Methodenartikel

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

13K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52862

⸱

11 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

In dit artikel

Samenvatting

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

Samenvatting

Om endovasculair infecties en infectieuze endocarditis veroorzaken, moeten bacteriën kunnen hechten aan de vatwand terwijl blootstelling aan de afschuifspanning van stromend bloed.

Om de bacteriële en gastheer factoren die bijdragen tot vasculaire adhesie van micro-organismen te identificeren, worden de modellen die deze interacties onder fysiologische omstandigheden te bestuderen afschuiving nodig. Hier beschrijven we een in vitro flow chamber model waarmee bacteriële hechting onderzoeken in verschillende componenten van de extracellulaire matrix of endotheelcellen en een intravitale microscopie zoals dat is ontwikkeld om direct visualiseren de initiële hechting van bacteriën aan de splanchnische circulatie in vivo . Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt om de bacteriële en gastheer factoren die nodig zijn voor de aanhechting van bacteriën onder stroming te identificeren. We illustreren het belang van de schuifspanning en de rol van von Willebrand factor voor de hechting van Staphyferment- aureus zowel met de in vitro en in vivo model.

Inleiding

Om endovasculaire infecties te veroorzaken, hebben pathogenen een mechanisme nodig om te hechten aan het endotheel, dat de vaatwand en het binnenoppervlak van het hart bekleedt, en om te overleven en een infectie te vestigen ondanks de blootstelling aan de schuifspanning van snel stromend bloed. De meest voorkomende ziekteverwekker die levensbedreigende endovasculaire infecties en infectieuze endocarditis veroorzaakt, is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.

Verschillende aan het bacteriële oppervlak gebonden adhesiefmolecuulmediators zorgen voor hechting aan het gastheerweefsel door interactie met componenten van de extracellulaire matrix. Deze MSCRAMM's (microbiële oppervlaktecomponenten die adhesieve matrixmoleculen herkennen) herkennen moleculen zoals fibronectine, fibrinogeen, collageen en von Willebrand-factor (VWF). MSCRAMM's zijn belangrijke virulentiefactoren van S. aureus en zijn betrokken bij de kolonisatie en invasie van de gastheer2. De meeste studies naar deze virulentiefactoren zijn uitgevoerd onder statische omstandigheden en zijn daarom mogelijk niet representatief voor menselijke infecties waarbij de initiële hechting van de bacteriën plaatsvindt in stromend bloed.

In het geval van bloedstroominfecties moeten bacteriën de schuifkrachten van stromend bloed overwinnen om zich aan de vaatwand te hechten. Modellen die de interactie tussen bacteriën en endotheel of subendotheel onder stromingscondities onderzoeken, zijn daarom van bijzonder belang.

Een recente studie toonde aan dat de hechting van S. aureus aan bloedvaten onder schuifspanning wordt gemedieerd door VWF3. VWF, een onder schuifspanning werkend eiwit, wordt vrijgegeven uit endotheliale cellen bij activering. Circulerend VWF bindt aan collageenvezels van de blootgestelde subendotheliale matrix. Onze groep rapporteerde dat het von Willebrand-factorbindende eiwit (vWbp) van S. aureus cruciaal is voor schuifspanningsgemedieerde hechting aan VWF4.

In dit artikel presenteren we een in vitro stromingskamermodel waarin bacteriële hechting aan verschillende componenten van de extracellulaire matrix of aan endotheliale cellen kan worden geëvalueerd. Om de bevindingen uit in vitro gegevens te valideren, hebben we een in vivo model ontwikkeld dat de directe interactie van bacteriën met de vaatwand en de vorming van bacteriële-trombocyt trombi in de mesenteriale circulatie van muizen visualiseert en kwantificeert, met behulp van real-time intravitale vasculaire microscopie.

Protocol

Dierproeven werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de KU Leuven.

