Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

12.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52885

⸱

5 juni 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Samenvatting

Somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) worden geprogrammeerd door het forceren van de expressie van vier transcriptiefactoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), typisch uitgedrukt door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) . Door hun gelijkenis met hESCs, hebben iPSCs een belangrijk instrument voor potentiële patiënt-specifieke regeneratieve geneeskunde te worden, het vermijden van ethische kwesties in verband met hESCs. Om die geschikt zijn voor klinische toepassing, verplichting-transgen vrij iPSCs worden gegenereerd om transgene reactivering, veranderde genexpressie en differentiatie misplaatste voorkomen. Bovendien is een zeer efficiënte en goedkope herprogrammering nodig is, moet voldoende iPSCs leiden voor therapeutische doeleinden. Gezien deze behoefte, een efficiënte niet-integrerende episomaal plasmide aanpak is de voorkeur keuze voor iPSC afleiding. Momenteel is de meest voorkomende celtype voor herprogrammering doeleinden fibroblasten, de isolatie die alleen door een weefselbiopsie, een invasive chirurgische ingreep voor de patiënt. Daarom humaan perifeer bloed is de meest toegankelijke en minst invasieve weefsel voor iPSC genereren.

In deze studie wordt een kosteneffectieve en virale free-protocol met behulp van niet-integrerende episomale plasmiden gerapporteerd voor het genereren van iPSCs uit menselijk perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats na volbloed centrifugering en zonder dichtheidsgradiënt gescheiden.

Inleiding

In 2006 heeft de groep van Shinya Yamanaka 1 aangetoond voor de eerste keer dat de somatische cellen van volwassen muizen en mensen kan worden omgezet in een pluripotente toestand door ectopische expressie van vier herprogrammering factoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), genereert de zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 2. Patiëntspecifieke iPSCs lijken humane embryonale stamcellen (hESCs) qua morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in de drie-kiem celtypen (mesoderm, endoderm en ectoderm), terwijl zonder de ethische bezwaren verbonden aan het gebruik van hESCs en bypassing mogelijke afstoting 3. Aldus iPSCs weergegeven als een van de belangrijkste bronnen van patiënt-specifieke cellen voor basisonderzoek, drug screening, ziektemodel, evalueren van de toxiciteit en regeneratieve geneeskunde doeleinden 4.

Verschillende benaderingen zijn gebruikt iPSC generatie virale integrerende vectoren(5 retrovirus, lentivirus 6), niet-integrerende virale vectoren (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC transposons 9, episomale vectoren 10, 11 eiwitten of RNA delivery 12. Hoewel het gebruik van virus-gemedieerde werkwijzen kunnen leiden tot hoge efficiency herprogrammering, virale vectoren integreren in het genoom van gastheercellen en daardoor potentiële willekeurige mutagenese kan permanente verandering van genexpressie en reactivering van zwijgen transgenen tijdens differentiatie niet uitgesloten 13.

Om iPSCs veiliger regeneratieve geneeskunde maken, zijn pogingen gedaan om iPSCs afleiden zonder integratie van exogeen DNA in cellulair genoom. Hoewel accijnsgoederenverkeer virale vectoren en transposons zijn ontwikkeld, is nog onduidelijk of korte vectorsequenties, wat onvermijdelijk blijven de getransduceerde cellen na excisie en transposase expressie verandering in cel kan inducerenular functioneren 13. Ondanks zijn hoge herprogrammering efficiëntie, Sendai virus vertegenwoordigt een dure aanpak en bereiken-door licenties zorgen met het bedrijf dat dit systeem ontwikkeld, het potentieel hebben om de toepassing ervan in translationeel onderzoek te beperken. Bovendien is de noodzaak om het monster direct van eiwitten en RNA vereist meerdere afgifte herprogrammeren moleculen met de inherente technische beperkingen dit brengt en herprogrammering algehele efficiëntie zeer laag 14. Opmerkelijk zijn rendabel viraal-vrije en niet-integrerende methoden gebaseerd op het gebruik van episomale plasmiden met succes gerapporteerd voor de herschikking van huidfibroblasten 15. Specifiek, in dit werk hebben we besloten om commercieel beschikbare integratie vrije episomale plasmiden gebruiken, zoals eerder gemeld 10,15.

