Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

15.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52894

⸱

28 januari 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Samenvatting

Adenovirale vectoren met hoge capaciteit (HCAdV) zonder alle virale coderende sequenties vertegenwoordigen een van de meest geavanceerde genoverdrachtsvectoren vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit (tot 35 kb), lage immunogeniciteit en lage toxiciteit. Echter, voor veel laboratoria wordt het gebruik van HCAdV belemmerd door de gecompliceerde procedure voor vectorgenoomconstructie en virusproductie. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor efficiënte kloontechniek en productie van HCAdV beschreven op basis van het plasmide pAdFTC dat het HCAdV-genoom bevat. De constructie van HCAdV-genomen is gebaseerd op een kloondevectorsysteem dat gebruik maakt van homing endonucleasen (I-CeuI en PI-SceI). Elk gen van belang tot 14 kb kan worden subgekloond in de shuttlevector pHM5, die een meervoudig kloonsitus bevat dat wordt geflankeerd door I-CeuI en PI-SceI. Na het I-CeuI en PI-SceI-gemedieerde vrijgeven van het transgen uit de shuttlevector kan het transgen worden ingebracht in de HCAdV-kloondevector pAdFTC. Vanwege de grote omvang van het pAdFTC-plasmide en de lange herkenningsplaatsen van de gebruikte enzymen geassocieerd met sterke DNA-binding, is zorgvuldige behandeling van de kloondefragmenten noodzakelijk. Voor virusproductie wordt het HCAdV-genoom vrijgegeven door NotI-digest en getransfecteerd in een HEK293-gebaseerde produceercellijn die stabiel Cre-recombinase tot expressie brengt. Om alle adenovirale genen te bieden voor adenovirusamplificatie, is co-infectie met een helpervirus dat een pack-signaal bevat dat wordt geflankeerd door loxP-plaatsen vereist. Pre-amplificatie van de vector wordt uitgevoerd in produceercellen die op oppervlakken worden gekweekt en grootschalige versterking van de vector wordt uitgevoerd in spinnerkolven met produceercellen die in suspensie worden gekweekt. Voor viruszuivering worden twee ultracentrifugeringsstappen op basis van cesiumchloride-gradiënten uitgevoerd, gevolgd door dialyse. Hier worden tips, trucs en shortcuts gepresenteerd die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld tijdens het werken met dit HCAdV-vectorsysteem.

Inleiding

Bij gentherapie toepassingen is het van groot belang cytotoxische en immunogene bijwerkingen veroorzaakt door expressie van virale proteïnen, het transgen zelf of binnenkomende virale eiwitten voorkomen. Adenovirusvectoren (AdV) worden veelvuldig gebruikt om vreemd DNA te introduceren in een grote verscheidenheid van cellen om het effect van transgenexpressie 1,2 onderzoeken. De meest geavanceerde versie van AdV wordt vertegenwoordigd door hoge capaciteit adenovirus vectoren (HCAdV) ontbreken alle virale coderende sequenties 3,4 en biedt daarmee een verpakking capaciteit tot 35 kb in combinatie met een lage immunogeniciteit en lage toxiciteit 5-8. Vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit ze laten leveren van grote of meerdere transgenen met een enkele dosis vector. Daarom, zij vertegenwoordigen een waardevol instrument voor de onderzoeksgemeenschap.

In tegenstelling tot de eerste of tweede generatie AdV zonder de vroege genen E1 en / of E3 die eenvoudig kunnen worden geproduceerd met behulp van commerciële kits, vector genoom bouw en virus productie van HCAdV is complexer. Het systeem voor de constructie van HCAdV genomen is gebaseerd op het plasmide pAdFTC met een HCAdV genoom zonder alle virale coderende sequenties en shuttle plasmide pHM5 9-12. Elk gen van belang tot 14 kilobasen (kb) worden gekloneerd in de shuttle vector pHM5 waarbij de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door herkenning / splitsen plaatsen van de homing endonucleasen PI- Sce I I- Ceu I. Daarom kan een gekloneerd gen van interesse worden vrijgegeven door opeenvolgende PI- Sce I en I Ceu I digesteert voor daaropvolgende gerichte insertie in dezelfde restrictieplaatsen aanwezig in het genoom HCAdV in het plasmide pAdFTC. In pAdFTC de transgene insertieplaats tussen de PI- Sce I en I Ceu I splitsingsplaatsen wordt geflankeerd door DNA stuffer en de coderende adenovirale sequenties die vereist zijn voor genoom verpakken als de 5 'en 3' omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR's)aan beide uiteinden en het verpakkingssignaal stroomafwaarts van het 5'ITR. De extra DNA stuffer een optimale grootte van de uiteindelijke HCAdV genoom variëren van 27 tot 36 kb efficiënte verpakking tijdens virusproductie te waarborgen. Aangezien pAdFTC is een groot plasmide met tot 45 kb (afhankelijk van de grootte van het ingebrachte transgen) en het gebruik van homing endonucleases naar verhouding lange verwijzingen DNA herkenning vertoont sterke DNA bindende verscheidene opschonen stappen nodig tijdens de overdracht van het transgen uit pHM5 naar pAdFTC. Zorgvuldige behandeling vermijden van schuifkrachten wordt aanbevolen.