1. Voorbereiding Bacteriën voor infusies in vitro en in vivo experimenten

  1. We gebruikten S. aureus stam Newman voor alle experimenten in dit manuscript beschreven. S. aureus Newman werd opgeslagen in Brain Heart Infusion (BHI) met 10% glycerol bij -80 ° C.
  2. Gebruik een steriele lus te schrapen de bevroren bacteriën af en beënt in 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N bij 37 ° C (OD 600> 3).
  3. Was de bacteriën door centrifugeren (2600 g, kamertemperatuur, 5 min) en resuspendeer de bacteriële pellet in 5 ml PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
  4. Maak een 1 mg / ml oplossing van 5 (6) -carboxy-fluoresceïne N-hydroxysuccinimidylester (carboxy-fluoresceïne) in ethanol. Verdun de 1 mg / ml carboxy-fluoresceïne oplossing 150 ug / ml in laboratoriumkwaliteit water (bijvoorbeeld MilliQ water). Bescherm de buizen van lichtmet aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C.
  5. Centrifugeer de bacteriën (2.600 xg, RT, 5 min). Resuspendeer de bacteriële pellet in 800 pl PBS en voeg 200 pl (eindconcentratie van 30 ug / ml voor perfusie experimenten) en 400 pl (eindconcentratie 50 gg / ml in vivo experimenten) van de 150 ug / ml carboxy-fluoresceïne-oplossing. Bescherm de buizen tegen licht met aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een schudinrichting.
  6. Na labeling, blok met 6% bovine serum albumine (BSA) oplossing in PBS.
  7. Verdun bacteriën gebruikmakend van optische densitometrie (OD), een OD 600 van 0,65 in vitro experimenten (overeenkomend met ongeveer 3 x 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml S. aureus) en een OD 600 van 1,8 voor in vivo experimenten ( overeenkomt met ongeveer 1 x 10 9 CFU / ml S. aureus) in PBS. Bescherm de buizen van licht met aluminiumfolie en laat op ijs.

