofd van de rat is in de voedselkop zoals gedetecteerd door onderbreking van de infrarode fotocellen in het voedselkop. De data (in sec) wordt verzameld en geregistreerd door de computer software.

1. Niet uit te voeren analyses over de gegevens die tijdens de conditioneringsfase.
2. Voor de conditionering sessies: analyseert elke ratten 'eenheid aan het licht voedsel vereniging leren door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de presentatie van de visuele stimulus over de 5 behavioral sessies. Specifiek, het berekenen van de gemiddelde tijd doorgebracht in het voedsel beker tijdens de 5 sec licht tijdperk voor elk van 8 proeven / sessie (dwz een gemiddelde van 8 proeven die elk 5 sec duur / rat). Vergelijk gemiddelde controle en experimentele waarden voor elk van de 5 dagelijkse sessies (zie figuur 3A).
   1. Analyseer de motivatie van de ratten 'om voedsel te belonen verkrijgen door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de levering van het voedsel beloning (5 sec tijdperk) over de 5 gedragstherapie sessies met behulp van dezelfde berekening als opgegeven voor de 5 sec licht tijdperk boven. Deze waarden zullen constant hoger dan die tijdens de presentatie van de visuele stimulus verworven (zie figuur 3B).
3. Voor de testsessie: berekenen discriminatie verhouding die voedsel kopje gedrag van de ratten 'beschrijft in reactie op de presentations van elke auditieve stimulus.
   1. Specifiek voor elke rat, verdeelt de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de sensorische geconditioneerde stimulus (dwz de toon) door de som van de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de zintuiglijke voorgeconditioneerde stimulus (ie, de toon stimulus) plus het gemiddelde van de totale tijd doorgebracht in het voedsel beker na elk van 6 presentaties van de ongepaarde stimulus (ie, de witte ruis stimulus). Elk tijdvak is 10 seconden duren.
      Opmerking: Een discriminatie score van 0,5 of hoger toont aan dat ratten leerden de verenigingen die inherent zijn aan het zintuiglijke preconditionering paradigma.

7. Verificatie van AAV Plaatsing en Expression

1. Verdoven en perfuseren de ratten transcardiaal met 4% paraformaldehyde. Door het gebruik van fluorescente labels, niet meer dan een post-fixatie periode van 2 uur tot minimize verlies van antigeniciteit en het fluorescentiesignaal te behouden.
2. Uitdrogen geperfuseerd hersenen door ze in hersenen pot met 30 ml van een 20% sucrose-oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x) gedurende minstens 2 dagen of totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de pot hersenen.
3. Gebruik een koude glijdende microtoom coronale hersensecties (20-40 urn) maken het gehele rostrocaudale omvang van het gebied van belang.
4. Voer immunohistochemie tegen de gemerkte receptor of reporter proteïne om de locatie en expressie van de ontwerper receptor en / of reporter ¹² bepalen. Een immunohistochemie kleuringsprotocol is voorzien op het DREADD wiki resource pagina ^25.
5. Monteer de onderdelen op SuperFrost-plus dia's en dekglaasje met 100-200 ul van een waterige montage medium.
6. Voer fluorescentiemicroscopie op hersenweefsel te AAV plaatsing en eiwitexpressie ^12,24 controleren.

Resultaten

Behavioral resultaten

Na voltooiing van het experiment, zou de doeltreffendheid van de regiospecifieke tijdelijke inactivatie kwantitatief en kwalitatief worden beoordeeld. Het onderhavige voorbeeld heeft betrekking op een 3-fasen behavioral paradigma (sensorische voorconditionering), waarbij CNO werd toegediend aan neurale activiteit in de RSC verzwakken Tijdens de voorbereiding heeft tot de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor de vorming van associaties tussen neutrale stimuli ¹²...

