Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Samenvatting

Het geïsoleerde rattenhart is een duurzaam model voor ischemie-reperfusieletsel. Hier beschrijven we het proces van het oogsten van het kloppende hart van een rat via in situ aortacanuletie, Langendorff-perfusie van het hart, gesimuleerde ischemie-reperfusieletsel en infarctkleuring om de omvang van het ischemische letsel te bevestigen.

Samenvatting

De biochemische gebeurtenissen rond ischemie-reperfusieletsel in de acute setting zijn van groot belang voor het bevorderen van nieuwe behandelingsopties voor myocardiale infarcten en hartcomplicaties van thoracale chirurgie. Het vermogen van bepaalde geneesmiddelen om het myocard voor te conditioneren tegen ischemie-reperfusieletsel heeft geleid tot meerdere klinische onderzoeken, met weinig succes. Het geïsoleerde hartmodel staat acute observatie van de functionele effecten van ischemie-reperfusieletsel in real-time toe, inclusief de effecten van verschillende farmacologische interventies die op elk tijdstip vóór of binnen de ischemie-reperfusieletselvenster worden toegediend. Aangezien korte periodes van ischemie het hart kunnen voorconditioneren tegen ischemische schade, wordt in situ aortacanuletie uitgevoerd om functionele beoordeling van niet-voorgeconditioneerd myocard mogelijk te maken. Een met fysiologische zout oplossing gevulde ballon wordt in het linker ventrikel geplaatst om real-time meting van drukgeneratie mogelijk te maken. Ischemische schade wordt gesimuleerd door het stopzetten van de perfusiebufferstroom, gevolgd door reperfusion. De duur van zowel ischemie als reperfusion kan worden gemoduleerd om biochemische gebeurtenissen op elk gewenst tijdstip te onderzoeken. Hoewel het geïsoleerde hartmodel van Langendorff geen rekening houdt met systemische gebeurtenissen die ischemie en reperfusion beïnvloeden, is het een uitstekend model voor de bestudering van acute functionele en biochemische gebeurtenissen binnen het venster van ischemie-reperfusieletsel, evenals het effect van farmacologische interventie op cardiale pre- en postconditionering. Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe in situ aortacanuletie en hartexcisie gevolgd door ischemie/reperfusieletsel in het Langendorff-model kunnen worden uitgevoerd.

Inleiding

Opheldering van de gebeurtenissen onderliggende cardiale respons op zowel ischemie en reperfusie zijn essentieel om de behandeling van myocardiaal infarct ¹ en cardiale chirurgische procedures die vereisen aorta kruis-klemmen ^2. Terwijl in vivo modellen van ischemie reperfusie schade toe nuttig eindpuntonderzoek, ze niet zo doeltreffend voor het bestuderen van de functionele effecten van ischemie reperfusie schade acuut in real time. Bovendien, in vivo reperfusie ischemie modellen produceren gewoonlijk aanzienlijke variabiliteit in infarctgrootte en directe afgifte van geneesmiddel aan het hart op het tijdstip van reperfusie is een uitdaging. Het gebruik van een Langendorff geïsoleerde hart voor het bestuderen ischemie reperfusie schade maakt real-time functionele beoordeling van farmacologische behandelingen, egale van geïnfarcteerd weefsel en onmiddellijke afgifte van geneesmiddel direct op het myocardium.

Beschreven by Oscar Langendorff in 1895 ^3, het Langendorff geïsoleerde hart is een robuust model voor het bestuderen van ischemie-reperfusie schade, die is gebruikt bij ischemie-reperfusie onderzoek voor de laatste 40 jaar ^{van 4,5.} Hier zijn enkele wijzigingen aangebracht in het geïsoleerde hart optimaliseren voor functionele analyse. In situ canulatie van de aorta terwijl het hart klopt zodat het hart niet ervaren ischemische voorconditionering, die de resultaten van ischemie reperfusie proeven ⁶ zou wijzigen. Om dit te vergemakkelijken, wordt een tracheotomie uitgevoerd, waardoor ventilatie zorgen fysiologische stabiliteit van de rat tijdens de operatie. Het hart wordt vervolgens naar een glas watermantel spiraal kolom waardoor Krebs Henseleit buffer wordt geleverd via retrograde perfusie direct in de aorta bevestigd. Een zoutoplossing gevulde ballon in de linker ventrikel en verbonden met een drukopnemer, die zorgt voor real time meting van de druk vanuit het ventrikel eend berekening van meerdere functionele parameters. Aan het einde van het experiment wordt het hart gespoeld met koude zoutoplossing om krimp en flash ingevroren in vloeibare stikstof naar stroomafwaartse analyse van DNA, RNA en eiwit niveau mogelijk aanhouden. Aldus gewijzigd, de Langendorff doorbloed hart fungeert als een doeltreffend systeem voor de directe controle van de fysiologische effecten van farmacologische interventies op elk moment acuut tijdens de ischemie-reperfusie schade.