2. In vitro experimenten Perfusion

  1. Coating van dekglaasjes
    1. Verdun von Willebrand factor (VWF) (Haemate P, voorraadconcentratie 2400 ug / ml) in laboratoriumkwaliteit water (gedeïoniseerd gedestilleerd) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml.
    2. Verdun collageen in isotone glucoseoplossing (SKF, pH 2,7-2,9, zoals geleverd door de fabrikant) tot een uiteindelijke concentratie van 160 ug / ml.
    3. Coat dekglaasjes (24 × 50 mm) met VWF of collageen druppelsgewijs 200 ul van de coating op parafilm en plaats het dekglaasje op de top van de druppel. De druppel zal verspreiden langs het oppervlak van het dekglaasje.
    4. Incubeer het dekglaasje in een bevochtigde container voor 4 uur bij KT. Til de dekglaasjes van de parafilm met een stompe naald. Monteer het dekglaasje in het onderste gedeelte van de stromingskamer.
  2. Coating van Plastic Slips met endotheelcellen
    1. Coat plastic slips(1-well PCA celkweekkamer, Sarstedt, Duitsland) met 1 ml van een 1% gelatine-oplossing in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Seed humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) van de gelatine beklede plastic slips en groeien ze tot 70-80% confluentie. Plaats de plastic slip in het onderste gedeelte van de stromingskamer.
  3. Perfusie Experiment
    Opmerking: Een schematisch overzicht van de in vitro perfusie model is weergegeven in Figuur 1.
    1. Voer in vitro bacteriële adhesie studies in een micro-parallelle plaat stroming kamer bij een laminaire schuifspanning tussen 2,5 dyne / cm 2 en 20 dyne / cm 2 simuleren verschillende fysiologische stroomomstandigheden.
    2. De stromingskamer (in-house design) bestaat uit een metalen frame en een perfusie kamer gemaakt van plexiglas (poly (methyl) methacrylaat (PMMA)). Door deze op een zeer nauwkeurige infusiepomp (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), kunnen we stroming ra genererentes tussen 0,0001 pl / min en 220,82 ml / min.
    3. Sluit de slang aan het bovendeel van de stromingskamer en injecteer medium in de buis. Plaats voorzichtig de bovenkant van de stromingskamer bovenop het onderste gedeelte en monteer de stroom kamer. Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Injecteer 1 ml van medium door de kamer om ervoor te zorgen dat de kamer niet lekt en om overtollige coating oplossing te verwijderen. Vermijd luchtbellen.
    4. Plaats de muis in een thermisch gecontroleerde verwarmingskussen bij 37 ° C op een microscoopglaasje lade. Aangezien dit een terminal procedure, is er geen noodzaak van een strikte asceptische procedures. Een incisie nabij de halsader, verwijder voorzichtig de rechterzijde van de cervicale spier en isoleer de halsader van het omringende weefsel.
    5. Stel de infuuspomp en fluorescentiemicroscoop. Infuuspomp instellingen zijn afhankelijk van de spuit diameter en de gewenste debiet (zie paragraaf 2.4). Vanaf nu werken in een donkere kamer.
    6. VWF Coating:
      1. Vul een spuit met fluorescent gelabelde bacteriën en sluit deze aan op de inlaat buis. Vermijd luchtbellen. Start de infusiepomp gedurende 10 min. De infusietijd is afhankelijk van de afschuifsnelheid en de coating, bacteriën en middelgrote gebruikt en moeten de steady state hechting geven.
      2. Na 10 min, wegspoelen van ongebonden bacteriën door er een spuit met PBS om de inlaatbuis en het starten van de infusiepomp.
      3. Neem ten minste 15 foto's of films op verschillende plaatsen na het wasproces. Bacteriën zijn kleine en mogelijk moeilijk om zich te concentreren op. Voorafgaand aan het in vitro experiment stroom, kan het geschikte focal plane teruggevonden door een druppel van fluorescent gelabelde bacteriën op een dekglaasje te plaatsen en het dekglaasje in de stromingskamer. Dan, op zoek naar de juiste focal plane en sla de instellingen.
        OPMERKING: Bij de in vitro stroom experiment vastleggen van de beelden tijdens de wasstap (± 5 minuten na start) zorgt ervoor dat alleen designaal voor aanhangend bacteriën wordt vastgelegd.
    7. Collageen Coating:
      1. Voeg 60 ug / ml VWF aan de fluorescent gelabelde bacteriën net voor aanvang van de perfusie. Vul een spuit met fluorescent gelabelde bacteriën of fluorescent gelabelde bacteriën, aangevuld met 60 ug / ml VWF en sluit deze aan op de inlaat buis. Vermijd luchtbellen. Herhaal stap 2.3.5.2 naar 2.3.5.3
    8. Endotheliale Cellen:
      1. Activeer de endotheelcellen door perfusie met een 0,1 mM oplossing van de Ca 2+ -ionophore A23187 (voorraadoplossing 10 mM opgelost in dimethyl- sulfoxide (DMSO)) in DMEM bij dezelfde afschuifsnelheid als bacteriële perfusie gedurende 10 min perfusie met 0,1 mM. Herhaal stap 2.3.5.2 naar 2.3.5.3.
  4. Bereken shear rate en shear stress als volgt.
    Afschuifsnelheid = 6Q / wh 2
    Waar: Q: debiet in ml / min, w: breedte in cm, h: hoogte in cm
    Shear stress (τ) = shear ratex viscositeit (μ)
    Waar μ: medium: 0,01 dynes x sec / cm 2, volbloed: 0.04 dynes x sec / cm2
  5. Beeldanalyse
    1. Verkrijgen van live-beelden met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop met een zwart-wit camera en te ontwikkelen met behulp van beeldbewerkingssoftware. Gebruik belichtingstijd van 1,5 sec. Neem meerdere foto's (minimaal 15) willekeurig verspreid over het gecoate oppervlak van de stroom kamer en sla ze op in het juiste bestandsformaat.
    2. Voer beeldanalyse met ImageJ. Trek de achtergrond van vloeiende continu achtergronden uit de afbeelding (Process - Aftrekken Achtergrond) te verwijderen en bepalen de drempel om onderste en bovenste drempelwaarden ingesteld, segmenteren grijstinten in kenmerken van belang. Meet het oppervlak beperkt tot de drempel.
    3. Vergelijk bacteriële hechting, uitgedrukt fluorescerende delen, bijvoorbeeld met behulp van statistische analysesoftware. Vergelijk de groepen met behulp van one-way ANOVA of two staart T-test Student's. Melden alle waarden als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Beschouw een p-waarde van <0,05 significant (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001).