Tot op heden huidfibroblasten vormen de meest populaire donor celtype 5. Echter, andere mobiele bronnen succes geweestalle codes opnieuw geprogrammeerd in iPSCs waaronder keratinocyten 16, beenmerg mesenchymale stamcellen 17, stromacellen in vetweefsel 18, haarzakjes 19, en tandheelkundige pulp cellen 20. De isolatie van deze cellen vereist chirurgische procedures, en enkele weken nodig om in vitro celexpansie om een primaire celkweek stellen.

In dit licht is de keuze van het starten celtype is kritisch en is het even belangrijk om te kunnen iPSCs produceren van gemakkelijk toegankelijke en minder invasief weefsels zoals bloed. Zowel navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMNCs) 21,22 en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) 14,22-24 vertegenwoordigen geschikte bron van cellen voor de afleiding van iPSCs.

Hoewel de efficiëntie van volwassen PBMNC herprogrammering 20-50 keer lager dan die van CBMNCs 22, blijven ze de meest geschikte celtype voor bemonstering doel. InEigenlijk PBMNC bemonstering heeft het voordeel dat minimaal invasief, en bovendien zijn deze cellen niet uitgebreid in vitro expansie voor herprogrammering experimenten vereist. Tot nu toe zijn verschillende protocollen gemeld dat PBMNCs na dichtheidsgradiënt scheiding kan worden ingevroren en ontdooid dagen tot enkele maanden na invriezen en uitgebreid voor enkele dagen vóór herprogrammeren in iPSCs 22,23. Echter zover wij weten geen rapporten herprogrammering van PBMNCs uit bevroren buffy coats beschreven. Belangrijk is bevroren buffycoats verzameld zonder dichtheidsgradiënt scheiding vertegenwoordigen de meest voorkomende bloedstalen opgeslagen in grootschalige biobanken van de bevolking studies, dus neerkomt op een gemakkelijk toegankelijke pool van materiaal voor iPSC productie die verder monstername voorkomt.

Hierin beschrijven we voor het eerst de productie van virale-vrij iPSCs uit humane bevroren buffy coats, gebaseerd op een eerder beschreven protocol 22. InDaarnaast werden iPSCs geproduceerd uit bevroren PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding als een controleprotocol voor non-density gradient gezuiverde PBMNC resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMNCs) werden geïsoleerd uit humaan perifeer bloedmonsters van gezonde donoren na ondertekend informed consent en goedkeuring van de Ethische Commissie van de provincie Zuid-Tirol. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. Alle gegevens werden verzameld en anoniem geanalyseerd.

1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs)

  1. PBMNCs verkregen uit buffy coats na volbloed centrifugeren, zonder dichtheidsgradiënt scheiding.
    1. Verzamel 8 ml veneus perifeer bloed in een natriumcitraat gebufferde plastic buisje en bewaar bij kamertemperatuur (25 ° C). Proces bloed binnen 12 uur na collectie.
    2. Centrifugeer het buisje bij 2000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor, uitschakeling van de centrifuge remmen.
    3. Verzamel de bewolkte buffycoat (de laag tussen de bovenste plasma fase en de onderstefase die het merendeel van de erythrocyten) met het PBMNC verrijkte fractie (500 ui) in een cryovial buis.
    4. Resuspendeer 500 pl buffy coat met 500 ul 2x freezing medium dat 90% FBS en 20% DMSO, teneinde een totaal volume van 10% DMSO met een concentratie van 1 ml te verkrijgen.
    5. Bevries het flesje in een gecontroleerde snelheid invriezen container bij -80 ° C. WINKEL cellen in vloeibare stikstof gedurende langere perioden.
  2. PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding
    1. Verzamel 12 ml perifeer veneus bloed in een natriumcitraat gebufferde plastic buisje en bewaar bij kamertemperatuur. Proces bloed binnen 12 uur na collectie.
    2. Verdun het bloed met steriele PBS tot een eindvolume van 35 ml.
    3. Voorzichtig en langzaam, laag 35 ml verdund bloed aan 15 ml polysucrose oplossing (voor dichtheidsgradiënt scheiding) (p = 1,077) in een 50 ml conische buis (verhouding 3: 1).
    4. Centrifugeer de buis bij 800 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur ineen swingende emmer rotor, het uitschakelen van de centrifuge remmen.
    5. Zuig de bovenste, gele fase die plasma en gooi deze weg. Voorzichtig, de overdracht van de ondoorzichtige witte interphase laag met PBMNCs om een ​​nieuwe 50 ml conische buis.
    6. Breng totale volume 30 ml met steriele PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 30 ml PBS. Tel het aantal levensvatbare cellen, op basis van trypan blauw exclusie 25.
    8. Centrifugeer PBMNCs bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur, zuig de supernatant af en gooi dit.
    9. Resuspendeer de celpellet in een geschikte hoeveelheid ijskoud medium met 90% FBS en 10% DMSO, teneinde een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen.
    10. Aliquot 1 ml per flesje (ongeveer 5 x 10 6 cellen / ml) en vries de flacon in een gecontroleerde snelheid invriezen container bij - 80 ° C. WINKEL cellen in vloeibare stikstof gedurende langere perioden.