De ITR's van de HCAdV genoom geflankeerd door NotI restrictie-enzym herkenningsplaatsen direct stroomopwaarts van het 5'ITR en stroomafwaarts van de 3'ITR 12. Daarom kan HCAdV worden vrijgegeven door Notl digest voor daaropvolgende transfectie van het virale genoom in de HCAdV producerende cellijn. Merk op dat het gebruik van het restrictie-enzym Notl voor relgemak van het virale genoom van het plasmide pAdFTC impliceert dat de ingebrachte transgen mist NotI DNA herkenningsplaatsen. De HEK293 cellen gebaseerde producerende cellen (116 cellen) stabiel uitdrukken Cre recombinase. Voor virus amplificatie 116 cellen zijn co-geïnfecteerd met een helper virus (HV) het verstrekken van alle AdV genen die nodig zijn voor replicatie en verpakken in trans 3,4. De HV is een eerste generatie AdV met een floxed verpakking signaal dat tijdens virusreplicatie door Cre recombinase tot expressie gebracht in 116-cellen 4 wordt verwijderd. Dit zorgt ervoor dat voornamelijk HCAdV genomen met een intacte inpaksignaal worden ingekapseld.

Pre-amplificatie van het HCAdV wordt uitgevoerd door het uitvoeren van seriële passage in stappen 116 cellen gekweekt op oppervlakken in weefselkweekplaten. Na elke doorgang virusdeeltjes vrijkomen uit geïnfecteerde cellen door het uitvoeren van drie achtereenvolgende vries- dooi stappen. Bij elke passage steeds meer cellen worden besmet met1/3 cellysaat van de voorgaande passage. Tenslotte lysaat uit de laatste pre-amplificatiestap wordt gebruikt om producerende cellen gekweekt in suspensie in een spinner fles voor grootschalige amplificatie infecteren. Virionen gezuiverd uit de celsuspensie door het uitvoeren van ultracentrifugatie in een cesium chloride dichtheidsgradiënt 4,12. Met deze procedure lege deeltjes volledig geassembleerd deeltjes worden gescheiden in twee afzonderlijke banden. Om verder te concentreren de HCAdV deeltjes een tweede niet-geleidelijke ultracentrifugatie stap wordt uitgevoerd. Vervolgens werd de verkregen band met de HCAdV verzameld en gedialyseerd tegen een fysiologische buffer. Vector laatste voorbereidingen worden gekenmerkt met betrekking tot de aantallen absolute virusdeeltjes, besmettelijke deeltjes en HV besmetting niveaus. Absolute virale deeltjes kan worden bepaald door het lyseren van virusdeeltjes en meten van de absorptie bij 260 nm of door het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 12. Besmettelijkheid van de purified virusdeeltjes kan worden bepaald door qPCR meten HCAdV genomen aanwezig in geïnfecteerde cellen 3 uur na infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Constructie van recombinante HCAdV Genomes basis van het Plasmid pAdFTC

Opmerking: Alle plasmiden zijn eerder beschreven 11,12 en zijn beschikbaar op aanvraag. De klonering procedure is schematisch weergegeven in figuur 1.

  1. Kloon een gen van belang (GOI) omvattende promoter en polyadenylatiesignaal (pA) in het shuttleplasmide pHM5, met een kloneringsstrategie keuze te pHM5-GOI genereren.
    OPMERKING: Omdat pAdFTC een relatief groot plasmide, worden klassieke plasmidebereiding protocollen aanbevolen afschuiving van het plasmide-DNA vermijden door commerciële plasmidezuivering kits die zijn gebaseerd op silica membranen. I- Ceu I en PI -Sce ik sterk binden aan het DNA en verander de elektroforetische mobiliteit van DNA verteerd. Daarom is een fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie (stap 1,3) nodig voor agarosegelelektroforese.
  2. Digest 20 ug PHM5-GOI en 10 ug pAdFTC door I-CeuI (10 U) gedurende 3 uur bij 37 ° C in een totaal volume van 100 pl aan lineariseren plasmiden (~ 2,8 kb + GOI ORF sequentie en ~ 31KB respectievelijk).
  3. Zuiver lineair gemaakte plasmiden behulp fenol- chloroform extractie gevolgd door ethanol (EtOH) neerslag 13.
    1. Voeg 100 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol en meng voorzichtig door het buisje meerdere malen. Centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g.