3. In vivo Mesenteriale Perfusion Model

  1. Voorbereiding / chirurgie van de muis
    1. Fast de muis de nacht vóór het experiment om stoelgang te beperken.
    2. Geef een 6-8 weken oude muizen (C57BL / 6) pre-operatieve analgesie door een subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) 20-30 minuten voor de operatie.
    3. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (125 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg / kg BW). Controleer door pedaal reflex. Breng vet zalf tot droog voorkomen.
    4. Plaats de muis in een thermisch gecontroleerde verwarmingskussen bij 37 ° C op een microscoopglaasje lade. Aangezien dit een terminal procedure, is er geen noodzaak van een strikte asceptic procedures. Een incisie nabij de halsader, verwijder voorzichtig de rechterzijde van de cervicale spier en isoleer de halsader van het omringende weefsel.
    5. Plaats een 2 French intraveneuze catheter in de rechter halsader voor infusie van fluorescent gelabelde bacteriën of andere oplossingen. Open de buikholte via een middellijn incisie in de buik en het gebruik van wattenstaafjes om de mesenterium verspreiden en de mesenteriale arteriolaire en venular circulatie te visualiseren.
    6. Plaats de muis naar de rechterzijde op een transparante plaat en zet de canule met tape. Gebruik een hot pack om onderkoeling te voorkomen. Om uitdroging van het weefsel te voorkomen, vallen 500 ul 0,9% NaCl op de darmen.
  2. Fluorescentie microscopie van bacteriële hechting aan de mesenterische circulatie
    1. Werk in een donkere kamer. Gebruik wattenstaafjes om de schepen te immobiliseren en visualiseren ze onder een omgekeerde microscoop.
    2. Topicaal 5 pi van een 10 mM oplossing o toepassingf de Ca2 + -ionophore A23187 opgelost in DMSO. Na 10 sec, injecteer 100 ul gemerkte bacteriën (zie stap 1) door de halsader katheter. Neem de time-lapse beelden. Na het experiment is voltooid, euthanaseren de muis volgens de institutionele richtlijnen goedgekeurd.
  3. Beeldanalyse
    1. Verkrijgen van live-beelden met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop, vastgelegd met behulp van een zwart-wit camera en ontwikkeld met behulp van een imaging software. Breng geautomatiseerde belichtingstijd en contrast optimalisatie specifiek voor de gebruikte apparatuur.
    2. Acquire time-lapse beelden met behulp van de 'Acquisitie' instrument in de werkbalk (Multidimensional Acquisities - Time) met behulp van 40 cycli van 1.000 beelden / sec. Sla de beelden in een geschikt bestandsformaat.
    3. Proces beelden met behulp van ImageJ analyse software om het gebied van fluorescerende signaal per beeld te meten. Definieer de drempel tot onderste en bovenste drempelwaarden ingesteld, segmenteren grijstinten in fENMERKEN van belang. Identificeer het gebied van belang (bloedvat) en meet het gebied beperkt tot de drempel en het gebied van belang. Vergelijk bacteriële hechting, uitgedrukt als fluorescerende gebied met behulp van een statistische of grafische software.

Resultaten

S. aureus adhesie aan VWF, subendotheliale matrix en endotheelcellen een schuifspanning afhankelijk fenomeen

De rol van shear stress benadrukken de interactie tussen S. aureus en VWF, voerden we perfusie via VWF beklede dekglaasjes bij verschillende afschuifsnelheden (een schematisch overzicht van de in vitro perfusie model is weergegeven in figuur 1. adhesie van S. aureus aan vWF toe met toenemende afschuifsnelheden van 250 sec -1 tot 2000 sec -1 (figuur 2), wat aangeeft dat hoge afschuifkrachten niet belemmeren maar versterkt de hechting van bacteriën aan VWF.

Om de bijdrage van VWF bacteriële hechting aan collageen te onderzoeken, het hoofdbestanddeel van de subendothele matrix, we geperfuseerd fluorescent gemerkte S. aureus op collageen in de aanwezigheid of afwezigheid van VWF. Bij afwezigheid van VWF, hechting van S. eenureus collageen af met toenemende afschuifsnelheden. Wanneer echter VWF in het medium aanwezig was, de hechting van S. aureus toe met toenemende afschuifsnelheden (figuur 3).

De in vitro stromingsmodel kunnen wij ook de hechting van bacteriën onderzocht endotheelcellen onderbroken wordt. We geperfuseerd HUVECs met fluorescent gelabelde S. aureus bij afschuifsnelheden van 500 tot 2.000 sec -1. Waar aangegeven, HUVEC werden geactiveerd met een Ca 2+ -ionophore, tot het vrijkomen van VWF leiden. Endotheelcel activatie en de daaropvolgende afgifte VWF, verhoogde adhesie van S. aureus (Figuur 4A), wat typische "draadvormige" patronen gevormd van fluorescent gelabelde bacteriële clusters uitgelijnd in de richting van de dwarskracht (figuur 4B), wat suggereert dat de binding van bacteriën aan een lineaire gestrekt VWF molecuul.

