De manchettechniek verkort en vergemakkelijkt het model van heterotope cervicale harttransplantatie bij muizen door technisch uitdagende hechtingsanastomosen van kleine bloedvaten te vermijden. De technische details die in dit videopapier worden getoond, zouden onderzoekers in staat moeten stellen dit model in hun laboratoria tot stand te brengen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Heterotopische Cervical harttransplantatie in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De heterotope cervicale harttransplantatie bij muizen is een waardevol hulpmiddel in transplantatie- en cardiovasculair onderzoek. De manchettechniek vereenvoudigt dit model aanzienlijk door uitdagende hechtingen van kleine bloedvaten te vermijden, waardoor de warme ischemietijd wordt verkort. In vergelijking met abdominale graftimplantatie is het cervicale model minder invasief en is het geïmplanteerde graft gemakkelijk toegankelijk voor verdere follow-up onderzoeken. Anastomosen worden uitgevoerd door de opgaande aorta van het graft over de manchet te trekken met de gemeenschappelijke halsslagader van de ontvanger en door de hoofdpulmonale slagader over de manchet te trekken met de uitwendige halsslagader. Selectie van een geschikte manchetmaat en volledige mobilisatie van de bloedvaten zijn belangrijk voor succesvolle revascularisatie. Ischemie-reperfusie (I/R) schade kan worden geminimaliseerd door het graft te perfunderen met een cardioplegische oplossing en door hypothermie. In dit artikel geven we technische details voor een vereenvoudigde en verbeterde manchettechniek, die chirurgen met basis microchirurgische vaardigheden in staat zou moeten stellen om de procedure met een hoge slagingsgraad uit te voeren.
Inleiding
De harttransplantatie model wordt vaak gebruikt om I / R-schade, allograftafstoting, post-transplantvasculopathie en de efficiëntie van immunomodulerende middelen te onderzoeken. Muismodellen combineert vele voordelen, zoals de bekende immunologische en genetische achtergronden, de beschikbaarheid van vele inteelt en transgene stammen en relatief lage experimentele kosten.
In 1973, werd een techniek van abdominale harttransplantatie bij muizen eerst beschreven door Corry et al 1. In dit model transplantaten revascularisatie door end-to-side anastomose van de aorta ascendens abdominale aorta van de ontvanger en de belangrijkste longslagader de inferior vena cava. In 1991, een hechtdraad techniek voor cervicale harttransplantatie bij muizen werd beschreven door Chen et al 2. In dit model een retrograde coronaire perfusie wordt vastgesteld door anastomose van de halsslagader van de ontvanger aan de stijgende aorta van de grachterdek. Het veneuze bloed afvoeren via de coronaire sinus in het rechter atrium, het rechter ventrikel en uitgeworpen via de longslagader in de ontvangende uitwendige halsader (figuur 1). In vergelijking met de abdominale implantaat implantatie de cervicale model is minder invasief en oppervlakkige locatie van het implantaat maakt een zeer gemakkelijke toegankelijkheid voor aanvullende naonderzoeken (bijv palpatie, echocardiografie, intravitale fluorescentiemicroscopie) 3,4.
Ondanks technische verbeteringen 5,6, heeft een ruimer gebruik van dit model is beperkt als gevolg van technische problemen aan gehecht anastomosen van kleine schepen te voeren met een hoge incidentie van anastomosis lekkage en trombose. In 1991, Matsuura et al. introduceerde de manchet techniek waarbij de vaatwand wordt binnenstebuiten gekeerd op een synthetische cilinder, die sterk vergemakkelijkt het model van cervicale harttransplantatie 7. De techniek was further aangenomen voor diverse experimentele transplantatie modellen, waaronder de nieren 8, alvleesklier 9, ledematen 10, 11,12 lever-, long- 13,14 en vasculaire transplantatie 15. In vergelijking met de hechtdraad techniek de vereiste tijd voor anastomosen en aldus de warme ischemie korter is en er aanzienlijk minder vasculair complicaties met de manchet 16 techniek. Bovendien stelt chirurgen met weinig opleiding in microchirurgie om de operatie uit te voeren met een hoog slagingspercentage. Een nadeel van de manchet techniek is de vereiste ligering van de gemeenschappelijke halsslagader, die cerebrale perfusie kunnen veranderen.
