Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Samenvatting

Tijdens de ontwikkeling hematopoietische cellen ontstaan ​​uit een gespecialiseerde subset van endotheelcellen, hemogenic endotheel (HE). Modeling HE ontwikkeling in vitro is essentieel voor mechanistische studies van de endotheel-hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor de efficiënte inductie van HE uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) door de overexpressie van verschillende sets van transcriptiefactoren. De combinatie van ETV2 en GATA1 of GATA2 TF wordt gebruikt voor HE induceren met pan-myeloïde potentieel, terwijl een combinatie van GATA2 en Tal1 transcriptiefactoren maakt de productie van HE met erythroïde en megakaryocytische potentieel. De toevoeging van LMO2 om GATA2 en Tal1 combinatie aanzienlijk versnelt differentiatie en verhoogt erytroïde en megakaryocytische cellen productie. Deze werkwijze verschaft een efficiënte en snelle manier van HE-inductie uit hPSCs en maakt de waarneming van de endotheel-hematopoietic overgang in een cultuur schotel. Het protocol bevat procedures hPSCs transductie en post-transductie analyse van HE en bloed voorlopers.

Inleiding

Het unieke vermogen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) om te hernieuwen en te differentiëren tot cellen van de drie kiembladen, met inbegrip van bloed, maken ze een waardevol instrument voor de mechanistische studies van hematopoietische ontwikkeling modellering van bloedziekten, drug screening, toxiciteit studies, en de ontwikkeling van cellulaire therapieën. Omdat de vorming van bloed in het embryo opbrengsten van hemogenic endotheel (HE) door een endotheliale hematopoietische overgang ^1,2, de opwekking van HE in culturen zou essentieel om de moleculaire mechanismen reguleren van de endotheelcellen aan hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie te bestuderen. Huidige werkwijzen voor het onderzoeken van HE zijn gebaseerd op de inductie van differentiatie in hematoendothelial aggregaten (EBS) met toevoeging van hematopoïetische cytokinen ^5/3 en co-kweek van hPSCs met hematopoiese-ondersteunende stromale cellen ^6,7 of tweedimensionale kweken met extracellulaire matrices en cytokines ^8,9. Deze klassieke differentiatie methoden zijn gebaseerd op de introductie van externe signalen handelen op het celoppervlak en het initiëren van cascades van moleculaire mechanismen die uiteindelijk leiden tot de activering van transcriptie programma begeleiden hematoendothelial ontwikkeling. Derhalve de efficiëntie van hPSCs differentiaties in deze systemen is gebaseerd op een effectieve inductie van die signalen, signaaltransductie naar de kern en de resulterende activatie van specifieke transcriptiefactoren. Daarnaast is de studie van HE gebruikelijke differentiatie culturen vereist de extra stap van het isoleren van cellen met behulp HE celsortering. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor rechtstreekse inductie van HE en bloed door overexpressie van hematopoietische transcriptiefactoren. Deze werkwijze maakt een efficiënte inductie van HE in een schotel en directe observatie van de endotheliale hematopoietische overgang zonder de noodzaak van isolatie van HE via een omslachtige procedure celsortering.

Vorming van HE en bloed van humane pluripotente stamcellen efficiënt worden geïnduceerd door overexpressie enkele transcriptiefactoren (TF). De optimale combinatie van TFs kan induceren robuuste pan-myeloïde hematopoiese van hPSCs omvat ETV2 en GATA1 of GATA2. In tegenstelling, een combinatie van GATA2 en Tal1 induceert erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs door de overexpressie van deze factoren onderscheidt hPSCs direct naar VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^- HE cellen die geleidelijk verwerven van de hematopoietische fenotype bepaald door de expressie van de vroege hematopoietische marker CD43 ^7. Deze lentivirale methode voor de rechtstreekse programmering van humane pluripotente stamcellen methode is toepasbaar voor het genereren van HE en bloedcellen voor mechanistische studies, studies van endotheliale hematopoietische overgang en transcriptieregulatie van hematopoietische ontwikkeling en specificatie. Hoewel de cUIDIGE protocol beschrijft bloedproductie via constitutieve expressie van de transgenen, soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met gewijzigde mRNA ^10.