    2. Breng de bovenstaande vloeistof over in een nieuwe buis, voeg 20 ul natriumacetaat (pH 5, 3 M) en 400 pl ijskoude EtOH (99,8%) en meng suspensie krachtig. Centrifugeer 10 minuten bij 15.000 x g.
    3. Verwijder het supernatant, voeg 300 pl 70% EtOH en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Verwijder supernatant en de lucht drogen DNA pellet. Los het pellet bij 10- 20 ui dH 2 O. Droog geen DNA-pellet te lang, omdat het moeilijker zal zijn om DNA te krijgen in oplossing.
  4. Digest I-Ceu I gedigereerd pHM5-GOI en pAdFTC plasmide uit stap 1,3) gedurende ten minste 3 uur of O / N met de restrictie-enzym PI -Sce I (10 U) bij 37 ° C in een totaal volume van 50 pl en vervolgens zuiveren I -CeuI en PI -Sce I gedigereerd plasmide behulp fenol- chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (zie stap 1,3). Los DNA in 20 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  5. Aparte pHM5 plasmideskelet (2,8 kb) en de Indiase overheid (uit stap 1.4) op een preparatieve agarosegel en gel-zuiveren van de Indiase overheid met behulp van een commercieel gel- en PCR clean-up kit. Een vertegenwoordiger agarosegel van het digest wordt getoond in figuur 2A.
  6. Defosforyleren I- Ceu I en PI -Sce gedigereerde pAdFTC (uit stap 1.4) met Calf Intestinal Alkaline fosfatase CIP (10 U) gedurende 1 uur bij 37 ° C in een totaal volume van 25 pl en zuiveren gedefosforyleerd plasmide pAdFTC door fenol-chloroform extractie en daaropvolgende EtOH precipitation (stap 1,3). Elueer DNA in 20 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  7. Voer analytische gelelektroforese uit een hoeveelheid van het gedefosforyleerde pAdFTC plasmide (uit stap 1.6) en het gezuiverde GOI-fragment (uit stap 1.5) te analyseren of monsters niet voltooid en de groottes van de verwachte fragmenten correct (zijn ~ 31 kb van gelineariseerde pAdFTC ).
    Opmerking: De grootte van het GOI is variabel afhankelijk van de grootte van de transgene expressiecassette. Schat de relatieve concentraties van de respectievelijke fragmenten voor daaropvolgende ligatie. Een vertegenwoordiger agarosegel gezuiverd fragmenten is getoond in figuur 2B.
  8. Stel de ligatiereactie in een totaal volume van 20 ul gebruikt 400 U T4 DNA ligase en een molaire verhouding van vector in te voegen van 1: 3.
    Opmerking: In overeenstemming met de agarosegel figuur 2B we meestal ligeren in een totaal volume van 20 ul met 2 tot 6 pl vector, 8- tot 12 glinvoegen en 400 U van T4 DNA ligase. Aangezien de DNA-concentratie is doorgaans laag na enkele phenolization stappen gebruiken zoveel DNA mogelijk, zodat geen extra H2O moet worden toegevoegd aan het eindvolume van 20 pl te bereiken. Ligeren bij 16 ° CO / N en vervolgens uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (stap 1,3).
    1. Elueer DNA in 15 ul nuclease-vrij dH 2 O en verteren het gezuiverde ligatiereactie met het restrictie-enzym Swal (10 U) gedurende 2 uur bij 25 ° C in een totaal volume van 20 pl. Dan concentreren en zuiveren van DNA, door het uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door precipitatie met EtOH (stap 1,3). Elueer DNA in 10 ul nuclease-vrij dH 2 O.
  9. Transformatie 2 ui van het gezuiverde SwaI gedigereerd ligatieproduct door elektroporatie in DH10B electrocompetente DH5a of E. coli en selecteer klonen gedurende 16 tot 24 uur bij 37 ° C op ampicilline bevattende LBplaten (50 mg / ml ampicilline). Selecteer 5- 10 klonen en bereiden plasmide DNA mini-preparaten gebruikt alkaline lysis gevolgd door fenol-chloroform extractie en EtOH precipitatie daarop (stap 1,3) 13.
  10. Voer een analytische digest van plasmide mini-preparaten, gevolgd door agarosegelelektroforese om de grootte van DNA fragmenten controleren. Suggereerde restrictie-enzymen zijn bijvoorbeeld I- Ceu I en PI-Sce ik het loslaten van de insert, Spe I en Hinc II (figuur 2C).
  11. Amplify een correcte kloon ampicilline bevattende LB-medium (50 mg / ml ampicilline) en voer een midi- of maxi-plasmidepreparaat met elke commercieel verkrijgbare plasmide zuiveringskit.