2. Ontdooien en Plating van PBMNCs (dag 0)

  1. PBMNCs verkregen uit buffy coats na volbloed centrifugeren, zonder dichtheidsgradiënt scheiding.
    1. Het protocol gebruikt PBMNCs uit bevroren buffy coats start ontdooien 1 flesje met cellen in een waterbad bij 37 ° C en los het buffy coat met steriele PBS tot een eindvolume van 2 ml.
    2. Breng het verdunde bufferlaag in een 50 ml conische buis, voeg 10 ml erytrocyten lysis buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Ter voorbereiding 500 ml erytrocyten lysis buffer, voeg 0,5 g kaliumbicarbonaat, 4,145 g ammoniumchloride, 100 pl 0,5 M EDTA-oplossing tot 500 ml ultrazuiver water, pH 7,2-7,4.
    4. Breng totale volume op 50 ml met steriele PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder het supernatant en was het pellet met 50 ml steriel PBS, gecentrifugeerd buffy coat bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    6. Resuspendeer de cellen in1 ml van PBMNC medium, zoals eerder beschreven 22, bestaande uit: IMDM en Ham's F-12 (verhouding 1: 1), 1% van de insuline-transferrine-Seleen-Ethanolamine (ITS-X), 1% van chemisch gedefinieerde Lipid Concentrate (CDL), 1% penicilline / streptomycine, 0,005% L-ascorbinezuur, 0,5% runderserumalbumine (BSA), 1-thioglycerol (eindconcentratie 200 uM), stamcelfactor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), erythropoïetine EPO (2 U / ml), insuline-achtige groeifactor IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethasone (1 uM) en holo-transferrine (100 ug / ml ).
    7. Overbrengen naar een putje van een 12-wells plaat met standaard weefselkweek behandelde oppervlak zonder coating, bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur, totdat de veranderende medium stap (zie sectie 3).
  2. PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding
    1. Om het protocol te beginnen met bevroren PBMNCs nadichtheidsgradiënt scheiding dooi 1 flacon cellen in een waterbad bij 37 ° C en breng de cellen in 5 ml medium PBMNC. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    2. Resuspendeer de cellen in 1 ml medium PBMNC en overbrengen naar een putje van een 12-wells plaat met een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur, totdat de veranderende medium stap (zie sectie 3).

3. Cultuur en uitbreiding van PBMNCs (DAY 2-13)

  1. Verzamel PBMNCs in suspensiekweek, met een pipet met een 1 ml tip, in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml vers medium PBMNC.
  3. Breng de cellen in 1 putje van 12-well plaat met standaard weefselkweek behandelde oppervlak, zonder coating, en incubeer ze op 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
  4. Herhaal deze stappen om de twee dagen, en de splitsing van de cellen in een verhouding 1: 2 bij het bereiken van de juiste samenloop (ongeveer 80%).