Protocol

Alle hier genoemde procedures zijn door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Medische Universiteit van South Carolina. De hier beschreven experimenten acute, niet-overlevingsexperimenten. Als zodanig is er geen gebruik van oogzalf en een steriele operatiekamer is niet vereist. Euthanasie wordt bereikt door verbloeding bij het oogsten van het hart.

1. Experimentele Voorbereiding

1. Het opzetten van ofwel een constante druk of constante stroom Langendorff perfusie Apparatus ^4.
2. Bereid 4 L gemodificeerde Krebs Henseleit buffer (in mM: 112 NaCl, 5 KCI, 1,2 MgSO _4, 1 K ₂ HPO _4, 1,25 CaCl _2, 25 NaHCO _3, 11 D-glucose, 0,2 octaanzuur, pH = 7,4).
   1. Maak 10x voorraad buffers.
      1. Los NaCl, KCl, _MgSO4, en K ₂ HPO ₄ in 3 L ultrapuur water.
      2. Los _CaCl2 in 500 ml ultrapuur water with 40 ml 1 N HCl.
      3. Voeg langzaam CaCl _2-oplossing aan de buffer in 1.2.1.1. Voeg genoeg ultrapuur water om een ​​totaal aan 4 L. Laat roeren gedurende 1 uur voordat het filteren door middel van een 0,8 um filter. Bewaar bij 4 ° C.
      4. Los _NaHCO3 in 4 L ultrapuur water. Laat roeren 1 uur vóór filtratie door 0,8 pm filter. Bewaren bij 4 ° C
   2. Combineer 400 ml 10 x Krebs Henseleit-buffer met 400 ml 10 x ₃ NaHCO buffer. Voeg genoeg ultrapuur water om een ​​totaal aan 4 L. Los glucose en octaanzuur onder roeren. Filteren door middel van 0,8 um filter.
3. Bereid je voor het hart.
   1. Voeg 2 L gefiltreerde buffer een 4 L geplaatste fles 38 in boven de plugkraan bevestigd aan de aorta canule. Dit zal een perfusiedruk van 70-80 mmHg leveren aan het hart, dat is het aanbevolen perfusiedruk ^4.
   2. Plaats gas dispersie bubbler in de buffer in de fles.
   3. Laat de buffer door het systeem, en zorg ervoor dat eventuele luchtbellen te verwijderen vanuit de slang.
   4. Schakel gas (95% _O2 / 5% CO ₂₎ ten minste 30 minuten voor het hart te worden gebracht. Gebruik een gasstroom sonde en bloed gas analyzer om zuurstofverzadiging te controleren.
4. Bereid chirurgische voorraden en ballon.
   1. Voor het oogsten van hart, bereidt een paar 6,75 "chirurgische schaar, een paar 4,5" schaar, twee paar hemostats, twee sets caramalt forceps, twee spuiten met 27 G naalden, 2 stuks 0-guage zijden hechtdraad (ongeveer 15 cm lang), een 16/01 inch weerhaken canule en een tracheale canule.
   2. Om tracheacanule monteren, lijm een ​​kort stuk van 1/16 inch diameter plastic slang aan op een Y-connector.
   3. Om ballon apparaat monteren: bevestig een maagsonde naald om een ​​stuk van 1/16 inch buis, bevestig vervolgens slang aan druksensor huisvesting. Een kleine spuit bevestigd aan de andere kant van de druk transducer woningen zullen inflatie en deflatie van de ballon mogelijk te maken.
      1. Snijd een vierkant van plastic omslag en plaats punt van een maagsonde naald in het centrum. Wikkel de plastic omslag rond de maagsonde naald.
      2. Vul ballon met zoutoplossing en afhechten met twee hechtingen. Blaas de ballon om ervoor te zorgen dat er geen lekken. Het volume zoutoplossing binnen de opgeblazen ballon moet ongeveer 200 pl, maar kan variëren afhankelijk van de grootte van de rat.
      3. Alternatief, gebruik dan een latex vinger bed in plaats van de plastic verpakking. Plaats maagsonde naald binnen vinger kinderbed, vullen met zoutoplossing en afhechten.

