Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

Samenvatting

Een efficiënte, driedelige synthese van RAFT-gebaseerde fluorescerende glycopolymeren, bestaande uit glycomonomeervoorbereiding, copolymerisatie en post-modificatie, wordt gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gebruikt om RAFT-gebaseerde statistische glycopolymeren met gewenste structuren te bereiden.

Samenvatting

Synthetische glycopolymers zijn instrumentaal en veelzijdige instrumenten die gebruikt worden in verschillende biochemische en biomedische onderzoeksgebieden. Een voorbeeld van een gemakkelijke en efficiënte synthese van goed gecontroleerde fluorescent statistische glycopolymers via reversibele additie-fragmentatie chain transfer (RAFT) gebaseerde polymerisatie wordt aangetoond. De synthese begint met de bereiding van β-galactose-bevattende glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide, verkregen door reactie van lactobionolactone en N - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA). 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) wordt gebruikt als een structureel analogon ontbreekt een terminale β-galactoside. De volgende RAFT-gemedieerde copolymerisatiereactie omvat drie verschillende monomeren: N - (2-hydroxyethyl) acrylamide als spacer, AEMA als doelwit voor verdere fluorescentie labeling en de glycomonomers. Tolerant waterige systemen de RAFT, gebruikt bij de reactie (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate.Low dispersities (≤1.32), voorspelbare copolymeersamenstellingen en hoge reproduceerbaarheid van de polymerisaties werden waargenomen bij de producten. Fluorescent polymeren worden verkregen door modificeren van de glycopolymers met carboxyfluoresceïne succinimidyl ester gericht op het primaire amine functionele groepen op AEMA. Lectine-bindende specificiteiten van de resulterende glycopolymers worden geverifieerd door te testen met bijbehorende agarosekorrels gecoat met specifieke glycoepitope herkennen lectinen. Vanwege het gemak van de synthese, de strikte controle van het productsamenstellingen en de goede reproduceerbaarheid van de reactie, dit protocol kan worden vertaald richting bereiding van andere RAFT-gebaseerde glycopolymers specifieke structuren en samenstellingen, zoals gewenst.

Inleiding

In de afgelopen twee decennia hebben de onderzoeken met synthetische glycopolymers langzame maar voortdurende ontwikkeling doorgemaakt, waaruit een aanzienlijk potentieel in de behandeling van besmettelijke mechanismen die onderzoek dat zich richt op lectine erkenning verwerkt ^1-3 bevatten. Aangezien synthetische glycopolymers bezit multivalent suikergroepen vertonen veel hogere lectine-bindende efficacies, vergeleken met monovalente koolhydraten, ze van grote vraag in de glycobiologie gebied ^3. Van bijzonder belang bij klinisch onderzoek is het gebruik van fluorescente glycopolymers de lectine-gemedieerde bacteriële binding met koolhydraten op humane celoppervlakken en respiratoire slijmvliezen glycoproteïne karakteriseren. Vroege in vitro studies gebruikt handel verkrijgbare polyacrylamide gebaseerde glycopolymers in bacteriële binding testen. Verschillende van deze probes waren veelbelovend, maar bezorgdheid over, verkrijgbaarheid en lot-to-lot variaties in zowel polYmer molecuulgewicht en glycoepitope content. Een economische in-laboratoriumprotocol ontwikkeld die voorziet in een voldoende controle structuur inhoud, grootte en zuiverheid van synthetische glycopolymers richten bacteriële lectines.

In de zoektocht naar een geschikte synthetische benadering glycopolymers, werd een relatief nieuwe polymerisatietechniek getest met behulp van een soort van gecontroleerde radicaal-polymerisatie die omkeerbaar toevoeging-fragmentatie keten-overdracht (VLOT) agenten ⁴ toegepast. Dergelijke RAFT reagentia zijn onlangs gebruikt in enkele glycopolymer preparaten ^5-7. Vergeleken met andere glycopolymer bereiding protocollen RAFT-gemedieerde polymerisaties tonen verscheidene voordelen, waaronder de tolerantie voor verschillende monomeer structuren en reactieomstandigheden mogelijke verenigbaarheid met waterige oplossingen en geringe omvang dispersiteit van het gewenste polymere producten ^8,9. Van opmerkelijk belang zijn protocollen voor de bereiding van RAFT-based tri-component glycopolymers, waardoor regeling van samenstellingen van verschillende monomeren, die elk verschillende functies ^10-13 hebben. Echter, de meeste van het voorgaande onderzoek inspanningen hetzij ontbrak anomere hanger koolhydraten ¹⁰ of dienst getrapte polymerisaties resulteert in tri-blokcopolymeren, die uit covalent gebonden homopolymeren, die vaak voor verschillende doeleinden dan statistische polymeren die copolymeren zijn waarin de sequentie monomeer residuen volgt een statistische regel ^9-13.