2. Vrijgave van HCAdV-genoom van pAdFTC Plasmid en Voorversterking van HCAdV vectoren in de Producer Cell Line 116

  1. Digest 20 ug van het pAdFTC-gebaseerde adenovirale productie plasmide dat het gekloneerde GOI uit stap 1,11) ineen totaal volume van 100 pl met behulp Not I (20 U) bij 37 ° C gedurende> 2 uur en uitvoeren van fenol-chloroform extractie gevolgd door tweemaal EtOH precipitatie. Oplossen in 20- 30 ul steriele dH 2 O.
  2. Controleer een portie van 1:10 verdund verteerd pAdFTC-GOI-DNA door gelelektroforese. Een 9 kb fragment van de plasmide ruggengraat en, afhankelijk van de grootte van het GOI, een tweede DNA-fragment voor HCAdV genoom (size: 28- 36 kb) detecteerbaar.
    LET OP: Een representatief voorbeeld van de Not I digest wordt weergegeven in figuur 2D. Gelineariseerd DNA kan enkele dagen bewaard bij 4 ° C of bij -20 ° C gedurende enkele weken.
  3. Voordat u verder gaat met het protocol, zorg ervoor dat de helper virus AdNG163R-2 is versterkt 4.
    Opmerking: cellen die met pAdFTC HCAdV afgeleide vectoren zijn genetisch gemodificeerde organismen die als Biosafety Level 2 (BSL-2), dan kunt u gebruik maken van de juiste insluiting en afvalverwerkingmaatregelen, met inbegrip van persoonlijke beschermingsmiddelen, en werken onder BSL-2 afzuigkappen met laminaire stroming.
  4. Cultuur 116 cellen in MEM Eagle medium aangevuld met 10% FBS en hygromycine B (100 gg / ml). Seed lage passage (passage 10 hieronder) 116 cellen (~ 0.4x 10 6 cellen) in een 60 mm weefselkweekplaat één dag voor transfectie, zodat zij 50- 80% confluentie de volgende dag te bereiken.
  5. Transfectie gelineariseerd HCAdV genoom van stap (2.1) in 116 cellen door gebruik van werkwijzen, zoals calciumfosfaat transfectie of andere commercieel verkrijgbare transfectie reagentia (Figuur 3A). 16- 18 uur na transfectie, verwijder het medium, voeg 3 ml vers medium (MEM, 5% FBS) en cellen infecteren met HV AdNG163R-2 4 5 aanbrengen transducerende eenheden (TU) per cel (aangezien een confluente 60 mm weefselkweek schotel bevat ~ 3,2x 10 6 cellen, voeg ~ 1,6x 10 7 TU van HV).
    1. Beweeg het gerecht elke 20 min gedurende het eerste uur na infectiezorgen voor gelijke HV distributie. Telen geïnfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Bij efficiënte virusreplicatie cytopathisch effect (CPE) als gevolg van virusreplicatie (cellen afgerond en losjes verbonden of losgemaakt van de weefselkweekschaal) wordt waargenomen 48 uur na infection.If CPE waargenomen eerder de hoeveelheid HV te verlaagd. Als CPE begint later, meer helpervirus te gebruiken.
  6. Oogst cellen waaronder supernatant 48 uur na infectie door spoelen van de cellen van de kweekschaal met het kweekmedium. Cellen die zijn opgehangen in hun kweekmedium worden passage genoemd 0 (P0). P0 gesplitst in twee fracties.
    1. Uit 0,5 ml van de losgemaakte cellen spin down de cellen gedurende 3 min bij 2000 x g en verwijder medium uit de cel pellet, die later gebruikt voor het isoleren van genomisch DNA (gDNA) voor qPCR gebaseerde analyse van het amplificatieproces. WINKEL celpellets bij -20 ° C tot verdere verwerking.
    2. Uit 2,5ml van de losgemaakte cellen los virale deeltjes door bevriezing (bij -80 ° C of in vloeibare stikstof) en ontdooien (bij kamertemperatuur of in een 37 ° C waterbad) de cellen die resupended in het medium 3-4 keer. Deze fractie is dan heet lysaat van P0.
  7. Zorg dat weefselkweekschalen met 116 cellen die zijn gekweekt tot 90- 95% confluentie gebruikt MEM-medium aangevuld met FBS (10%) en hygromycine B (100 gg / ml) en HV beschikbaar voor de volgende passage stappen.
  8. Meng 1 ml vers medium (MEM, 5% FBS) met 2,5 ml van het lysaat van de vorige passage (stap 2.6.2) tot een eindvolume van 3,5 ml, voeg HV toepassen 2 TU per cel (omdat een 60 mm tissue cultuur schotel bij een confluentie van 90- 95% bevat ~ 3,2x 10 6 cellen, voeg ~ 6,4x 10 6 TU van HV). (Figuur 3B). Haal het medium van een 60 mm schaal van 116 cellen en voeg het virale mengsel aan de cellen. Herhaal stap 2.6) - 2.8) tweemaal lysaten van pas te verkrijgenleeftijden P1 en P2.
  9. Meng 17,5 ml vers medium (MEM, 5% FBS) met 2,5 ml van het lysaat van P2 en voeg HV toepassen 2 TU per cel (omdat een 150 mm weefselkweek schotel bij een confluentie van 80- 100% bevat ~ 2x 10 7 cellen, voeg ~ 4x 10 7 TU van de HV). Verwijder het medium uit een 150 mm schaal van 116 cellen te infecteren en cellen met het virale mengsel. Telen geïnfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
  10. 48 na infectie oogsten cellen zoals beschreven in stap 2,6) om doorgang P3 (figuur 3B) te verkrijgen.
    1. Herhaal stap 2,6) 1.
    2. Uit hetgeen 19,5 ml P3 afgifte virale deeltjes uit de resupended cellen door invriezen en ontdooien 3-4 keer. Deze fractie is dan heet lysaat van P3.
      Opmerking: Sommige vectoren kunnen eventueel extra passages nodig in 150 mm gerechten totdat ze voldoende worden versterkt. Daarom effectiviteit van de pre-amplificatie proces moet in serie pas worden bewaaktveroudering. qPCR gebaseerde analyse van de versterking proces kan worden uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 3 (zie ook figuur 4A). Pre-amplificatie van HCAdV dragen een expressiecassette voor groen fluorescent eiwit (GFP) kan gemakkelijk worden geëvalueerd door het observeren van het GFP flourecscent signaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Figuur 4B).

3. Monitoring van de Amplification proces met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) (zie ook figuur 4A).

  1. Isoleer gDNA van celpellets uit elke passage van de preamplifaction (stap 2,6) - 2,10) met elke commerciële DNA isolatie kit voor isolatie van gDNA uit gekweekte cellen of andere voorkeurswerkwijze. Voor optimale PCR resultaat gebruik gDNA zo vers mogelijk. Anders gDNA kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.
  2. Om het aantal HCAdV genomen aanwezig in de cellen van de respectieve passage door qPCR analyse volgens genereren van een standaardkromme met gebruikmaking van 10 1 </ sup> - 10 9 exemplaren van een plasmide dat de Indiase overheid in de HCAdV genoom.
  3. Analyseer evenveel gDNA van P0- P3 (stap 2,6-2,10) aanbrengen qPCR middels 400 nM van primers specifiek voor het GOI in de HCAdV genoom. Instructies voor het uitvoeren van respectievelijke chemische qPCR qPCR follow fabrikant. Stel de qPCR programma als volgt: pre-incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie in 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 s, 55- 60 ° C gedurende 15 s en 72 ° C gedurende 20 s. Op basis van de standaardcurve het aantal HCAdV genomen in de reactie kan worden geïnterpoleerd.