4. Transfectie van plasmiden PBMNCs met Episomaal (DAY 14)

Opmerking: Voer de isolatie van vier commerciële intergation vrij episomale plasmiden, die de pluripotentie genen met behulp van een commerciële kit voor plasmidezuivering en de kwaliteit van de gezuiverde plasmiden met gebruik van agarose gel analyse beoordelen volgens de instructies van de fabrikant.

  1. Verzamel PBMNCs in 15 ml conische buis en tel het aantal levensvatbare cellen (op basis van trypan blauw exclusie) 25.
  2. Centrifugeer 2 x 10 6 cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  3. Resuspendeer 2 x 10 6 cellen van transfectie mengsel dat 100 ui resuspensiebuffer T en 1 pg van elk plasmide DNA (een plasmide dat Oct3 / 4 en shRNA tegen p53, een plasmide dat SOX2 en KLF4, eenplasmide dat L-MYC en LIN28, en een plasmide dat EGFP, om de transfectie-efficiëntie te controleren).
  4. Zuig het transfectie mengsel dat de cellen in een 100 ul tip en plaats de pipet met het monster verticaal in de buis gevuld met 3 ml buffer Elektrolytische E2, geplaatst in de pipet station van electroporatie apparaat, volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Efficiënt electroporate cellen met het volgende programma: 1650 V, 10 msec, 3 pulsen.
  6. Resuspendeer de geëlektroporeerde cellen (2 x 10 6 cellen) in 2 ml voorverwarmde PBMNC medium, het toevoegen van 0,25 mM natriumbutyraat (NaB) en tel het aantal levensvatbare cellen na elektroporatie protocol (op basis van trypan blauw exclusie) 25.
  7. Breng de cellen in een putje van een 6-wells plaat zonder coating, schud de plaat en incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
  8. De dag na elektroporatie, count het aantal GFP-positieve cellen onder fluorescentiemicroscopie 8-10 willekeurige velden, teneinde de transfectie-efficiëntie te beoordelen.
  9. Handhaving van de getransfecteerde cellen zonder splitsing voor 3 dagen, totdat plating ze op MEF (zie hoofdstuk 6).
  10. Vervang 2 ml vers PBMNCs medium, plus 0,25 mm NaB om de twee dagen.

5. Bereid Gerechten met Feeder-cellen voor de co-cultuur (DAY 16)

  1. Coat de putjes van een 6-wells plaat met 1 ml basaalmembraan matrix gedurende 15 minuten bij 37 ° C en plaat muis embryonale fibroblasten (MEF) bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / putje met 2 ml van 10% FBS bevatte DMEM (MEF gemiddeld) een dag voor passage van de geëlektroporeerd PBMNCs op MEF feeder-cellen.

6. Plating Getransfecteerde PBMNCs op MEF (DAY 17-19)

  1. Verzamel PBMNCs in suspensiekweek, met een pipet met 1 ml tip, in 15 ml conische buis en centrifugeer getransfecteerd PBMNCs bij 300 xg gedurende 10 minbij kamertemperatuur.
  2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml vers medium PBMNC, plus 0,25 mM NaB.
  3. Plaat de cellen op MEF-coated 6 goed platen en incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
  4. Na twee dagen, zuigen en het medium vervangen met 2 ml iPSC medium bestaande uit DMEM knockout (KO-DMEM), 20% KO-Serum vervangen (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicilline / streptomycine, 20 mM L- Glutamine, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (bFGF basic) en 0,25 mM NaB.
  5. Vervang 2 ml vers iPSC medium elke dag en controleer de cellen dagelijks.
    Opmerking: Bij ongeveer 22-25 dagen, moet de eerste kolonies iPSCs zichtbaar.

7. Picking en uitbreiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Clones (DAY 30-35)

Opmerking: Ongeveer 30-35 dagen na transfectie, moet iPSC kolonies klaar voor het plukken en opnieuw uitplaten zijn. De herprogrammering efficiëntie moet esti zijngekoppeld als het percentage van het aantal iPSC kolonies / aantal cellen geëlektroporeerd, zoals eerder vermeld 26.