Onlangs werd met het ge- thiocarbonylthio RAFT verbinding (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate in een waterige omgeving, de bereiding van een groep van RAFT-gebaseerde lineaire tri-component statistische glycopolymers met specifieke hanger suikers en hun toepassing in lectine-gemedieerde bacteriële binding proeven gerapporteerd ^14. Het algemene doel van deze methode, gepresenteerd op een visuele manier, is tri-component te bereidenstatistische fluorescerende glycopolymers via RAFT-gecontroleerde copolymerisatie. Vanwege het gemak van de eenstaps polymerisatie protocol, de nauwkeurige controle over de polymeerlengte en samenstellingen, en de hoge reproduceerbaarheid van de reactie, dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast op andere RAFT-gebaseerde synthesen van glycopolymers met de gewenste structuur.

Protocol

1. Synthese van 2-Glycomonomer Lactobionamidoethyl methacrylamide

1. Los 2 g lactobionzuur in 3,0 ml watervrije methanol en voeg langzaam absolute ethanol in een daling van de verstandige manier tot de oplossing wordt gewoon bewolkt, verwijder vervolgens de oplosmiddelen via draaiverdamping.
2. Los het residu uit stap 1,1, in 3,0 ml watervrij methanol en, nogmaals, voeg langzaam absolute ethanol tot ze troebel, dan verdampt het oplosmiddel via roterende verdamping. Herhaal deze stap 3 keer om lactobiono-1,5-lacton (1,94 g, 98% opbrengst) verkregen. Dit product is voldoende zuiver voor gebruik in de volgende reactie.
3. Voeg 1,0 g lactobionolactone in 3,0 ml methanol N - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0,58 g) en hydrochinon monomethyl ether (MEHQ, 1,0 mg), een remmer van zelf-polymerisatie, in 2,0 ml methanol, gevolgd door 1,0 ml triethylamine. Roer bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
4. Voeg 20 ml gedeïoniseerd _H2O (dH ₂ O) aan de reactiekolf, verwijder vervolgens de methanol en vrije triethylamine door verdamping tot droog via draaiverdamping.
5. Om overblijvende lactobionzuur verwijderen, voeg 20 ml dH ₂ O, vervolgens de waterige oplossing door een anionenuitwisselingskolom (OH ^- vorm, 10 mm x 20 mm) in een ontvangend bekerglas met 1,0 mg MEHQ.
6. Verwijder triethylamine, geproduceerd in stap 1,5, door verdampen tot droog via roterende verdamping.
7. Voeg 20 ml dH ₂ O en verwijder ongereageerd AEMA door langzaam toevoegen van 1 mg hoeveelheden van kationenuitwisselingshars (H ⁺ vorm) totdat geen ninhydrine reactieve materialen detecteerbaar. Controleer de verwijdering door middel van 1 pi aliquots van de oplossing na elke toevoeging hars, toe te passen op een dunnelaagchromatografie plate vervolgens sproeien van de plaat met een 2% ninhydrine in ethanol oplossing. Wanneer geen diepe blauwe kleur waargenomen ontwikkelen wanneer de plaat wordt verwarmd tot 90 ° C gedurende 1 min, is het eindpunt bereikt.
8. Filtreer de oplossing door een glasfilter, transfer van het filtraat in een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en dan Lyophilize.
9. Verwijder MEHQ uit het monster door oplossen van het gevriesdroogde materiaal in een minimale hoeveelheid methanol (-0,5 ml), voeg dan koud watervrije aceton (-20 ° C, 15 ml) om het product te precipiteren. Verzamel het neerslag door filtratie met een glasfilter, daarna droog het precipitaat in een exsiccator onder vacuüm om 2-lactobionamidoethyl methacrylamide (LAEMA) als een gebroken-wit poeder (0,94 g, 68% opbrengst) verkregen. Dit product is voldoende zuiver voor gebruik in de volgende reactie.