4. Grootschalige Versterking van HCAdV vectoren in 116 cellen in suspensie te groeien

  1. Voeg 900 ml voorverwarmd (37 ° C) vers MEM gesupplementeerd met 10% FBS en hygromycine B (100 ug / ml) in een 3 l spinner kolf (Figuur 3B).
  2. Verwijder medium uit ten minste 10 afzonderlijke 150 mm weefselkweekschalen met 116 cellen gekweekt bij een confluentie van 90- 100% en spoel af cellen met 10 ml verse voorverwarmde (37 ° C) MEM aangevuld met FBS (10%) en hygromycine B (100 ug / ml) met behulp van een serologische pipet. Pipet op en neer meerdere malen om een ​​homogene celsuspensie te krijgen. Transfer cellen direct in de spinner fles al met 900 ml van stap 4.1).
    Opmerking: Gebruik geen trypsine / EDTA als het negatieve groei van suspensiecellen kunnen beïnvloeden. Na verwijdering van medium onmiddellijk over cellen in de spinfles. Raak hoogste twee weefselkweekschalen tegelijk. Hoe langer de wachttijd na het toevoegen van vers medium hoe moeilijker het zal zijn om de cellen van de kweekschaal losgemaakt weefsel.
  3. Om optimale celgroei Incubate spinfles zorgen op een magnetische roerder in een weefselkweek incubator gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Stel de magneetroerder tot 70 rpm tot hechting van de cellen te voorkomen de glasoppervlakken.
  4. Monitor celgroei in spinner kolf om te onderzoeken of cellen gekweekt in de spinner kweekkolf levensvatbaar zijn en of ze groeien tot voldoende hoeveelheden. Telkens voorafgaand aan het toevoegen van vers medium overdracht 2 ml van de bioreactor tot een 60 mm weefselkweekplaat. Let celmorfologie onder een microscoop.
    Opmerking: Cellen vormen klonten drijvend in het kweekmedium geven optimale groei en levensvatbaarheid (zie figuur 4C). Na 24 uur ze vormen kolonies op het oppervlak van de weefselkweekschaal. 30- 50% confluentie geeft optimale dichtheid.
  5. 24 uur na het opzetten van de spinner kolf voeg 500 ml vers medium (MEM, 10% FBS) aangevuld met hygromycine B (100 gg / ml). 24 uur later deze stap te herhalen.
  6. 72 uur na het opzetten van de spinner kweek, voeg 1000 ml vers MEM-medium (10% FBS) met hygromycine B (100 gg / ml) resulterend in een totaal volume van 3 L celsuspensie.
  7. 24 uur na het bereiken avolume drie liter, oogst 116 suspensie cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 500 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Houd de geleegde spinner kolf onder de weefselkweek kap.
  8. Resuspendeer celpellets in vers MEM aangevuld met 5% FBS door en neer te pipetteren ongeveer 8- 10 keer een homogene celsuspensie krijgen. Het volume drager afhankelijk van of lysaat uit stap 2,10) 2. (19,5 ml, zie stap 4.8) 1. optie a) of een gezuiverde virale voorraad van HCAdV uit stap 5.9) 2. (meerdere ui depanding op virale titer, zie stap 4.8) 2., optie b) wordt gebruikt voor infectie van de cellen. Gebruik een totaalvolume van 150 ml.
    1. Optie A: Voor de infectie van 116 suspensiecellen met lysaat van P3 (primaire versterking) overdracht cellen van stap 4.8) in een 250 ml fles opslag uitgerust met een steriele magnetische roerstaaf of 250ml kleinschalig centrifugekolf en co-infecteren cellen met het virus in het lysaat van P3 (stap 2.10.2) en 2 TU van HV per cel. Uitgaande van een dichtheid van 3 x10 5 cellen per ml, het totale aantal cellen is 9x 10 8 cellen. Zo voegen 1,8x 10 9 TU van de HV.
    2. Optie B: Voor de infectie van 116 suspensiecellen met gezuiverd virale voorraad, overdracht cellen van stap 4.8) in een 250 ml fles opslag uitgerust met een steriele magnetische roerstaaf of 250ml kleinschalig centrifugekolf en co-infecteren cellen met de 100 virusdeeltjes per cel van vroeger gezuiverd HCAdV (van stap 5.9). 2). Zo voegen 9x 10 10 VP volgens fysieke titer (gemeten door absorptie bij 260 nm; stap 6) van het gezuiverde HCAdV en 1,8x 10 9 TU van de HV.
  9. Roer de cel-virus mengsel van september 4.8.1) of 4.8.2) in een magnetische roerder in de weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur bij 60 rpm. Zorg ervoor dat de opslag fles is niet volledig gesloten voor luchtcirculatie.
  10. 2 uur na infectie overbrengen het totale volume van de cel-virus mengsel terug in de 3 l spinner culture kolf en voeg 1850 ml verse voorverwarmde (37 ° C) MEM medium aangevuld met 5% FBS tot een totaal volume van 2 L en incuberen in de weefselcultuurincubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48 uur bij 70 rpm.
  11. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 890x g bij kamertemperatuur in 500 ml centrifugebuizen. Verwijder het medium en resuspendeer gepelleteerde cellen in een totaal volume van 28 ml van DPBS. Pipet op en neer om een ​​homogene cel suspensie te verkrijgen. Bevriezen van de cel-virus suspensie in vloeibare stikstof of bij -80 ° C om ervoor te zorgen dat de schorsing volledig bevroren. Bewaar de cel-virus suspensie bij -80 ° C totdat het starten van het virus zuivering.