Eerste in vivobacteriële hechting splanchnische aders wordt gemedieerd door VWF

Omdat S. aureus kan houden aan VWF, gebruikten we wildtype muizen (vWF + / +) en VWF-deficiënte muizen (VWF - / -) om bacteriële hechting aan de geactiveerde bloedvatwand in vivo te onderzoeken. Real-time videomicroscopie van splanchnische aderen konden de in vivo visualisatie van circulerende fluorescent gelabelde S. aureus (Schematisch overzicht van de in vivo perfusie model is weergegeven in figuur 5).

Na farmacologische activatie van het endotheel van de Ca2 + -ionophore vonden wij snelle lokale ophoping van individuele bacteriën en aggregaten van bacteriën aan de vaatwand van WT-muizen (aanvullende's 1 en 2). Vrijwel geen hechting van bacteriën werd waargenomen op de geactiveerde vaatwand van vWF -deficient muizen (extra Video 3) ten opzichte van hechting in WT-muizen (Figuur 6). De afwezigheid van VWF vermindert het vermogen van S. aureus te houden aan de geactiveerde vaatwand.

figure-results-1
Figuur 1. Een schematische weergave van de in vitro stromingsmodel. De in vitro stromingsmodel is een multifunctioneel model, dat de studie van verschillende afschuifsnelheid afhankelijke mechanismen maakt zoals bacteriële hechting aan de subendotheliale matrix maar ook trombus vorming. De micro-meestroom kamer rust op een dekglaasje (plastic of glas) met verschillende coatings van eiwitten en endotheelcellen. De adhesie van verschillende bacteriën (oranje en grijze stippen) kunnen worden geanalyseerd, en het effect van de aanwezigheid van plasmaproteïnen, bloedplaatjes en totaal bloed kunnen worden geëvalueerd. Fluorescent markers voor bloedplaatjes (blauwe ovalen) of fibrinogen (blue strings) worden toegepast in combinatie met andere remmers (zwarte ovalen) bacteriële en gastheer factoren onderscheiden. Vertegenwoordiger beelden van bacteriële hechting van S. aureus collageen coating in aanwezigheid (onder) of afwezigheid (top) van de VWF worden weergegeven (schaal bar is 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Hechting van S. aureus VWF toe met toenemende afschuifsnelheden. Micro-parallel flow chamber perfusie via beklede VWF (50 ug / ml) met fluorescent gelabelde S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 250 tot 2.000 sec -1 (sec -1) in medium (n> 5). Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01.

figure-results-3
Figuur 3. Hechting van S. aureus subendotheel is afschuiving en VWF afhankelijk. Micro-parallel flow chamber perfusie via gecoate collageen (160 ug / ml) met fluorescent gelabelde S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 250 tot 2.000 sec -1 in medium (n> 5). VWF (60 ug / ml) was aanwezig in het medium waar aangegeven. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. ** P <0,01.