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe een farmacogenetische benadering (DREADD) zijn van toepassing om te onderzoeken hoe een specifieke regio hersenen draagt ​​bij aan een multi-fase complexe leertaak. Met de mogelijkheid om tijdelijke neurale activiteit op afstand zwijgen in discrete hersengebieden over leerfasen combinatie van deze benaderingen is een platform waarop een verschillende gedragingen, zoals meer genuanceerd of gemaskeerde vormen van leren onderzoeken. In de in dit protocol beschreven voorbeeld controle ratten en r...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old	Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine	Virus Vector Core		Let op: Dit is een BSL-1-verbinding
rAAV8/hSyn-GFP	Virus Vector Core		Let op: Dit is een BSL-1-verbinding
Clozapine-N-oxide	R&D Systems	4936-10	Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate)	Alternative Design	FT 8XL-PC	Wordt gebruikt om dierenkooien 48-72 uur na infusie te bedekken
Filter paper (vervanging)	Alternative Design	FP-R-1018XAD	Filterpapier dat bij kooideksels hoort
Tabelklem	JETS	2201-265	Voor het vasthouden van microscentrifugebuizen met AAV in de kap
Biogevaar afvalzakken	Staples	113444	Medline biogevaar lijnen
Biogevaar afvalbak	Amazon.com		United Solutions 34 gallon rechthoekige wielen vuilnisbak met haak en vergrendeling handvat
Isofluraan, 100 ml	Patterson Veterinary Supply Inc.	07-890-8540	Anesthesie
Dual kleine dier stereotaxische met digitale weergave console	David Kopf	Model 942	Chirurgische apparatuur
Niet-breuk oor bars, set van 2 (rat)	David Kopf	Model 955	Chirurgische apparatuur
Anesthesie masker (rat)	David Kopf	Model 906	Chirurgische apparatuur
Hoge snelheid stereotaxische boor omvat tafeltop motor controller, voetpedaal, handgreep, stereotaxische handgreep houder	David Kopf	Model 1474	Chirurgische apparatuur
Microdrill boorkoppen, 0,9 mm	Fine Science Tools Inc	19007-09	Chirurgische levering
Automatische spuitpomp met micro4 controller	David Kopf	Model UMP3-1	Chirurgische apparatuur
Pro-dier afneembare keramische blad clipper kit	Ahdis	21420	Chirurgische levering
Betadine huidreiniger	Perdue Products L.P	67618-149-04	Chirurgische levering
Drievoudige antibiotische zalf	Medline Supply	53329-087-01	Chirurgische levering
Puralube dierenarts zalf	Alleen Veterinary Supply	17033-211-38	Chirurgische levering
Dino-lite	Microscoop	AD7013MTL	Een alternatief voor de traditionele dissectiescoop
Dino-lite stijve tafel-top boom stand	Microscoop	MS36B	Chirurgische apparatuur
28 G 10 μl spuit	Hamilton	80308-701SN	Chirurgische apparatuur
Extra hoge MDF geluid demping cubicle	Med Associates, Inc	ENV-018MD	22' W x 22' H x 16' D
Extra hoge modulaire testkamer	Med Associates, Inc	ENV-007	Gedragsapparatuur
Roestvrij stalen roostervloer	Med Associates, Inc	ENV-005	Gedragsapparatuur
Huislicht	Med Associates, Inc	ENV-215M	Gebruikt als de huislicht en stimulus licht
Modulaire pellet dispenser	Med Associates, Inc	ENV-203M-45	Gedragsapparatuur
Pellet ontvangstbak, beker type	Med Associates, Inc	ENV-200R1M	Gedragsapparatuur
Hoofd invoer detector voor rat	Med Associates, Inc	ENV-254-CB	Gedragsapparatuur
Stofvrije precisie voedsel pellets, 45 mg	Bio-Serv	F0165	Gedragsvoorraad
Cage luidspreker voor rat kamer	Med Associates, Inc	ENV-224AM	Gedragsapparatuur
Programmeerbare audio generator	Med Associates, Inc	ANL-926	Gedragsapparatuur
Smart ctrl 8 ingang/16 uitgang pakket	Med Associates, Inc	DIG-716P2	Gedragsapparatuur
Grote tafel-top kast en voeding	Med Associates, Inc	SG-6510D	Gedragsapparatuur
PCI interface pakket	Med Associates, Inc	DIG-700P2-R2	Gedragsapparatuur
MED Intel core computer pkg met X Pro 19" monitor	Med Associates, Inc	COM-103V	Gedragsapparatuur
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg	Electron Microsopy Sciences	19210	Gevaar: kankerverwekkend, wegen in kap
Konijn monoklonaal antilichaam (HA-Tag)	Cell Signaling Technologies	3724S	Histologie reagens
XP Konijn monoklonaal antilichaam (GFP)	Cell Signaling Technologies	2956S	Histologie reagens
Anti-konijn IgG	Cell Signaling Technologies	4412S	Histologie benodigdheden
Superfrost plus slides	VWR international	483111-703	Histologie benodigdheden