5. Dialyse van HCAdV

  1. Virale lysaat van cesiumchloride (CsCl) gradiënten bereiden vries cel-virus suspensie uit stap 4,11) in vloeibare stikstof en ontdooien in een waterbad bij 37 ° C vier maal.
  2. Centrifugeer het virale lysaat bij 500 xg gedurende 8 minuten bij RT en verzamel de bovenstaande vloeistof met de HCAdV.
  3. Voor Ultracentrifugatie bereiden CsCl oplossingen follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm 3), 33,5 g (voor 1,35 g / cm 3) en 31,25 g (1,25 g / cm 3) respectievelijk CsCl poeder en vul met dH 2 O tot 25 ml.
    1. Roer tot oplossing wordt helder en steriele filter de oplossingen. Eindelijk verwijderen 1 ml van elke oplossing en wegen op een mooie schaal te controleren Of de dichtheid correct is. 1ml moet 1,5 g, 1,35 en 1,25 g respectievelijk gewicht.
    2. Als de dichtheid te hoog instellen door stapsgewijze toevoeging van kleine hoeveelheden (pl) steriel dH 2 O. Na toevoeging van dH 2 O opnieuw meten van de densiteit. Indien nodig voeg meer dH 2 O.
    3. Herhaal deze procedure totdat de dichtheid correct is. Als de dichtheid te laag is aan te passen door het toevoegen van kleine hoeveelheid CsCl poeder. Steriel filter het opnieuw en controleer de dichtheid. Als de dichtheid te hoog aan te passen door adding dH 2 O zoals hiervoor beschreven. Als de dichtheid is nog steeds te laag weer toe mor CsCl, steriel filter en controleer de dichtheid. Herhaal deze procedure totdat de dichtheid correct is.
  4. Bereid CsCl stap gradiënten in zes heldere ultracentrifuge buizen. Voorzichtig en langzaam pipet CsCl oplossingen in de buizen met de volgende volgorde: 0,5 ml van 1,5 g / cm 3 CsCl-oplossing, 3 ml van 1,35 g / cm 3 CsCl-oplossing en 3,5 ml van 1,25 g / cm 3 CsCl-oplossing (figuur 2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml geklaard vector supernatant van stap 5.2) op de top van de 1,25 g / cm3 CsCl laag. Centrifuge de gradiënten in een ultracentrifuge met een swing out rotor (SW-41) bij 12 ° C gedurende ten minste 2 uur bij 226.000 x g (35.000 rpm) met langzame versnelling en vertraging aparte HCAdV-genoom bevatten virale deeltjes uit lege deeltjes en mobiele puin.
    OPMERKING: Onder optimale condities een diffuse band van celresten formes bovenopde buizen. Hieronder twee witte banden kan worden waargenomen. De bovenste band bevat lege deeltjes, terwijl de onderste band is gelijk aan de HCAdV (Figuren 2C en 5A).
  6. Verwijder voorzichtig de lagen van celafval en lege deeltjes en laat 1 ml van de lagere banden van elke buis en overdracht virus met een schone pipetpunt in een steriele 50 ml buizen. Voeg tot 24 ml van 1,35 g / cm 3 CsCl oplossing voor de verzamelde virusdeeltjes en meng voorzichtig.
  7. Vul centrifugebuizen met 1,35 g / cm 3 CsCl-virusoplossing boven en centrifuge O / N (18 tot 20 h) bij 226.000 xg (35.000 rpm) bij 12 ° C in een ultracentrifuge met een swing out rotor (SW-41 ) met langzame versnelling en vertraging.
  8. Verzamel de HCAdV aanwezig in de prominente lagere band. Als een potentiële bovenste band bevat leeg te verwijderen bovenste lagen van de top met een pipet (zie figuren 2C en 5B) Vervolgens neemt u weg van de onderste band using een pipet.
  9. Dialyseer de verzamelde virusdeeltjes voor buffer-uitwisseling.
    1. Snij een strook dialysebuis (MWCO: 50.000) van ongeveer 8 cm, wassen met steriele dH 2 O driemaal. Sluit één zijde van de dialyse buis met een plastic klem en breng de verzamelde virus van stap 5,8) in buis met een 1 ml pipet. Vermijd luchtbellen in de slang en sluit het aan de andere kant met een plastic klem dialyse sluitingen.
    2. Dialyseer in 1 liter dialyse buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glycerol en 1 mM MgCl2 in gedeïoniseerd H2O) gedurende 2 uur bij 4 ° cwith langzaam roeren. Uitwisseling dialyse buffer met 2 l dialysebuffer en dialyze O / N bij 4 ° C onder langzaam roeren. U kunt ook gebruik maken van een sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 x2H 2 O, 1,5 mM KH 2 PO 4 en 730 mM sucrose, pH 7,8).
    3. Verzamel gedialyseerd virusdeeltjes uit stap 5.9) 2. met behulp van een 1 ml pipette. Bereid meerdere aliquots van de gewenste kleine hoeveelheden (25 tot 100 pi) en opslaan gezuiverd virus bij -80 ° C.

6. Het meten van de fysieke titer van Final HCAdV Voorbereidingen van optische dichtheid (OD)

  1. Verdun 25 ul van de uiteindelijke vector preparaat uit stap 5.9) 2 met 475 ul lysisbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), schud gedurende 20 min bij RT en tenslotte centrifugeer 2 minuten bij kamertemperatuur bij 15.000 x g.
  2. Aangezien de extinctie bij 260 nm (A260) zijn meestal lage, meet absorptie vier keer met 100 pl van het supernatant en berekent gemiddelde van de vier metingen. Bereken het aantal virusdeeltjes per ml (vp / ml -1) met de volgende formule: vp / ml -1 = (gemiddelde A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV grootte in kb ).
    OPMERKING: Resultaten van een typische opbrengst van absolute virale partikels (OD titer) getoond in figuur 7A . De ervaring leert, dat de OD titer overschat het aantal virusdeeltjes. Absolute virale deeltjes gemeten door OD kan 20- 100 maal hoger dan infectueuze virale deeltjes gemeten door Q-PCR. Voor meer nauwkeurige meting van absolte en besmettelijke HCAdV deeltjes evenals HV besmetting met Q-PCR te vinden in hoofdstuk 7.