  1. De dag voor passage iPSC kolonies, de voorbereiding van de MEF feeder in een 12-well plaat (1,25 x 10 5 cellen / putje).
  2. Zuig het MEF medium en verandering met 1 ml iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF en 10 pM Y-27632. Handmatig ontleden met een naald één kolonie op elk tijdstip onder de stereomicroscoop in het opneemmiddel kap om een ​​raster te verkrijgen, verzamel kleinere klonten door pipetteren en breng ze elk in een afzonderlijk putje van 12-well plaat bekleed met MEFs.
  3. Passage en vergroten elke 12-well plaat een 6-wells plaat in een verhouding 1: 2, daarna iedere 6-wells plaat in een verhouding 1: 4 voor verdere vermeerdering. Ontleden en uit te breiden iPSCs handmatig voor de eerste 2-3 passages (zo grondig beschreven in stap 7.2), gebruik dan een enzym dissociatie procedure (starten vanaf stap 7.4).
  4. Voor een enzym dissociatie protocol, schoon iPSC Colonies door opzuigen gedifferentieerde porties, onder het ontleden microscoop in het picking-kap.
  5. Incubeer iPSCs met 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) gedurende 10 min bij 37 ° C.
  6. Zuig de enzymoplossing Spoel de cellen met 1 ml van KO-DMEM en laat de kolonies in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Zuig het supernatant, resuspendeer de kolonies in 2 ml iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF en 10 pM Y-27632 en plaat ze op MEF-coated 6-well plaat (verhouding 1: 4).