2. Synthese van 2-Monomer Gluconamidoethyl methacrylamide

Opmerking: De bereiding van 2-gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA), die een hanger suiker niet in het bezit, werd aangepast van een gepubliceerde methode ^15.

1. Voeg 2,0 g AEMA opgelost in 10 ml methanol om een ​​oplossingD-gluconolacton (1,6 g) in 30 ml methanol en onder roeren, voeg langzaam 1,6 ml triethylamine.
2. Roer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
3. Filtreer het neergeslagen product op een glasfilter en spoel het precipitaat drie maal met 10 ml van isopropanol, daarna wassen met 10 ml droge aceton. Droog het neergeslagen product in een exsiccator onder vacuüm.

3. VLOT Glycopolymer Synthese

1. Om de remmer MEHQ aanwezig handelsnaam verwijderen - (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), voeg 1 ml HEAA een 2 ml microcentrifugebuis, gevolgd door toevoeging van 0,5 g aluminiumoxide nanodeeltjes. Centrifugeer de buis bij 300 g gedurende 30 sec, en met de toplaag HEAA in de volgende reactie.
2. Voeg voorzichtig 32,8 mg LAEMA (70,0 umol), 1,7 mg AEMA (10,5 umol) en 27,5 pl HEAA (270 umol), alle opgelost in 0,4 ml dH ₂ O, een goed gereinigde 1 ml Schlenk tube, waardoor met een Monomer molverhouding van 20: 3: 77.
3. Bij een parallelle reactie om de controle polymeren die geen tegenhanger suiker bezitten, produceren in plaats van het gebruik LAEMA in stap 3,2, vervangen 21,4 mg GAEMA (70,0 umol) in de reactie.
4. De respectieve Schlenk buis (bijv 3,2 of 3,3), achtereenvolgens voeg 50 pl DMF dat 0,53 mg (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate (1,9 umol, RAFT agent) en 50 ui DMF dat 250 ug 4,4'-azobis- (4-cyanovaleriaanzuur) (0,9 umol, initiator). Meng door vinger tikken.
5. Bevriezen van de inhoud in de Schlenkbuis gebruik van een droogijs: ethanol bad (75 g droog ijs in 100 ml ethanol), het toepassen van een vacuüm binnen 10-50 mTorr, sluit de Schlenk ventiel en toestaan ​​dat de oplossing om langzaam te ontdooien RT . Herhaal deze freeze-Evacuatie-dooi cyclus nog twee keer. Zorg ervoor dat alle reagentia worden opgelost na de laatste dooi.
6. Plaats de Schlenkbuis in een afsluitbare plastic bag, evacueren lucht van de zak, en sluit het dan. Breng de zak met de Schlenk buis een voorverwarmd waterbad bij 70 ° C en incubeer 24 uur.
7. Breng voorzichtig de oplossing in de Schlenk buis een voorbereid dialysezak (MWCO = 3500) en dialyseer tegen dH ₂ O (10 x 2 l) gedurende 24 uur, verandert de dH ₂ O elk uur gedurende de eerste 8 uur. Na dialyse Breng het monster uit de dialysebuizen een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en vervolgens lyofiliseren.

Opmerking: Het verkregen statistische poly-methacrylamide / acrylamide (PMA) copolymeren dat aanhangende 4- O -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (van Stap 3,2) of D-gluconamide (uit stap 3.3), respectievelijk, zijn verkregen. Voor het gemak van bespreking, zijn deze twee glycopolymers afgekort als PMA-LAEMA en PMA-GAEMA resp.

4. Post-modificatie van Glycopolymers met Fluoroforen

1. Los 5,0 mg glycopolymer PMA-LAEMA of PMA-GAEMA bevattende ~ 0,9 pmol primaire aminefunctionele groepen in 0,9 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M natriumfosfaat, 0,15 M NaCl, pH 7,5), respectievelijk.
2. Voeg langzaam 0,6 mg carboxyfluoresceïne succinimidyl ester in 100 pi DMF aan de oplossing onder snel roeren. Roer de reactie 16 uur in het donker bij kamertemperatuur.
3. Terwijl beschermd tegen licht, laadt het monster in een voorbereide dialyseslang (MWCO = 3500) en dialyseer tegen dH ₂ O (2 L) gedurende 16 uur, verandert de dialyseoplossing elk uur gedurende de eerste 8 uur. Na dialyse Breng het monster uit de dialysebuizen een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en vervolgens lyofiliseren.