In deze video paper presenteren we een verbeterde en vereenvoudigde manchet techniek voor cervicale harttransplantatie in muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Duitse Hart Centrum München en de regering van Beieren, Duitsland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). De dieren werden gehuisvest in een bepaalde ziekteverwekker gratis faciliteit en kregen menselijke zorg in overeenstemming met de "Principles of Laboratory Animal Care" door de National Society for Medical Research en de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" die door de National Academy geformuleerd van Wetenschappen en gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, herzien 1985).
LET OP: Een complete set van steriele microchirurgische instrumenten, waaronder twee gebogen pincet en schip dilatators, is noodzakelijk voor de procedure (Figuur 2a). Perioperatieve antibiotische profylaxe is niet routinematig nodig, maar bij immuungecompromitteerde dieren kan worden aangegeven. De dieren werden opgeofferd met klem isofluraan inademing.
Donor Voorbereiding en Graft Harvest
- Verdoven het dier door intraperitoneale (ip) injectie van midazolam (5,0 mg / kg), medetomidine (0,5 mg / kg) en fentanyl (0,05 mg / kg lichaamsgewicht). Plaats de muis in een liggende positie op het operatiegebied en bevestig chirurgische tolerantie door het pedaal terugtrekking reflex.
- Ontsmet de huid drie keer met chloorhexidine en het uitvoeren van een middellijn incisie in de buik. Trek de darmen met natte gaas links naar inferior vena cava bloot te leggen.
- Injecteer 50 IU heparine verdund in 0,4 ml zoutoplossing door de inferior vena cava voor antistolling. Incise het vaartuig 1 min na heparinisatie.
- Open het diafragma en het uitvoeren van een bilateraal thoracotomie om het hart bloot te leggen. De voorste borstwand wordt superiorly gereflecteerd en op zijn plaats gehouden met een klem.
- Verwijder de thymus en botweg ontleden het bindweefsel tussen de aorta en pulmonale stam. Incise de rechter superieure vena cava.
- Doorboord gemobiliseerd opgaande aorta ter hoogte van debrachiocephalic stam met een 30 G naald bevestigd aan een injectiespuit 5 ml en langzaam perfuseren het hart retrogradually niet overvol met 3 ml 4 ° C koude cardioplegische oplossing. Vermijd het binnendringen van lucht in de coronaire circulatie. Drop ijskoude zoutoplossing op het transplantaat verder te verbeteren hartstilstand.
- Doorsnijden de aorta proximaal van de oorsprong van de brachycefale romp.
- Afbinden de inferieure en beide superieure holle ader dicht bij het hart met 8-0 zijde en doorsnijden ze distaal aan de ligaturen.
- Ontleden gratis de pulmonaire kofferbak zo distaal mogelijk. Ligeren de longslagaders dicht bij de splitsing met 8-0 zijde en doorsnijden ze distaal.
- Ligeren de longaders allemaal samen met een 8-0 zijden ligatuur en doorsnijden hen.
- Verwijder het hart uit de donor en op te slaan in ijskoud cardioplegische oplossing totdat de implantatie.
2. Ontvanger Voorbereiding
- Bereidende manchetten voor anastomosen door het snijden van de polyimide buis met een No. 11 scalpel of schaar onder de microscoop. De manchet bestaat uit een cilindrisch lichaam en een verlengstuk (1/3 van de omtrek) voor de plaatsing van de vasculaire klem, elk met een lengte van 1 mm (figuur 2b).
- Verdoven dier en bevestig chirurgische tolerantie zoals hierboven beschreven. Injecteren 0,25 ml warm zoutoplossing subcutaan (sc) voor vloeistof vervanging.
- Verwijder het haar van de juiste cervicale gebied met behulp van een elektrisch scheerapparaat en plaats het dier in liggende positie op een warm kussen. Zet de benen met strengen van tape, terwijl het vermijden overstrekken de voorste ledematen, want dit kan de ademhaling in gevaar brengen. Bedek de ogen behulp oogzalf tot droog voorkomen. Ontsmet de chirurgische plaats drie maal met chloorhexidine.
- Maak een dwarse incisie in de huid van rechts onderkaak hoek met de halsader notch.
- Botweg mobiliseren het externe halsader. Cauterize zijtakken met een bipolaire pincet en doorsnijden hen.
- Verdeel de externe halsader tussen ligaturen op het niveau van de samenvloeiing met de ader van de submandibulaire klier.
- Trek de externe halsader door de manchet en verstoppen het vat proximaal door een vasculaire klem op de verlenging van de manchet. Verwijder de ligatuur en irrigeren het lumen schip met 01:10 gehepariniseerde zoutoplossing.