2. Harvest het hart

1. Weerhouden een Sprague Dawley rat met een decapicone of andere handmatige terughoudendheid apparaat. Weeg rat.
2. Dien ketamine / xylazine mengsel (0,85 mg / kg ketamine en 0,15 mg / kg xylazine) via intraperitoneale injectie rat verdoven. Deze dosis verdoving voldoende verdoving voor bieden20-40 min, maar de procedure moet zo snel mogelijk na de anesthesie bevestigd worden voltooid.
3. Bevestig juiste mate van anesthesie door testen teen knijpen reflex.
4. Tracheotomie
   1. Verwijder pelt van half voorpoot naar de basis van de kaak, met behulp van hemostats om pelt en scharen verheffen tot incisie te maken. Houd de pels verheven om het scheiden van de onderliggende spieren, waardoor een te snijden langs de pels en verwijderen.
   2. Met behulp van hemostats, til klierweefsel en maak een horizontale incisie in de fascia inferieur aan het klierweefsel. Gebruik hemostats om incisie spreiden open, zorg niet te nick het jugularis aderen.
   3. Met hemostats pinch spier bovenliggende trachea en met een schaar maken een dwarse incisie in de spier net onder de punt van de hemostats. Met hemostats, verspreid tissue elkaar om trachea onthullen.
   4. Steek hemostats onder luchtpijp, clearing fascia terwijl vordert door voorzichtig vooruit en terugtrekken hemostats.
   5. Zodra hemostats succes achter de luchtpijp worden geplaatst, knijp 0-0 zijden hechtdraad met hemostats en hemisect de luchtpijp met een kleine, scherpe schaar.
   6. Plaats tracheacanule in de hemisected luchtpijp, hechtdraad trekt achter de luchtpijp, en bind de hechtdraad rond de gecanuleerde luchtpijp, het verankeren van de hechting aan de Y-lies van de canule met een chirurgen knoop.
   7. Met behulp van een 27 G naald, injecteren 1.000 U / kg heparine in de halsader en laten circuleren gedurende 30 sec.
5. Thoracotomie
   1. Verwijder pelt van half buik om mid-voorpoot regio door te knijpen met hemostats en snijden met een schaar.
   2. Wordt ¾ inch dwarse incisie in de abdominale spierwand, net onder het diafragma.
   3. Voeg een verticale insnijding van de buikwand en borstwand snijden langs het borstbeen.
   4. Snijd het membraan terug bilateraal, vervolgens verspreid ribbenkast aan het hart, klem ribbenkast met hemostats om ervoor te zorgen het blijft verspreiden onthullen.
   5. Met behulp van hemostats, verwijder voorzichtig thymus, het blootstellen van de opgaande aorta.
   6. Plaag hemostats door de aorta lus, oprukkende en terugtrekken hemostats en voorzichtig verspreiden fascia aan puntje van hemostats door te laten.
   7. Gebruik hemostats naar 0-0 zijden hechtdraad achter oplopende aorta trekken, das hechtdraad in een losse halve vierkante knoop.
   8. Draai kraan om stroom van perfusie buffer, hemisect aorta beginnen en onmiddellijk steek de canule in de aorta lumen. Snel cinch een halve vierkante knoop en voltooien van de knoop, aanscherping grondig.
   9. Gebruik een schaar om het hart te ontleden weg van de grote vaten, verwijder het hart van de borst en hechten aan perfusie kolom.
   10. Trim overtollige longweefsel en laat het hart in evenwicht op de kolom voor ongeveer 15 minuten vóór het inbrengen van de ballon. Gebruik een normaal debiet van buffer door het hart van 10-20 ml / min.