Opmerking: Na vriesdroging, fluorescent glycopolymers PMA-LAEMA-fluoresceïne en PMA-GAEMA-fluoresceïne, respectievelijk, worden verkregen.

5. Analyse van de Glycopolymeren

1. Bepaal het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn), het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht (Mw) en de dispersiteit (Mw / Mn) van de glycopolymers op commerciële HPLC systeem uitgerust met gelpermeatiechromatografie (GPC) software, een GPC kolom geschikt voor het molecuulgewicht van belang en een brekingsindex detector, gebruik van 0,1 M Tris / 0,1 M natriumchloride (pH 7) als eluent met een stroomsnelheid van 0,6 ml / min ^14. Met polyethyleenglycol normen molecuulgewichtstandaards (MW: 200-1,200,000 g / mol).
2. Kwantificeren van de feitelijke concentraties primaire aminefunctionele groepen in de glycopolymers ^16. Analyseer het totale koolhydraatgehalte van de gesynthetiseerde glycopolymers volgens een gepubliceerde werkwijze ^17.
3. Voer testen van de structurele samenstelling en de zuiverheid van de glycomonomers LAEMA, GAEMA en glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA in D ₂ O met behulp van NMR-spectroscopie ¹⁴.

6. Binding Tests van de synthetische Glycopolymers met lectine-gecoate agaroseparels

1. Voeg 1,5 ml van PBS tot 50 ul van de schorsing van Erythrina crista-galli lectine (ECL) gecoate agarosekorrels, centrifuge bij 300 xg gedurende 1 minuut en verwijder voorzichtig en gooi het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal, en resuspendeer de korrels in 0,5 ml PBS.
2. Voeg 3 ug PMA-LAEMA-fluoresceïne of PMA-GAEMA-fluoresceïne (negatieve controle) in 6 pl PBS aan de parels suspensie, en incubeer de mengsels, in het donker, bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
3. Was de mengsels met 1,5 ml PBS driemaal, en resuspendeer kralen in 0,2 ml PBS. Plaats een monster (4 pl) in een goed op een immunofluorescentie microscoopglaasje (Teflon-coating), dek af met een deksel slip, en observeren met behulp van fluorescentie microscopie met een FITC-filter (excitatiegolflengte: 467-498 nm, emissiegolflengte: 513- 566 nm) en een 10x objectief te onderzoeken van de binding van tHij fluorescent glycopolymers de kralen ^14.

Resultaten

Synthese van glycomonomer

Lactobionzuur werd hier gebruikt als voorbeeld voor de bereiding van glycomonomers. Met behulp van methoden in het eerste verslag over de synthese van LAEMA ^11, werden gevarieerd rendementen in de voorbereiding met onbevredigende zuiverheid waargenomen. De gemodificeerde zuiveringswerkwijze gebruik kation en anion-uitwisselende harsen om onomgezet uitgangsmateriaal aangeboden stabiel product opbrengst en hoge zuiverheid, hetgeen wordt bevestigd door ^1H en ^13C NMR-spectroscopie (figuur 1) te verwijderen.

VLOT glycopolymer synthese en post-modificatie van glycopolymers met fluoroforen

In tegenstelling tot de block-glycopolymers bereid met verhoogde RAFT polymerisaties Deze eenstaps copolymerisatie protocol verschaft een gelijkmatige glycomonomer verdeling over het polymeerskelet. De hier getoonde glycopolymers bevat 20 mol% van glycomonomer, 77 mol% van HEAA als afstandhouder en 3 mol% van AEMA als doelwit voor post-modificaties (zie figuur 2). ¹ H- en ^{13C-NMR-spectroscopie} bevestigde de structuur van PMA-LAEMA en PMA-GAEMA (Figuren 3 en 4). Zoals getoond in figuur 5, wanneer uitgezet tegen de GPC elutieprofielen van de glycopolymer gesynthetiseerde zonder RAFT, zowel PMA-LAEMA en PMA-GAEMA lage dispersities, waaruit de effectiviteit van de RAFT benadering. Zoals verwacht, PMA-GAEMA een Mn kleiner dan die van PMA-LAEMA vanwege PMA-GAEMA Het gebrek aan een tegenhanger suiker. Analyse van de koolhydraten en primaire aminefunctionele groepen inhoud van de RAFT glycopolymers gebleken dat de verhouding van monomeren in het product glycopolymers strookt met de stoichiometrische verhouding van uitgangsmonomeren die bij de RAFT-gemedieerde polymerisatie reactie (Tabel 1). Dit betekent een strakke controle van het monomeer compositions in de gesynthetiseerde glycopolymers volgens ontwerp.