- Evert de vaatwand op de manchet en bevestig het met een vooraf ingestelde omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Verwijder het oppervlakkige deel van de sternocleidomastoideus spier.
- Mobiliseren het recht gemeenschappelijke halsslagader en doorsnijden het schip tussen ligaturen onder de carotisbifurcatie.
- Trek de halsslagader door de manchet en verstoppen het vat proximaal door een Yasargil klem op de verlenging van de manchet. Verwijder de ligatuur en irrigeren het lumen schip met 01:10 gehepariniseerde zoutoplossing.
- Zachtjes dilate het arteriële lumen met een schip dilatator Evert de vaatwand op de manchet en bevestig het met een vooraf ingestelde omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Om voldoende ruimte voor graft implantatie krijgen, verwijdert u de juiste kwab van de submandibulaire klier.
- Houd het operatiegebied vochtige tot de implantatie.
3. Graft Implantatie
- Plaats het transplantaat in de ontvangende cervicale regio ondersteboven met de aorta mediaal georiënteerd en de longslagader zijwaarts.
- Trek de aorta van het transplantaat over de manchet met de halsslagader en zet de anastomose met een omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Incise de pulmonaire stam op de voorste aspect en trek het over de manchet met de externe halsader. Weer veilig de anastomose met een omtrek 8-0 zijden ligatuur.
- Verwijder de klem op de externe halsslagader, gevolgd door unclamping van de halsslagader. De harten vult onmiddellijk met bloed. Aan r verbetereneperfusion dalen 37 ° C warm zoutoplossing op het transplantaat. Normaal gesproken het hart ontwikkelt sinusritme binnen één minuut. Verwijder de manchet verlenging op het veneuze plaats.
- Let op de juiste positie graft, moet anastomoses spanningsvrij en schepen zonder torsie zijn. Niet dichtgeschroeid schepen van de huid, omdat dit kan wondgenezing schaden. Bloeden stopt meestal spontaan. Sluit de huid met een doorlopende hechting 8-0.
4. postoperatieve zorg
- Injecteren 0,25 ml warm zoutoplossing sc voor vloeistof vervanging.
- Om antagoniseren narcotica injecteren naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) en atipamezol (2,5 mg / kg lichaamsgewicht) sc links het dier op het warme pad totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven. Observeer het dier ten minste één extra uur anomalieën registreren. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot het volledig Recove niet terugrood.
- Geef preëmptieve analgetica met buprenorfine (0,05 mg / kg sc driemaal per dag) of een alternatief analgesie volgens een lokale institutioneel protocol voor een duur van 72 uur na de procedure.
- De chirurg en moet een dierenarts de dieren regelmatig te zien. In het geval van gewichtsverlies> 15%, apathie, zwelling of chirurgische kant infectie dieren worden gedood met behulp van terminal isofluraan inademing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ons team kon de beschreven techniek met succes uit te voeren na ongeveer 20 training operaties. De meest uitdagende gedeelte is de vaatwand van de halsslagader via manchet buiten keren, omdat dit flips heen en meerdere pogingen kan leiden tot scheuren van de wand. Na de stage, de gemiddelde totale operatieve tijd was 60 ± 8 min. Ongeveer 20 min nodig zijn voor de donor oogst, 25 min voor de bereiding van de cervicale schepen en 15 minuten voor anastomoses en de afsluiting huid.
Voor het onde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben meer dan 200 cardiale transplantaties met een slagingspercentage van meer dan 90% in verschillende experimentele instellingen voltooid. Met de hier beschreven techniek, kan de volledige procedure binnen 60 minuten worden uitgevoerd door een ervaren chirurg. Door vóór orgaanverwerving de cervicale schepen voorbereiden, kan de totale transplantaat ischemie tijd worden beperkt tot 20 min. Tijd voor inplanting (warme ischemie tijd) aanzienlijk korter is met de manchet techniek in vergelijking met de hechtdraad
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
M.-A. Deutsch wordt ondersteund door Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014) Deutsche Stiftung für Herzforschung en Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane wordt ondersteund door Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herz Kreislauf Forschung (DZHK B 13-050A; DZHK B 14-013SE) en Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1; KR3770/9-1)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Gebogene punt 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita schaar | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65.097 | 3.5 mm lengte |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | punt 0.25 mm |
| Polyimide buizen | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 zijde ligaturen | Catgut | ||
| Custodiol HTK oplossing | Essential Pharmaceuticals |
Referenties
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278(2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