Protocol

1. Virus Preparaten en transcriptie Factor Combinaties

1. Bereid oplossingen pSIN-EF1α lentivirale expressieplasmide bevattende eiwit-coderende DNA voor ETV2, GATA1, GATA2, Tal1 en LMO2 (tabel 1).
2. Meet de concentratie en zuiverheid van plasmide-preparaten voor de productie van lentivirale opnemen UV absorptie met een spectrofotometer bij 230 nm, 260 nm en 280 nm. Opmerking: DNA-preparaten aantonen A260 / 280 en A260 / 230-waarden van meer dan 1,8 zijn over het algemeen beschouwd als een goede kwaliteit. Lagere A260 / 280 waarden eiwit verontreiniging wijzen, terwijl lagere A260 / 230 waarden duiden onzuiverheden met zout of een oplosmiddel, zoals fenol. Aanbevolen plasmideconcentratie is 1-3 ug / ul.
3. Opbrengst lentivirussen voor transductie beschreven in eerder gepubliceerde protocollen ^11. Inductie van HE met pan-myeloïde potentieel vereist co-expressie van ETV2 en GATA1 of ETV2 en GATA2.Inductie van HE met erythro en megakaryocytische potentiële vereist GATA2 en Tal1. De toevoeging van LMO2 verbetert de opbrengst van erythro-megakaryocytische cellen van hPSCs in aanwezigheid van GATA2 en Tal1 ^10.

2. hPSCs Cultuur Protocol

1. Groeien pluripotente stamcellen in strakke kolonies met scherpe randen om 70-80% confluentie voordat subcultuur. Mark en verwijder spontaan gedifferentieerde koloniën voordat passage cellen.
2. Verdun commerciële extracellulaire matrix gel (zie tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant en vacht 6-putjesplaten gedurende de nacht bij 4 ° C, of gedurende ten minste één uur bij 37 ° C vóór gebruik. Voordat passage cellen, zuigen de matrix, voeg 2 ml vers commerciële compleet kweekmedium (zie tabel 2) en houd platen bij 37 ° C, 5% _CO2 totdat de cellen klaar voor het zaaien.
3. Passage hPSCs
   1. AspiraTe midden van een confluente putje van een 6-wells plaat met hPSCs en voeg 1,5 ml voorverwarmde Dispase II-oplossing (2 mg / ml in DMEM / F12, gesteriliseerd door filtratie door 0,22 um filters). Incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C, 5% CO ₂ tot de randen van kolonies beginnen te tillen van het oppervlak.
   2. Zuig Dispase II-oplossing en voorzichtig wassen koloniën tweemaal door het toevoegen en vervolgens aanzuigen 2 ml vers DMEM / F12 medium. Vervolgens werd met behulp van een 5 ml glazen serologische pipet, dissociëren hPSCs met 3 ml vers commerciële volledige cultuurmedium (zie tabel 2) van de celsuspensie te pipetteren en neer meerdere malen.
   3. Voeg 0,5 ml celsuspensie aan elk putje van een 6-wells plaat met 1,5 ml commercieel compleet kweekmedium (zie tabel 2). Schud de plaat heen en weer en van rechts naar links een paar keer om een ​​uniforme cel verdeling te garanderen wanneer situeren de plaat in de incubator. Laat cellen bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 18-24 uur.
   4. De volgende dag verandering medium frisse commerciële compleet kweekmedium (zie tabel 2) en onderzoekt hPSCs morfologie. Succesvolle passage resultaten in kleine, goed bevestigd kolonies behoud HPSC morfologie. hPSCs moeten worden gevoed met 2,5-3 ml per putje freshmedium dagelijks gepasseerd en elke 4-5 dagen maximaal 70-80% confluentie.
      LET OP: Als hiPSCs op muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gehandhaafd, moeten ze worden overgedragen aan feeder-vrije omstandigheden en gepasseerd 2-3 keer voordat transductie efficiënte differentiatie te waarborgen.

