Dit protocol beschrijft de detectie van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in levensmiddelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Antibioticaresistentie is een van de grootste bedreigingen voor de gezondheid in de 21ste eeuw. De verwerving van resistentiegenen via laterale genoverdracht is een belangrijke factor in de verspreiding van diverse resistentiemechanismen. Onder de DNA-elementen die laterale overdracht vergemakkelijken, zijn de klasse 1-integrons grotendeels verantwoordelijk voor de verspreiding van antibioticaresistentiedeterminanten onder gramnegatieve ziekteverwekkers. In totaal hebben deze integrons meer dan 130 verschillende antibioticaresistentiegenen verworven en verspreid. Met het voortgezette gebruik van antibiotica zijn klasse 1-integrons alomtegenwoordig geworden in commensaal en pathogeen micro-organismen van mensen en hun gedomesticeerde dieren. Als gevolg hiervan zijn ze nu te vinden in alle menselijke afvalstromen, waar ze nieuwe genen blijven verwerven en het potentieel hebben om via de voedselketen terug te keren in de mens. Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde benadering voor het detecteren van klasse 1-integrons en hun geassocieerde resistentiegencassettes in levensmiddelen, met behulp van cultivering en PCR. Met behulp van dit protocol zouden onderzoekers in staat moeten zijn om: monsters te verzamelen en voor te bereiden om verrijkte culturen te maken en te screenen op klasse 1-integrons; enkele bacteriekolonies te isoleren om integron-positieve isolaten te identificeren; bacteriesoorten te identificeren die klasse 1-integrons bevatten; en deze integrons en hun geassocieerde gencassettes te karakteriseren.
Inleiding
De ontdekking van antibiotica was een van de grootste wetenschappelijke prestaties van de 20 ste eeuw. Echter, het gebruik en misbruik van antibiotica heeft geleid tot de snelle evolutie van antibiotica resistente bacteriën, en die nu een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in de 21e eeuw poseren. De opkomst van bacteriestammen resistent tegen de meeste behandelingen verhoogt de mogelijkheid we betreden een tijdperk waarin antimicrobiële geneesmiddelen zijn niet langer effectief 1,2.
De genetische machines die antibiotica-resistentie is een oud systeem, die dateren van vóór de mens en antibiotische....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Levensmiddelen die rauw worden gegeten of licht gekookt zijn van de meeste zorg voor de gezondheid van de mens. Voorbeelden zijn salade groenten, fruit, schaal- en schelpdieren.
1. Sample Collection
- Verzamel monsters onder omstandigheden die verontreiniging te minimaliseren, en in afzonderlijke, schone zakken tijdens het transport. Eenmaal verzameld moeten de monsters worden bewaard bij 4 ° C en binnen 24 uur.
2. Verrijkte Cultuur Voorbereiding
- Fruit en groenten:
- Leg ongeveer 10 g materiaal in een duurzame plastic zak. Indien voor grotere materiaal, concentreren op de schil....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Screening van gemengde culturen en bacteriële isolaten van intI1
Primerpaar HS463a / HS464 PCR kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de klasse 1 integron-integrase gen, intI1 (figuur 1) te detecteren. Deze primer set werkt goed voor het detecteren intI1 in gemengde culturen, en wordt ook gebruikt om bacteriële kolonies geoogst uit platen uitgespreid (figuur 2) te screenen. Positieve isolaten moet een sterke band te genereren bij 471 bp me.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De identificatie van integronen en de bijbehorende gen cassettes is potentieel een belangrijke stap in het voorspellen van de opkomst van nieuwe opportunistische pathogenen, tracking paden voor ziekteverwekkers in de menselijke voedselketen, en het identificeren van nieuwe weerstand en virulentiedeterminanten 8,21,26. Het doel van dit artikel was om een gestroomlijnde aanpak voor het screenen van monsters voor klasse 1 integronen, het karakteriseren van de cassette arrays en het identificeren van de soorten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets relevant te onthullen.
Dankbetuigingen
Dankzij Michaela Hall, Larissa Bispo en Gustavo Tavares voor technische bijstand.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Gebruikt in alle PCR's |
| RNAse (Ribonuclease A uit runderpancreas) | Sigma | R6513-10MG | Gebruikt in alle PCR's |
| HinFI restrictie-enzym | Promega | R6201 | Wordt gebruikt om 16S rDNA PCR-producten te verteren. Enzym wordt geleverd met optimale buffer en BSA |
| 100 bp ladder | GE Healthcare | 27400701 | Wordt gebruikt als maatstandaard op alle agarosegels |
| GelRed DNA-kleurstof | Biotium | 41003 | VOORZICHTIG: Persoonlijke bescherming moet worden gedragen bij het hanteren van dit materiaal |
| Guanidiniumthiocyanaat | Life Technologies | AM9422 | VOORZICHTIG: Persoonlijke bescherming moet worden gedragen bij het hanteren van dit materiaal |
| CLS-TC-oplossing | MP Biomedicals | 6540409 | Resuspenderingsoplossing die wordt gebruikt aan het begin van de genomische DNA-extractie |
| Lysing Matrix E FastPrep-buizen | MP Biomedicals | 116914500 | Buis die nodig is voor mechanische vernietiging van bacteriële celwanden. Deze code wordt gebruikt voor verpakkingen van 500 buizen, kleinere hoeveelheden zijn beschikbaar. |
| Bindingsmatrix | MP Biomedicals | 116540408 | Verdund 1:5 met 6 M guanidiniumthiocyanaat en gebruikt in de genomische DNA-extractiemethode. |
| Fast Prep-machine | MP Biomedicals | Aantal beschikbare opties | MP Biomedicals heeft een aantal FastPrep-machines beschikbaar om te kopen. Bezoek http://www.mpbio.com voor meer informatie |
Referenties
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