3. Langendorff perfusie en ischemie-reperfusie schade

1. Plaatsing van LV pressure ballon
   1. Leeglopen ballon terwijl rollen in een kegelvorm en draai kraantje om ervoor te zorgen ballon blijft leeggelopen.
   2. Accijnzen linker atrium met een kleine schaar om de toegang tot mitralisklep bloot.
   3. Plaats de ballon door de linker atrium en mitralisklep in linker ventrikel.
   4. Start druk monitoring software (LabChart Pro).
   5. Blaas de ballon door het openen van kraan en voorzichtig toenemende hoeveelheid zout in de ballon tot diastolische druk lezen van micromanometer overschrijdt nul.
   6. Om de lengte-spanning reactie te controleren, te blazen ballon langzaam naar een diastolische druk van 75 mmHg, langzaam leeglopen, herhaal een keer.
   7. Stel diastolische druk tot 10 mmHg door regeling van de hoeveelheid zout in de ballon. Draai kraan om de ballon te verzegelen op dit niveau van de inflatie, en onderhouden gesloten druksysteem tussen LV ballon en druksensor.
   8. Lagere hart in verwarmde kamer en deksel kamer met plastic.
2. Advertentiebediening van ischemie-reperfusie schade
   1. Sluit de bodem van de verhitte kamer en laat ruimte te vullen met Effused buffer.
   2. Als buffer hart is ondergedompeld, draaien kraantje om de stroom van buffer te stoppen in het hart, inducerende globale ischemie. Ischemie kan variëren afhankelijk van de doelen van het experiment.
   3. Na 30 minuten van ischemie, draai kraan om stroom van buffer te herstellen in het hart, het initiëren van reperfusie.
   4. Laat reperfusie van het hart voor 1 uur voordat beëindiging van het experiment. Gebruik variabele reperfusie tijden, afhankelijk van de doelen van het experiment.
3. Beëindiging van Experiment en oogsten van Tissue
   1. Met zijpoort van plugkraan, dienen 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing bij 4 ° C in het hart met een snelheid van 10 ml / min aan het hart stil.
   2. Verwijder het hart uit perfusie kolom, trim weg resterende atriale weefsel.
   3. Plaats hart in een roestvrijstalen weefsel snijden matrix, bedek met Parafilm, en plaats bij -80 ° C gedurende 8 minuten, of totdat het hart heeft een marshmallow-achtige consistentie.
   4. Verwijder blok van diepvries en steek scheermesjes in moten matrix aan het hart snijden in 2 mm plakjes. Tissue blokken kunnen ook worden gekocht met andere dan 2 mm slice maten.
   5. Verwijder plakjes één op een tijd en vallen in vloeibare stikstof te knipperen te bevriezen voor biochemische studies. Bewaar de derde ventriculaire slice van de apex voor infarct kleuring.
   6. Verwijder weefsel uit vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik in biochemische experimenten.
4. Infarct kleuring
   1. Incubeer de derde ventrikel slice in 10 ml van 1% g / v trifenyltetrazoliumchloride (TTC) bij 37 ° C gedurende 15 min.
      Opmerking: Incubatie in TTC kan worden uitgevoerd gedurende 15 of 30 min zonder verandering in effectiviteit ^15.
   2. Overdracht weefsel slice van TTC tot 10% gebufferde formaline en laat een nacht incuberen bij kamertemperatuur. Voor een optimaal resultaat, horents moet worden genomen van formaline en afgebeeld binnen 24 uur ^4.
   3. Foto gekleurd slice en gebruik software zoals ImageJ om infarctgrootte te schatten volgens het protocol van de fabrikant. Neem foto zo spoedig mogelijk na fixatie, omdat de verf vervagen in de tijd.

Resultaten

De linker ventriculaire ballonapparaat maakt real-time monitoring van de druk die wordt ontwikkeld door de opdrachtgever linker ventrikel (figuur 1). Zoals eerder ⁷ beschreven, kan deze drukspoor worden gebruikt om veel van de parameters van ventriculaire functie te berekenen. Deze berekeningen kunnen worden gemaakt in de basislijnfase en de reperfusiefase, gemiddeld over meerdere sporen binnen elke groep en vergeleken om te bepalen of de farmacologische interventie resulteerde in cardiale vo...

Discussie

De geïsoleerde geperfuseerde rattenhart succes kan worden gebruikt om het effect van farmacologische interventie preconditionering bij cardiale ischemie reperfusie schade ⁹ bestuderen. Er zijn echter enkele essentiële stappen van de procedure die moet worden genormaliseerd om reproduceerbare resultaten. Een temperatuur van 37,4 ° C binnen het systeem kritisch, omdat zelfs milde hypothermie en hyperthermie cardiale voorbehandeling ^10,11 veroorzaken. De totale tijd die verstrijkt vanaf de injectie va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8