3. Inductie van Hematoendothelial Pprecursors uit hPSCs (dag 0, transductie van hPSCs)

1. Ter voorbereiding reactiemedium combineren 1,3 ml commercieel volledig serumvrij medium (zie tabel 2), virus, polybreen en Y27632 ROCK inhibitor (tabel 1): voeg 1,3 pl 10 mM ROCK remmer 1,3 ml medium tot een uiteindelijke concen-tie van 10 uM, en polybreen een eindconcentratie 6 ug / ml.
   1. Voeg een geschikte hoeveelheid viraal concentraat (s) bij een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0 MOI (multipliciteit van infectie) van elk virus per cel. Blijf reactiemengsel op ijs of bij 4 ° C totdat het enkele celsuspensie bereid.
      OPMERKING: Dezelfde hoeveelheid MOI voor elk virus in de GATA1 / ETV2, GATA2 / Tal1 en GATA2 / Tal1 / LMO2 reactiemengsels optimaal is voor inductie van differentiatie. In ETV2 / GATA2 getransduceerde kweken verdubbelen traagheidsmoment voor GATA2 opzichte van ETV2, verbetert differentiatie. Daarom is voor deze culturen, verhouding 1: 2 voor MOI van ETV2 en 1 MOI van GATA2 aanbevolen (bijvoorbeeld als virale concentraat ongeveer 6,8 x 10 ⁷ deeltjes / ml wordt geschat, voeg 10 ul ETV2 en 20 gl GATA2 virale concentraten 0,68 x 10 ⁶ cellen per één ETV2 / GATA2 reactie in een 35 mm putje van een 6-wells plaat).
2. Bereid hPSCs in een enkele cel suspension.
   1. Groeien hPSCs in feeder-vrije omstandigheden zoals beschreven in hoofdstuk 2. Op dag 4 na de laatste passage, observeren cel dichtheid en morfologie onder een omgekeerde microscoop. hPSCs moet groeien in strakke kolonies met scherpe randen zonder spontane differentiatie en bereiken ~ 60-70% confluentie op de dag van transductie.
   2. Zuig medium, voeg 1,5-2 ml commercieel cel dissociatie reagens (tabel 1) per putje en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 5-7 min.
   3. Verzamel cellen in gelijke volumina commerciële compleet medium (zie Tabel 2) met 10 pM ROCK inhibitor, tellen de cellen en levensvatbaarheid te bepalen. Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten en vervolgens opnieuw in suspensie cellen commercieel compleet medium met 10 uM ROCK inhibitor een concentratie van 3,4-5 x 10 ⁶ cellen per ml.
      OPMERKING: levensvatbaarheid van de cellen is cruciaal voor een succesvolle virale transductie en de daaropvolgende differentiatie.Normaal gesproken moet de levensvatbaarheid van de cel voordat transductie meer dan 90%.
3. Voeg 200 ul van de celsuspensie gemaakt met 0,68-1 x10 ⁶ cellen in 1,3 ml van het reactiemedium bereid in 3,1.
4. Zuig het matrix oplossing uit de nacht beklede 6-wells plaat bereid in 2,2. Breng het reactiemengsel één putje van een 6-wells plaat en gelijkmatig verdelen cellen. Incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 24 uur. Na 24 uur ten minste 80% van de cellen aan de matrix worden verbonden.

4. Inductie van Hematoendothelial Voorlopers van hPSCs (Dag 1-7)

1. 24 uur na transductie, verwijdert virus bevattend medium en was verbonden cellen met commerciële incomplete celkweekmedium (zie tabel 1) en voeg vervolgens 3 ml per putje van commerciële incomplete celkweekmedium bevattende hematopoiëtische cytokinen: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml bFGF 20 ng / ml (hierna 3F-medium).
2. Vervang totaal gemiddeld vers 3F-medium op dagen 2, 3 en 4 dagen om dode cellen en resten te verwijderen. Na 4 dagen bij drijvende hematopoëtische cellen ontstaan, vervang de helft van het 3F-medium elke andere dag terwijl de totale volume van 4 ml.
   OPMERKING: pSIN-EF1α lentiviraal expressieplasmiden nemen puromycineresistentiegen waardoor voor positieve selectie van getransduceerde cellen. De 1 ug / ml puromycine kan tot medium worden toegevoegd tijdens de eerste 1-2 dagen van differentiatie naar alle resterende ongedifferentieerde hPSCs elimineren.
3. Observeren celmorfologie op dag 4 onder een omgekeerde microscoop: strakke clusters van cellen met typische endotheelcellen morfologie beginnen te verschijnen (Figuren 2A, 3A). Ronde bloedcellen blijkt van dag 5 tot dag 7 van differentiatie, terwijl sommige gebieden hPSCs morfologie kunnen behouden. Analyseer HE en hematopoëtische differentiatie zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: Succesvolle hematoendothelial verschillendeiation resulteert in de productie van bloedcellen die als refractiele knoopcellen losjes bevestigd aan onderliggende platte endotheelcellen weergegeven. Deze cellen actief verspreiden vormen kleine aggregaten, en uiteindelijk los te maken en vlotter (Figuren 2A en 3A). Live bloedcellen kan visueel onderscheiden van de dode en stervende cellen op basis van hun vermogen om het licht te reflecteren en uit te breiden in de kweekomstandigheden.