8. Analyse van iPSCs (tussen 5-15 Passages)

  1. Alkalische fosfatase Staining
    1. Cultuur iPSC kolonies 3-5 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF.
    2. Voor het starten van een alkalische fosfatase kleuring protocol, spoelen iPSCs eenmaal met PBS en bevestig ze met 1 ml 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de cellen drie keer met PBS om resten PFA te verwijderen.
    4. Stain gefixeerde cellen gebruiktcommerciële alkalische fosfatase kleuring kit volgens instructies van de fabrikant.
  2. Immunofluorescentie
    1. Cultuur iPSC kolonies 3-5 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF.
    2. Om een ​​immunofluorescentie assay starten, wassen iPSCs eenmaal met PBS en vervolgens vast met 1 ml 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de cellen drie keer met PBS om resten PFA te verwijderen.
    4. Behandel vaste iPSCs met 1 ml van permeabilisatie / blokkerende oplossing met 4% geit serum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 en 0,05% natriumazide (NaN3) gedurende 1 uur bij KT.
    5. Zuig het blockingbuffer en incubeer de gefixeerde cellen met primaire antilichamen in 3% BSA en 0,05% NaN3 oplossing O / N bij 4 ° C (zie de tabel materiaal voor de primaire lijst antilichaam en zonder antilichaam verdunningsfactor).
    6. De volgende dag was iPSCs driemaal met PBS, vervolgens Incubeer de cellen met Alexa Fluor 488 geit anti-muis Alexa Fluor 555 geit anti-konijn antilichamen verdund 1: 1000 in 3% BSA en 0,05% NaN3 oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    7. Vlekken op de kernen met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker, gevolgd door drie keer wassen met PBS.
  3. Differentiatie van iPSCs in embryoiden Bodies (EBS)
    1. Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF.
    2. Verwijder gedifferentieerde gedeelten uit iPSC kolonies door opzuigen, onder de microscoop ontleden in de picking-kap.
    3. Incubeer iPSCs met 1 ml collagenase IV (1 mg / ml) gedurende 10 min bij 37 ° C.
    4. Zuig de enzymoplossing Spoel de cellen met 1 ml van KO-DMEM en laat de kolonies in een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Zuig het supernatant en resuspendeer de kolonies in 2 ml EB medium uit KO-DMEM, 20% gedefinieerd foetaal bovien serum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicilline / streptomycine, 20 mM L-glutamine, 0,1 mM46; mercaptoethanol.
    6. Plate iPSC kolonies in suspensiekweek gedurende 6 dagen op ultra-low attachment 6-well platen, teneinde de vorming van bolvormige driedimensionale embryoid lichamen (EB's) mogelijk maken. Veranderen 2 ml vers EB medium om de twee dagen.
    7. Op dag 7, verzamel EBS en plaat ze op 0,1% gelatine bedekte 6-well platen in 2 ml EB medium en EBS handhaven differentiatie gedurende 20 dagen.
    8. Veranderen 2 ml vers EB medium om de twee dagen.
  4. qRT-PCR voor Gene Expression Analysis
    1. Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen iPSC-medium met 10 ng / ml bFGF.
    2. Extract totaal RNA van PBMNCs, iPSCs of EBS gebruik 1 ml commercieel reagens volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Evalueer RNA concentratie en zuiverheid geschikte werkwijzen zoals het gebruik van een spectrofotometer (hoge kwaliteit RNA A 260 / A 280 en A 260 / A 230-verhoudingen> 1,8) 27.
    4. ControleerRNA integriteit met behulp van een commerciële kit volgens de fabrikant protocol (hoge kwaliteit RNA RQI> 9,5) 28.
    5. Voer een reverse transcriptie reactie op 1 ug totaal RNA met behulp van een commercieel reverse transcriptase kit volgens instructies van de fabrikant.
    6. Bereid de qPCR mengsels die 5 ng cDNA sjabloon, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 pl van 5 uM primers (voorwaarts: 1 ui en achteruit: 1 pl) en 6 ui van RNase / DNase-vrij water voor elke reactie 29.
    7. Voer de qRT-PCR met het volgende programma: een initiële denaturatiestap bij 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli bestaat uit een denaturatie stap bij 95 ° C gedurende 15 sec en primer annealing en verlenging stap bij 60 ° C gedurende 45 29 sec.
    8. Normaliseren van de expressie van andere genen met GAPDH als housekeeping gen 28 (zie de in tabel 1 vermelde primers).
  5. qPCRvoor Transgene Uitsluiting
    1. Extraheer DNA uit PBMNCs of iPSCs gebruik 1 ml lysis buffer bevattende 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 20 ug / ml proteïnase K.
    2. Voeg een gelijk volume (1 ml) van 100% isopropanol, meng door inversie driemaal om DNA precipitatie en centrifugeer bij 10.000 xg laat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder het supernatant, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig en gooi het supernatant en resuspendeer in RNase / DNase-vrij water.
    4. Evalueer DNA concentratie en zuiverheid geschikte werkwijzen zoals het gebruik van een spectrofotometer (hoge kwaliteit RNA A 260 / A 280 en A 260 / A 230-verhoudingen> 1,8) 27.
    5. Bereid de qPCR mengsels die 5 ng DNA template, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 pl van 5 uM primers (voorwaarts: 1 ui en achteruit: 1 pl) en 6 &# 181; l van RNase / DNase-vrij water voor elke reactie 29.
    6. Normaliseren van de expressie van specifieke episomaal plasmide EBNA-1 gen met behulp FBX-15 als huishoudgen 29 (zie tabel 1 opgesomde primers).
  6. Karyotype Analyse
    1. Cultuur iPSC kolonies 5-6 dagen op voedingsvrije basaalmembraan matrix beklede plaat met een commercieel gedefinieerd voedingsvrije onderhoudsmedium voor iPSCs, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Om het karyotype analyse protocol begint los iPSC kolonies met 1 ml cel onthechting oplossing gedurende 5 minuten bij 37 ° C, tot het verkrijgen eencellige dissociatie.