Omzetting van primair amine functionele groepen met actieve fluoroforen is een algemeen gebruikte techniek bij het merken van eiwitten. Deze techniek werd hier gebruikt om gezuiverd glycopolymers label met carboxyfluoresceïne. Na post-modificatie, werden fluorescent polymeren verkregen (Figuur 6). Geen degradatie van de fluoresceïne-gelabelde polymeren in de reactie werd gedetecteerd met behulp van GPC-analyse (data niet getoond).

Binding testen van de synthetische glycopolymers met lectine gecoate agaroseparels

Om het lectine-bindende specificiteit van het gesynthetiseerde glycopolymers beoordelen, lectine-agarose korrels bekleed met bekende koolhydraat-bindende specificiteit werd gebruikt. Erythrina crista-galli lectine (ECL), toegepast in de experimenten een bindende specificiteit voor β-D-galactoside. Figuur 7A toont dat PMA-LAEMA-Fl duidelijkuorescein, waarbij β-D-galactoside als hanger koolhydraat bevat, vertoonde sterke binding met de ECL lectine. In tegenstelling, de negatieve binding aan de ECL van de glycopolymer PMA-GAEMA-fluoresceïne, die een aanhangende suiker bezit, wordt getoond in Figuur 7B. Dit resultaat illustreert de binding doeltreffendheid en affiniteit van de gesynthetiseerde fluorescente glycopolymer.

Figuur 1. Assigned ¹ H- (a) en ¹³ C-NMR (b) spectra (D ₂ O) voor LAEMA. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. ¹⁴⁾ Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 2. Schematische weergave van de synthese van fluorescerende glycopolymer PMA-LAEMA met β-galactoside als hanger suiker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Assigned ¹ H- (A) en ¹³ C-NMR (B) spectra (D ₂ O) voor de PMA-LAEMA glycopolymer. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. ¹⁴⁾ Pleidooise klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Assigned ¹ H- (A) en ¹³ C-NMR (B) spectra (D ₂ O) voor de PMA-GAEMA. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. ¹⁴⁾ Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Figuur 5. Gel permeatie chromatografie sporen van RAFT-gebaseerde PMA-GAEMA en PMA-LAEMA bereid met en zonder dat RAFT agens. In tegenstelling tot de PMA-LAEMA bereid zonder RAFT middel (blauw), RAFT- gebaseerd PMA-LAEMA (green) een veel lagere dispersiteit (Mw / Mn). RAFT-gebaseerde PMA-GAEMA (rood) en PMA-LAEMA hebben soortgelijke GPC-profielen, maar de voormalige heeft een kleinere Mn te wijten aan het ontbreken van een hanger suikers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. PMA-LAEMA vóór en na de post-modificatie met fluorofoor. (A) in vergelijking met witte niet-gelabelde glycopolymer (links tube), fluoresceïne-gelabelde PMA-LAEMA toont een sterke gele kleur (rechts tube). (B) onder UV, ongelabelde PMA-LAEMA (linkerbuis, 1 mg / ml in PBS) donker en weer zonder fluorescentie, terwijl fluoresceïne-gelabelde PMA-LAEMA (rechterbuis, 1 mg / ml in PBS) shows sterke groene fluorescentie.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Erythrina crista-galli lectine (ECL) gecoate agarose korrels binden β-D-galactoside bevat glycopolymers, en niet die geen tegenhanger suiker bezit. (A) PMA-LAEMA-fluoresceïne (3 ug) toonden sterke binding met ECL , terwijl in (B) PMA-GAEMA-fluoresceïne, die geen tegenhanger β-D-galactoside residu bezit, vertoonde geen binding aan de lectine beklede parels. Schaal bar = 100 micrometer.