5. Analyse van Hemogenic endotheel (HE) Fase van Differentiatie.

1. Detecteren de vorming van HE tussen dag 3 en 4 van differentiatie door microscopische waarneming van endotheliale cellen met morfologie. Er zijn geen drijvende bloedcellen in de kweek in dit stadium van differentiatie. De aanwezigheid van HE kan worden bevestigd door immunofluorescente kleuring en flow cytometrische analyse met VE-cadherin, CD73, CD226 en CD43 antilichamen.
   1. Om HE vorming beoordelen door flowcytometrische analyse gebruik cellen op dag 3en dag 4 van het ene experiment. Verzamel cellen door incubatie van de kweken met commerciële cel dissociatie reagens (zie tabel 1) gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C, 5% CO ₂ en vervolgens tot 1 x 10 ⁵ cellen per kleurreactie (flowcytometrie beschreven kleuringsprocedure ^12).
      OPMERKING: VE-cadherine ⁺ HE cellen expressie van de vroege hematopoietische marker CD226 te verwerven, maar missen de expressie van CD73 en CD43 ^6. Daarentegen vereist de niet-HE cellen brengen CD73 (Figuren 2B, 3B).
2. Immunofluorescentiekleuring voor HPSC afgeleide HE.
   1. Was de bijgevoegde monolaag van cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bevestig cellen in 4% paraformaldehyde 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Was de cellen opnieuw met PBS en doorlaatbaar middels 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Was de cellen in PBS 2-3 keer en vervolgens incuberen inblokkerende buffer bestaande uit PBS met 10% foetaal runderserum (FBS), gedurende 30 tot 120 min.
   4. Bereid kleuroplossing, die zowel primaire antilichamen (1: 1000 verdunning) muizen anti-humaan CD43 en konijn anti-humaan VE-cadherine in PBS met 5% FBS, (tabel 1).
   5. Zuig het blokkerende buffer uit de cellen en voeg 1 ml per putje van kleuring buffer met de toegevoegde primaire antilichamen; Incubeer 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
   6. Was de cellen drie keer door toevoeging van 2 ml PBS met 5% FBS.
   7. Bereid een tweede kleurbuffer gemaakt met secundaire antilichamen bij 1: 500 verdunning in PBS met 5% FBS: ezel anti-konijn geconjugeerd met groene fluorescente kleurstof, en anti-muis geconjugeerd met rode fluorescerende kleurstof (tabel 1). Voeg 1 ml per putje van secundaire kleuring buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   8. Spoel driemaal met PBS zonder serum. Vlek cellen met 300 nm DAPI werkende oplossing in dH2 O 10-15 min.
   9. Was de cellen met PBS twee keer en voeg 2-3 ml PBS in de goed met gekleurde cellen. Observeren fluorescentie met groen, rood en blauw microscoop filters.