    3. Verzamel cellen en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Resuspendeer iPSCs in 2 ml van een medium speciaal ontwikkeld voor het kweken van cellen voor prenatale diagnostiek. Plate eencellige iPSCs op basaalmembraan matrix gecoate glazen schalen en incubeer ze in een 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> incubator.
    5. Na 2-4 dagen, voeg 10 ul / ml colchicine direct aan de kweken en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
    6. Zuig het medium en incubeer iPSCs in 1 ml van een hypotone oplossing (0,6% natriumcitraat en 0,13% kaliumchloride) gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    7. Spoel de cellen met 1 ml van 5% azijnzuuroplossing en bevestig iPSCs met methanol / azijn- zuuroplossing (verhouding 3: 1) in een machine met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid (28 ° C, 42% rH).
    8. Dompel en vlek vaste cellen met Quinacrine oplossing voor 15-20 min bij kamertemperatuur in het donker 30 (Q-banding te verkrijgen).
    9. Verwerven cel metafasen onder een fluorescentiemicroscoop bij 100X vergroting 29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit onderzoek werd een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van virale free iPSCs door herprogrammering van PBMNCs geïsoleerd uit bevroren buffy coats na volbloed centrifugeren en vergelijking met herprogrammering van PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding wordt gerapporteerd. Figuur 1A toont een schematische weergave van de gedetailleerde protocol. Na ontdooien de geïsoleerde PBMNCs, dat een typische ronde vorm, geëxpandeerd specifieke bloed kweekmedium 14 dagen (Fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In het verleden was de enige weg om humane pluripotente stamcellen die een bepaalde genetische mutatie te verkrijgen, omdat de ouders die een pre-implantatie genetische diagnose werven en het genereren embryonale stamcellen uit hun afgedankte blastocysten 31,32. Met behulp van een herprogrammering aanpak kunnen onderzoekers nu genereren iPSCs van patiënten dragen vrijwel elk genotype. De mogelijkheid te gaan van een patiënt-specifieke cellijn een gemakkelijk toegankelijke bron van groot belang omdat daarmee e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Volksgezondheid en het Departement van Educatieve Bijstand, Universiteit en Onderzoek van de Autonome Provincie Bolzano en de Zuid-Tiroler Sparkasse Stichting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic TubeTerumoVF-054SBCS07
Ammodium chlorideSigma-AldrichA9434
Potassium bicarbonateSigma-Aldrich60339
EDTA disodium powderSigma-AldrichE51340,5 M oplossing
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02Polysucrose oplossing voor dichtheidsgradient centrifugatie
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) Gibco21056-023Geen fenolrood
Ham's F-12Mediatech10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco119050311X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Eindconcentratie van 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)R&D Systems 287-TC-5002 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone Sigma-AldrichD29151 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-TransferrinR&D Systems 2914-HT100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016Medium voor cytogenetische analyse
mTeSR1StemCell Technologies5850Medium voor feeder-free iPSC-cultuur
Knockout DMEMGibco10829-018
Knockout Serum ReplacementGibco10828-028
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Gibco15140-122
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140-050
2-Mercaptoethanol Gibco31350-0100,1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium ButyrateSigma-AldrichB58870,25 mM (Stock: 0,5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa R&D Systems 4114-TC10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochlorideSigma-AldrichY0503 10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine SerumHycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0,1% Gelatin SolutionMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor ReducedBD Biosciences354230
Collagenase, Type IVGibco17104-0191 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Celafscheidingsoplossing
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cellen/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 µg (Stock: 1 µg/&/micro;l)
Plasmid pCXLE-hSKAddgene 270781 µg (Stock: 1 µg/&/micro;l)
Plasmid pCXLE-hULAddgene 270801 µg (Stock: 1 µg/&/micro;l)
Plasmid pCXLE-EGFPAddgene 270821 µg (Stock: 1 µg/&/micro;l)
Alkaline Phosphatase Staining KitStemgent00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) AntibodyMerck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 AntibodyMerck-MilliporeMAB43601/250
Anti-TRA-1-81 AntibodyMerck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anti-Nanog AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anti-Troponin I AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) AntibodySigma-AldrichA77321/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) AntibodyCovance Research Products Inc MMS-435P-1001/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyCalbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Molecular ProbesA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Goat

Referenties

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657(2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565(2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mononucleaire cellen uit perifeer bloedisolatie van de buffycoatniet integrerende herprogrammeringelektroporatie transfectievoederlagen van embryonale muisfibroblastenimmunofluorescentieanalysemeting van genexpressiekosteneffectief protocol
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.