figure-results-4
Figuur 4. Adhesie van S. aureus aan geactiveerde endotheelcellen is shear afhankelijk. Micro-parallel flow chamber perfusie via endotheelcellen. (A) menselijke navelstreng endotheel cellen werden geactiveerd met het Ca2 + -ionophore A23187 (0,1 mM) gevolgd door een 10 min perfusie van fluorescent gemerkte S. aureus Newman bij afschuifsnelheden van 500 tot 2.000 sec -1 in medium (n> 5). Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * P <0,05. (B) Afbeelding van micro-parallelle stroom kamer perfusie dan geactiveerd HUVECs met S. aureus bij een afschuifsnelheid van 1.000 sec -2. S. aureus vormt snaren van ± 200 micron lengte, wat suggereert hechting aan VWF multimeren (schaal bar is 100 micrometer). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Een schematisch overzicht van de in vivo mesenteriale perfusie model. Een recht halsader katheter (gele lijn) is voor het beheer van fluor gestokenescently gelabelde bacteriën (oranje stippen), extra anesthetica of andere componenten, zoals de farmaceutische remmers en antilichamen. De peritoneale holte wordt geopend en het mesenterium wordt verspreid naar de bloedvaten (arterieel en veneus) onder een fluorescentiemicroscoop visualiseren. Na farmacologische activatie van het endotheel door Ca2 + -ionophore, dat de afgifte van VWF induceert, kunnen bacteriën worden toegediend via de jugulaire ader katheter. Real-time intravasculaire video microscopie kan de in vivo visualisatie van circulerende fluorescent gelabelde bacteriën en de resulterende vorming van bacteriën bloedplaatjes trombi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. De initiële hechting van S. aureusaan geactiveerd endotheel in vivo wordt gemedieerd door VWF In vivo veneus mesenterische perfusie model met C57BL / 6 VWF + / + en C57BL / 6- VWF -. / - muizen. Hechting van fluorescent gemerkte S. aureus het lokaal actief vaatwand significant lager bij VWF - / - muizen. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. *** P <0,001, n> 7.

figure-results-7
Video 1: Real-time hechting van S. aureus aan geactiveerde vaatwand in VWF + / + muizen. Klik hier om deze video te bekijken.

figure-results-8
Video 2: Real-time aggregaatvorming en embolisatie van S. aureus in VWF + / + muizen. Klik hier om deze video te bekijken.

figure-results-9
Video 3: Real-time hechting van S. aureus geactiveerd bloedvatwand in VWF - / -. muizen in vivo mesenterische perfusie model met VWF + / + en VWF - / - muizen. Vijf pi van een Ca2 + -ionophore (10 mM) werd toepased op het gebied van de gevisualiseerde vaatbed. Een suspensie van carboxy-fluoresceïne-gemerkte S. aureus werd geïnjecteerd via de jugulaire catheter. De mesenteriale circulatie werd gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop. Klik hier om deze video te bekijken.

Discussie

Shear stress is van cruciaal belang voor de vroege bacteriële hechting aan de vaatwand en de volgende generatie van endovasculaire of endocardiale vegetaties en metastatische infecties 4,5. We beschreven complementaire in vitro en in vivo modellen om de pathogenese van endovasculaire infecties onder fysiologische schuifspanning bestuderen. Deze modellen hebben ons aan von Willebrand-factor-bindend eiwit (vWbp) te identificeren als de belangrijkste S. aureus eiwit te communiceren onder stroom met een verwonde vaatwand bloot VWF 4.

Endovasculaire infecties en infectieuze endocarditis vooral van belang zijn, niet alleen vanwege sepsis geïnduceerde orgaanfalen en de dood, maar ook door lokale en verre (metastatisch) complicaties. Om infectieuze endocarditis en metastatische infecties veroorzaken, bacteriën moeten zich houden aan de vaatwand en dus verzetten tegen de shear stress van stromend bloed. Meeststudies op bacteriën virulentiefactoren zijn uitgevoerd in statische omstandigheden. Echter, deze gevestigde interacties misschien niet dwarskrachten en studies te weerstaan ​​onder stroom omstandigheden kan nieuwe, voorheen onbekende factoren in bacterie-gastheer wisselwerking onthullen.

Met behulp van de micro-parallelle stroom kamer, hebben wij en anderen zien het belang van de VWF voor vasculaire adhesie. Onder shear stress, VWF geleidelijk ontvouwt uit zijn rustplaats bolvormige structuur, en onthult de A1 domein dat interageert met bloedplaatjes via de GPIb-receptor 6. Stroomkamers zijn uitgebreid gebruikt om bloedplaatjesfunctie 7 bestuderen.

Opmerkelijk is ook S. aureus hechting onder stroom vereist VWF, en in het bijzonder het A1 domein dat wordt blootgesteld aan afschuiving. We geïdentificeerd vWbp te bemiddelen VWF binding. vWbp is een coagulase die bijdraagt ​​aan S. aureus pathofysiologie van protrombine de gastheer te activeren. Staphylothrombin, de resulting complex van een bacteriële coagulase en protrombine, zet fibrinogeen in onoplosbaar fibrine 8,9. Onze studies hebben aangetoond dat vWbp niet alleen geactiveerd prothrombine, maar leidt tot de vorming van bacterie-fibrine-aggregaten van bloedplaatjes, waardoor de hechting aan bloedvaten onder stroom 4,10,11 verbeteren.