6. Analyse van Induced hematopoietische Voorlopers

1. Handhaaf differentiatie kweken tot drijvende cellen aanzienlijk vergroten, tot 10-14 dagen, veranderen de helft van het 3F-medium, zoals beschreven in 3,1, elke twee dagen.
2. Distantiëren en verzamel differentiërende monolagen van cellen door het behandelen van cellen met een commerciële cel dissociatie reagens (zie tabel 1) gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C, 5% _CO2.
3. Voer doorstroomcytometrie met behulp van anti-VE-cadherin, CD43 en CD45 antilichamen tegen hematopoiese in kweken ¹² evalueren. Merk op dat een groot deel van de cellen tot 40% van ETV2 en GATA2 getransduceerde cellen, co-uitdrukt VE-cad en CD43. De volgende antilichamen kunnen worden gebruikt om specifieke cellijnen volgende e detecterenXpansion of differentiatie van geïnduceerde bloed voorlopers: CD235a (erythroïde cellen), CD41a (megakaryocytische), CD32 (alle soorten van myeloïde cellen), CD66b (neutrofielen) en CD163 (macrofagen).
4. Voer CFC-test met behulp van een commercieel clonogene medium (Tabel 1) volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Overdracht 2/1 x 10 ⁴ cellen in 3 ml commercieel klonogene medium (zie Tabel 3) om het aantal kolonievormende cellen en types hemopoëtische koloniën beoordelen. Optimale zaaidichtheid maakt de identificatie en isolatie van afzonderlijke kolonies die groeien afzonderlijk van elkaar en elkaar niet overlappen. Zaaidichtheid kan variëren tussen experimenten afhankelijk differentiatie efficiency, maar mag niet meer dan 1 x 10 ⁴ cellen per 1 ml commercieel klonogene medium.
   2. Mengen cellen in commerciële klonogene medium door zachte vortexen, en de overdracht van 3 ml suspensie twee 35 mm ultra-low attachment gerechtenvoor CFK-test, 1,5 ml suspensie voor elk gerecht. Verdeel medium gelijkmatig en incubeer bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende 14 dagen. Voorkomen dat het verstoren van de gerechten; observeren kolonie formatie op dag 7 en dag 10 van de test.
   3. Identificeren en tel hematopoietische kolonies op basis van hun morfologie op dag 14.

Resultaten

Het schema van HE en bloed inductie van hPSCs door overexpressie van transcriptiefactoren wordt getoond in figuur 1. ETV2 met GATA1 of GATA2 combinatie induceert pan-myeloïde hematopoiese, terwijl een GATA2, Tal1 +/- LMO2 combinatie induceert hoofdzakelijk erythro-megakaryocyten hematopoiese. Beide TF combinaties direct geïnduceerde HE cellen die vervolgens omgezet in het bloed voorlopers met een duidelijke spectrum van hematopoietische differentiatie. Differentiatie van hPSCs van de pluripotente staat ...

Discussie

De hierboven beschreven werkwijze voor hematopoëtische differentiatie van hPSCs door overexpressie van TFs, is een snelle en doeltreffende benadering voor het genereren van HE en myeloïde en erytho-magakaryocytic progenitoren hESCs en iPSCs, waardoor de productie van maximaal 30 miljoen bloedcellen 1 miljoen pluripotente stamcellen ^10. Deze methode tentoongesteld consistente differentiatie in meerdere hESC en iPSCs lijnen ^10. Tijdens de differentiatie door ETV2 en GATA2, GATA1 factoren evenals GATA...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 1. Inductie van hPSCs differentiatie met transcriptiefactoren en analyse van hemogene endotheel en bloedcellen.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymeer gebruikt om de efficiëntie van infectie te verhogen
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK-padweginhibitor, remt ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Celdissociatiereagens
Incomplete (groeifactor-vrij) kweekmedium                                                  mTeSR1 Aangepaste formulering	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serumvrij mTeSR1-medium zonder bFGF en TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premiumkwaliteit
human TPO	Peprotech	300-18	Onderzoekskwaliteit
human FGF-basis	Peprotech	100-18B	Premiumkwaliteit
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endotheelmarker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietisch (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietisch (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endotheelmarker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietisch (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead-test (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Celfixatie
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilisatie
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Foetaal bovien serum
Muis anti-menselijk CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primaire antilichaam voor immunofluorescentie (IF)-kleuring
Konijn anti-menselijk VE-cadherine	BenderMedSystem	BMS158	Primair (IF)
Anti-konijn Alexa Fluor 488-geconjugeerd	JacksonResearch	715-486-152	Secundair (IF)
Anti-muis Alexa Fluor 594-geconjugeerd	JacksonResearch	715-516-150	Secundair (IF)
DAPI nucleïnezuurkleuring	Life Technologies	D1306	Live/Dead-test (IF)
Klonogene medium MethoCult H4435 Verrijkt	STEMCELL Technologies	4435	CFC-test
Wright-kleuringsoplossing	Sigma -Aldrich	32857	Kleuren van cytospins
Tabel 2. hPSCs-kweek.
Menselijk pluripotent stamcellen (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) menselijke embryonale stamcellen; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgeenvrije geïnduceerde pluripotente stamcellen	hPSCs zijn in staat tot zelfvernieuwing en kunnen differentiëren in cellen van drie kiembanden
Volledig serumvrij medium voor kweek van hPSCs                                                    mTeSR1 media	Wi