7. Meten Totaal Deeltjes, infectieuze eenheden van de HCAdV en HV de besmettingsgraad van het Final Vector Voorbereiding door qPCR. Een schema van de titratie procedure is weergegeven in figuur 6

  1. Zaad HEK293 cellen in 6 of 12 well weefselkweek platen, zodat de cellen tot 90% confluentie op de volgende dag. Om het aantal infectieuze virusdeeltjes (infectieuze titer) bepalen infecteren cellen van een putje in een plaat met meerdere holtes met 1 pi en een tweede putje met 10 ul van gezuiverd virus van stap 5,9) 3.
  2. Oogst cellen 3 uur na infectie. Verwijder medium en voeg trypsine om de hele goed te bedekken en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5 min. Spoelen van de cellen met trypsine met een pipet en spin neer de cellen bij 890 g gedurende 3 min bij RT.
  3. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 200 ul van DPBS en was ze grondig om gratis (niet-infectieuze) vector te verwijderen. Centrifugeer gedurende 3 min bij 890 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellets in 200 ul van verse DPBS.
    Opmerking: Voor een nauwkeurige bepaling van de besmettelijke titer, is het cruciaal om alle niet-infectieuze virusdeeltjes uit de cel oppervlakken te verwijderen door trypsine behandeling en grondig wassen.
  4. Om de totale virusdeeltje aantal (besmettelijke deeltjes en niet-infectieuze deeltjes = fysieke titer) te bepalen, de oogst niet-geïnfecteerde HEK293 cellen uit twee putten zonder trypsine door spoelen van de cellen met hun kweekmedium met een pipet.
  5. Spin down de cellen gedurende 3 min bij 890 xg bij kamertemperatuur. Gooi het medium en resuspendeer gepelleteerde cellen in 200 gl DPBS. Subsequently voeg 1 pl en 10 pl gezuiverd HCAdV preparaat rechtstreeks aan de cellen. Met niet- geïnfecteerde cellen als achtergrond, dezelfde voorwaarden gDNA isolatie en vervolgens Q-PCR te verzekeren.
  6. Isoleer gDNA van HEK293 cellen afkomstig van stap 7,3) en 7,5)
    1. Vortex cellen opnieuw gesuspendeerd in 200 ul DPBS (stap 7.3 en 7.4) gedurende 3 sec, voeg 200 ul van SDS-oplossing. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) en 20 ui proteïnase K (20 mg / ml) en vortex suspensie 3 sec. Incubeer 16 uur bij 12- 55 ° C en schud langzaam. Voeg vervolgens 2 pl RNAse A (20 mg / ml) en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
    2. Voeg 350 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe buis en herhaal deze stap een keer
    3. Breng de bovenstaande vloeistof over in een nieuwe buis, voeg 50 ul natriumacetaat (pH 5, 3 M) en 1 ml ijskoude EtOH (99,8%) en meng suspensie. Centrifuge monsters gedurende 10 minuten bij 15.000 xg genomisch DNA pellet.
    4. De bovenstaande vloeistof, voeg 500 pl 70% EtOH en centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g. Verwijder het supernatant, voeg 500 pl 70% EtOH en schud gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 2 min bij 15.000 x g.
    5. Verwijder het supernatant en de lucht drogen DNA pellet. Droog geen DNA pellets lang, aangezien het moeilijker is om gDNA krijgen oplossing. Resuspendeer de pellet DNA in 120 ul van dH 2 O en incubeer gedurende 1 uur bij ~ 37 ° C onder schudden. Als DNA-oplossing wordt viskeus, schud gedurende enkele uren bij 37 ° C, en incubeer bij 55 ° C gedurende ~ 1 uur.
  7. Infectieuze HCAdV-deeltjes absolute HCAdV deeltjes te bepalen, wordt een standaardcurve van 10 1 - 10 8 kopieën van een plasmide dat het GOI in de HCAdV genoom.
  8. Bepaal totale deeltjes en infectueuze deeltjes door analyse van dezelfde hoeveelheden gDNA van geïnfecteerde HEK293 cel uit stap 7,3) en 7,4) toegepast qPCR middels 400 nM van primers specifiek voor het GOI in de HCAdV genoom.
  9. Stel het PCR-programma als volgt: pre-incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie in 40 cycli van 95 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 10 seconden en 72 ° C gedurende 20 sec. Op basis van de standaardkromme (stap 7,7), interpoleren het totale aantal adenovirale genomen in de reactie.
  10. Bereken het aantal adenovirale genomen in de uiteindelijke vector preparaat met de volgende formular: (Aantal HCAdV / gewicht ng gDNA bij de reactie) x (gewicht ng DNA van alle cellen in de geïnfecteerde schaal / volume virus in ui) .
    LET OP: Het typische bereik voor absolute en infectieuze virusdeeltjes opbrengsten zijn ongeveer 1x10 7 -1x10 8 virale deeltjes / ul. Titers die tien maal hoger of lager zijn dan hier vertoonde kunnen worden beschouwd als normaal. Hogere titers zou een verbetering zijn. Wat betreft de verhouding van absolute HCAdV particles aan besmettelijke HCAdV deeltjes, de ervaring leert dat ongeveer 5 tot 10% van de absolute HCAdV deeltjes zijn besmettelijk (Figuur 7A).
  11. Om de verontreinigingsniveaus met HV bepalen uitvoeren qPCR door het amplificeren van een deel van het adenovirale late gen 3 (L3) in de HV genoom. Gebruik van een plasmide dat de adenovirus late gen 3 (L3) om een ​​standaardcurve (stap 7,7) genereren.