De in vitro stromingskamer model maakt het mogelijk om de verschillende spelers in bacteriële hechting te bestuderen om cellulaire of matrix componenten. Bacteriële virulentie factoren kunnen worden bestudeerd met behulp van mutanten of onschadelijke bacteriën specifieke oppervlakte-eiwitten uiten. Alternatief kunnen farmacologische remmers of blokkerende antilichamen worden toegevoegd aan het medium in de stroom kamer. De rol van gastheerfactoren zoals verschillende bestanddelen van extracellulaire matrix kan worden onderzocht door gebruik dekglaasjes met verschillende coatings. De dekglaasjes kan ook worden bekleed met endotheelcellen, waarvan de activeringsstatus kan worden gemoduleerd door het toevoegen van specifieke stimulatoren. Apart uit de vaatwand, kan de bijdrage van ontvangst bloedcellen en plasma-eiwitten worden bestudeerd door het toevoegen van deze factoren het stromende medium. Zo kunnen verschillende omstandigheden van toenemende complexiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden van laminaire stroming worden bestudeerd om de interacties die de bacteriën te hechten aan de bloedvatwand in vivo ontrafelen.

Interacties die in het in vitro model worden vervolgens onderzocht in een diermodel om de relevantie te testen in een complex organisme. Andere in vivo modellen om dynamische interacties onder stroom te bestuderen zijn beschreven, zoals de hamster dorsale huidplooi kamer 12 en de cremaster model 13. In vergelijking, de mesenterische perfusie model beschreven biedt verschillende voordelen vanwege het gebruiksgemak, de mogelijkheid te variëren gastheer genetische achtergrond van de muizen en farmacologische interventies evalueren.

Kortom, de beschreven modellenbieden de mogelijkheid om oppervlakte-eiwitten niet alleen van S. bestuderen aureus, maar vele andere micro-organismen in verschillende gastheersoorten achtergronden, beter inzicht in de pathogenese van vasculaire infectie.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx Research Grant" en het "Sporta onderzoek Grant" voor Pediatric Cardiology, UZ Leuven, België (JC); het Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie wordt ondersteund door de Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), door de "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) van de Universiteit van Leuven en een onderzoek subsidie ​​van Boehringer-Ingelheim.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Brain Heart Infusion (BHI)BD Plastipak 237500
Tryptic Soy Broth (TSB)OxoidCM0129
Phosphate Buffered Saline (PBS)Invitrogen14190-169D-PBS
5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester Sigma-Aldrich21878-25MG-Ffluorescent labeling 
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)Roch10 735 086 001
Haemate-PCSL BehringPL 15036/0010VWF
Horm collagenTakeda10500collagen
1-well PCA cell culture chambersSarstedt94.6140.102plastic slips
TemgesicReckitt Benckiser283716bruprenorfine
Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))EurovetBE-V136516ketamin
XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))VMD ArendonkBE-V170581xylazine
2 french intravenous catheter greenPortex200/300/010
0,9% Sodium chloride (NaCl)Baxter HealthcareW7124
cotton swabsInternational Medical Product300230
Ca2+-ionophore solution A23187Sigma-AldrichC7522-10 MG
26 gauge 1 ml syringe  BD Plastipak 300013
26 gauge 1 ml syringe  with needleBD Plastipak 300015intra-peritoneale injectie
Centrifuge 5810-REppendorf5811 000.320
Glass cover slips (24x50)VWRBB02405A11Thickness No, 1
PHD 2000 InfusionHarvard Apparatus702100High-accuracy Harvard infusiepomp
Axio-observer DICarl-ZeissInvertede fluorescentiemicroscoop
ImageJNational Institute of HealthAnalysesoftware
Graphpad Prism 5,0Graphpad SoftwareAnalysesoftware
AxioCam MRmCarl-Zeiss Zwart-witcamera

Referenties

  1. Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
  2. Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
  3. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
  4. Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
  5. Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
  6. Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
  7. Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
  8. Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
  9. Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
  10. Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
  11. Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
  12. Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
  13. Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

Stroomkamerintravitale microscopieschuifspanningStaphylococcus aureusvon Willebrand-factorendotheelcellenextracellulaire matrixfluorescente labelingvideomicroscopie
In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.