Tabel 1. Targeting waarden ^een van synthetische parameters en de feitelijke samenstelling van de glycopolymers. A) Targeting waarden, waarden diegewenst van de produkten; b) DP, polymerisatiegraad; c) NA, niet beschikbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	DP b	Dispersiteit	Eigenlijke inhoud van glycomonomers mol%	Werkelijke gehalte aan primaire amine mol%
Targeting waarden	100	<1,3	20	3
PMA-LAEMA	99	1.26	19	3.2
PMA-GAEMA	89	1.32	NA c	2.7

Discussie

Een gemakkelijke en efficiënte protocol voor RAFT-gebaseerde tri-fluorescente component glycopolymers, met en zonder hangers koolhydraten en hun toepassing in een lectine-bindende test wordt aangetoond in dit rapport. Het protocol begint met de voorbereiding van glycomonomers LAEMA en GAEMA. Via een één-stap-VLOT gecontroleerde copolymerisatie, glycopolymers met reproduceerbare opbrengst, voorspelbare monomeersamenstelling en lage dispersiteit, worden verkregen. Worden bij een modificatie van glycopolymers met carboxyfluoresceïne succinimidyl ester, de binding van de resulterende respectievelijke fluorescent-gelabelde glycopolymer gemakkelijk testbaar om zijn lectine bindingsspecificiteit.

In de initiële voorbereidende stappen van de glycomonomers die worden toegepast in de daaropvolgende glycopolymer syntheses, beschikbaar lactobionzuur en gluconolacton werden gebruikt. In theorie zou elk koolhydraten plaats van monosacchariden tot complexe Oligosacchariden, Converte kand om glycomonomers door het conjugeren van het doel suiker op de primaire hydroxylgroep op de C6 van glucose. Na oxidatie van het reducerende glucoserest en de daaropvolgende dehydratatie tot een lacton, kan het product daarna gemakkelijk in reactie gebracht met het primaire amine op AEMA de overeenkomstige glycomonomer vormen. Verdere voorbeelden van deze verbinding kan worden gezien in een recent rapport ^14. Opgemerkt wordt dat voordat zij een polymerisatiestap, MEHQ, een krachtige polymerisatie-inhibitor, worden uit alle monomeer en glycomonomer preparaten juist voor gebruik verwijderd. Dit wordt eenvoudig volbracht door de minimale hoeveelheid methanol om de glycomonomer die bezit MEHQ dan onmiddellijk behandelen met aceton bij -20 ° C aan het inhibitor vrij product in hoge opbrengst precipitaat op te lossen.

Essentieel in radicale polymerisatie regeling, aandacht voor detail en monomeer zuiverheden worden benadrukt. Zoals typerend voor een RAFT polymerisatiesysteem, het bestaat uiteen radicaalbron, een RAFT reagens, een monomeer en oplosmiddel. In deze presentatie gevisualiseerd wordt een eenstaps RAFT polymerisatiesysteem beschreven dat zich richt op de produktie van gegenereerd uit een reactiemengsel bezit drie verschillende monomeren in een waterige oplossing statistische copolymeren. Twee afzonderlijke RAFT-gemedieerde reacties worden waarbij men gebruik maakt van een glycomonomer die een aanhangende bezit, non-reducerende koolhydraten terminus (bijv β-D-galactose), en anderzijds bezit van een polyol zonder gebonden koolhydraatresidu. Gemeenschappelijk voor beide RAFT-gemedieerde reacties waren monomeren bezitten een unieke hydroxylgroep die dient als afstandhouder molecuul en ander bezit een vrije amine voor post-modificatie met een amino-reactieve fluorofoor.

Aangezien de aanwezigheid van zuurstof in het reactiemengsel en omgeving nadelig voor RAFT-gemedieerde polymerisatie wordt de verwijdering op niveau traceren gemakkelijk verkregen via verscheidene vries-evaCuate-dooi cycli terwijl de Schlenk tube reaktievat onder hoog vacuum.

Opgemerkt wordt dat de molaire verhouding van verschillende monomeren in het reactiemengsel kan worden bijgesteld te worden. Ook, door het variëren van de hoeveelheid RAFT middel gebruikt, de lengte van de verkregen polymeren kan worden gecontroleerd ^18. Wel dient de molaire verhouding van de RAFT agent initiator altijd groter dan twee zijn de lage polydispersiteit van het product te waarborgen. Onder deze omstandigheden is de ontwikkeling van de copolymerisatie is stabiel, en de reproduceerbaarheid van de reactie is zeer hoog. Dat gezegd zijnde, is het onwaarschijnlijk dat men verkrijgt een geheel gelijkmatige verdeling van alle deelnemende monomeren binnen een statistisch copolymeer, vanwege hun verschillende polymerisatie- snelheden. Karakteriseren van de verdeling van de verschillende monomeren in het polymeer nog steeds zeer uitdagend.