  12. In deze reactie toe te passen 400 nM van de primers L3 forward 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'en L3 omgekeerde 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' samen met 300 nm van de L3-specifieke probe 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Stel het PCR-programma als volgt: voorincubatie / activering bij 95 ° C gedurende 10 min, amplificatie gedurende 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min. Gebruik een universele probe PCR Mastermix voor qPCR reactie. Op basis van de standaardkromme (stap 7,7) Bereken het aantal infectious HV deeltjes in de uiteindelijke vectorbereiding. Zie (Figuur 7A) voor typische opbrengst van HV deeltjes.
  14. Tenslotte berekent de verhouding van absolute infectieuze deeltjes HCAdV tot HV verontreinigingsniveaus de kwaliteit van de vectorbereiding evalueren.
    OPMERKING: Tot nu toe kan een klein deel van de resterende HV niet worden uitgesloten. Gewoonlijk het percentage HV verontreiniging ~ 5% van infectieuze deeltjes of minder, die aanvaardbaar is (Figuur 7B). Natuurlijk HV zo min mogelijk wenselijk, zeker als het vector preparaat zal worden gebruikt voor dierproeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier representatieve voorbeelden voor klonering, amplificatie en zuivering van HCAdV preparaten worden getoond. Een overzicht van de kloneringsstrategie (figuur 1) en representatieve voorbeelden voor klonering en afgifte van de HCAdV genoom door restrictie-enzym digest worden voorzien (figuur 2). Een typische restrictiepatroon na de vrijgave van de GOI-expressiecassette van pHM5 door PI- Sce I en I I Ceu verteren en vervolgens met fenol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde protocol maakt zuivering van HCAdV vectoren gebaseerd op menselijke adenovirus type 5 gebaseerd op eerder beschreven procedures 4,12. De HCAdV genoom binnen pAdFTC plasmide mist alle adenovirus genen en alleen draagt ​​de 5'- en 3'-ITR's en het verpakkingssignaal. In deze strategie de HV AdNG163R-2 4 biedt alle benodigde genen voor een efficiënte virus productie in trans. Dit biedt een verpakking van maximaal 35 kb, die duidelijk outcompetes eerste en twe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie EH 192/5-1 (A.E.), het EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), de UWH Forschungsförderung (E.S. en W.Z), en het promotieprogramma van de Universiteit Witten/Herdecke (P.B.). J.L. werd ondersteund door een beurs van de Chinese Scholarship Council en T.B. en M.G door de Else Kröner-Fresenius Stichting (EKFS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
I-CeuINew England BiolabsR0699Srestrictiedigest
PI-SceINew England BiolabsR0696Srestrictiedigest
T4 LigaseNew Engand BiolabsM0202Sligatie
SwaINew England BiolabsR0604Srestrictiedigest
NotINew England BiolabsR0189Srestrictiedigest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)New England BiolabsM0290Sdefosforylering van gedigesteerde plasmiden
Hygromycin BPAN BiotechP02-015selectie van CRE expresserende 116 cellen
DMEMPAN BiotechP04-03590   Hek293T celcultuurmedium
Minimal Essential Medium (MEM) EaglePAN BiotechP04-08500116 celcultuurmedium  
Dulbecco’s fosfaatbufferoplossing (DPBS)PAN BiotechP04-36500wassen van cellen, hersuspensie van cellen
250-ml opslagflesSigmaCLS430281-24EAinfectie van 116 cellen gekweekt in suspensie
500-ml PP CentrifugeerbuizenSigmaCLS431123-36EAsedimentatie van cellen uit suspensiecultuur
Spinner flesBellco1965-61030groei van 116 cellen in suspensie
Ultra Clear UltracentrifugebuizenBeckmann Coulter344059dichtheidsgradiëntcentrifugatie
UltracentrifugeBeckmann Coulterdichtheidsgradiëntcentrifugatie
SW-41 rotorBeckmann Coulterdichtheidsgradiëntcentrifugatie
Spectrum Laboratories Spectrapor MembraanVWR132129dialyseslang
klaar-voor-gebruik dialysecassettes Thermo66383dialyse
one shot DH10B elektrocompetente E. coliinvitrogenC4040-52transformatie van ligatiereacties
PureYield Plasmid Midiprep SystemPromegaA2495midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit Peqlab12-3396-02isolatie van genomisch DNA
SuperFect Transfectie ReagensQiagen301305transfectie van 116 cellen
opti MEM (10% FBS)Gibco31985-062transfectie van 116 cellen
iQ SYBR Green SupermixBioRad 170-8882q-PCR
CFX 96 C1000 touch BioradqPCR-machine
Fenoel/Chloroform/Isoamyl alcohol Carl RothA156.1zuivering van DNA
CesiumchlorideCarl Roth8627.1dichtheidsgradiëntcentrifugatie
natriumacetaat 99%Carl Roth6773.2DNA-precipitatie
LB-medium Carl RothX968.3bacteriegroeimedium
ethanol  99,8% puurCarl Roth9065.5 DNA-precipitatie en wassen
SDS 99,5%Carl Roth2326.2lysisbuffer
EDTACarl Roth8043.2lysisbuffer
Tris-HCl 99%Carl Roth9090.3dialysebuffer/ lysisbuffer
glycerol 99,5%Carl Roth3783.1dialysebuffer
MgCl2 98,5%Carl RothKK36.2dialysebuffer
NaClCarl Roth3957.1optionele dialysebuffer
KH2PO4Carl Roth3904.2optionele dialysebuffer
sucroseCarl Roth9286.1optionele dialysebuffer
Na2HPO4x2H2OCarl Roth4984.2optionele dialysebuffer
1,5-ml buizensarstedt72,730,005opslag van viruspreparaten bij -80 °C

Referenties

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Plasmid pAdFTChoming endonucleasenHEK293 producentencellenco infectie met helpervirusamplificatie in spinner flescesiumchloride zuiveringultracentrifugatiedialyse bufferuitwisseling
Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.