De post-modificatie methode, hier wordt gepresenteerd, is zowel eenvoudiger en amenable het gebruik van een bredere selectie van fluorescente labels, in vergelijking met andere protocollen toegepast label glycopolymers ^2,11. Deze zouden omvatten veel van de in water oplosbare amine-reactieve fluoroforen, quantum dots, biotine, en anderen. De bindende specificiteiten van de gesynthetiseerde, geëtiketteerd glycopolymers zijn gemakkelijk controleerbaar met behulp van lectinen met bekende bindingsaffiniteiten. PMA-GAEMA bezitten geen hanger suiker is een passende negatieve controle. Glycopolymers met verschillende fluorescente labels bereid via deze route met succes gebruikt bij onderzoek van lectine-gemedieerde bacteriële binding ^14. Zoals weergegeven, dient deze gemakkelijke en efficiënte bereiding van statistische fluorescent glycopolymers groot potentieel bieden om een ​​groot aantal glycobiologische onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens
Lactobionzuur	Sigma-Aldrich	153516
D-Gluconolacton	Sigma-Aldrich	G2164
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA)	Sigma-Aldrich	697931
Oranje II natriumzout	Sigma-Aldrich	O8126
Hydrochinon monomethylether (MEHQ)	Sigma-Aldrich	54050	Polymerisatie-remmer
N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride (AEMA)	Polysciences, Inc	24833-5
Triethylamine	Fisher Scientific	BP-616
Aanion-uitwisselingshars IRN-78 hydroxide-vorm, 80 mesh	Sigma-Aldrich	10343-U
Kation-uitwisselingshars 50Wx8, 200 mesh	Sigma-Aldrich	217514
Aluminiumoxide, ~150 mesh	Sigma-Aldrich	A1522	Type WN-6, Neutraal, Activiteitsgraad Super I
Ninhydrine	Sigma-Aldrich	N4876	Een ethanoloplossing van 0,2% ninhydrine werd gebruikt in de test
4-Cyano-4-(fenylcarbonothioylthio)pentaanzuur	Sigma-Aldrich	722995	RAFT-middel
4,4′-Azobis(4-cyanovalerinezuur)	Sigma-Aldrich	11588	Polymerisatie-initiator
Carboxyfluoresceine succinimidyl ester	Life Technologies	C1157
Erythrina Cristagalli lectin gecoate agarose kraal	Vector Laboratories	AL-1143
Oplosmiddel
dH2O			Geproduceerd door Barnstead waterzuiveringssysteem, 18 megOhm-cm
Isopropanol	Fisher Scientific	A461-4	ACS-kwaliteit of beter
Methanol	Fisher Scientific	A454-4	ACS-kwaliteit of beter
Absoluut ethanol	Fisher Scientific	BP2818-100	ACS-kwaliteit of beter
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	22705	ACS-kwaliteit of beter
Aceton	Fisher Scientific	A929-4	ACS-kwaliteit of beter
Apparatuur
Dialymembraan (MWCO: 3.500)	Spectrum Labs	132720
Polyethyleenglycol analytische standaard	Sigma-Aldrich	O2393
Schlenkbuis, 1 ml	Quark Glass		Op maat gemaakt
TSK-GEL G4000 PWxl	Tosoh Bioscience	8022	Gebruikt voor GPC-analyse van de glycopolymeren
Empower 3 met GPC/SEC-pakket	Waters Corporation
Waters Alliance HPLC-systeem	Waters Corporation		Uitgerust met refractieve indexdetector (Waters 2414) en fluorescentiedetector (Waters 2475)
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer	Bruker Corporation
BX43 fluorescentiemicroscoop	Olympus Corporation		Gebruikt met FITC-filter in de glycopolymeerbindingstest
Rotavap / Roto-evaporator	Heidolph
Fritted disc snel	Fisher Scientific	10-310-109
Lyofilizzator	Labconco
Immunofluorescence microscoopglas	Polysciences	18357-1
Revco Ultima Plus -80 °C Vriezer	Thermo Scientific
Plastiek vacuümzak en handpomp	Ziploc
Vacuumpomp, directe aandrijving, Maxima C Plus	Fisher Scientific
Vacuummeter	Sargent-Welch