Protocollen voor Robuuste herbicideresistentie testen in verschillende Weed Species

Samenvatting

Een robuuste en flexibele aanpak om herbicideresistentie in onkruidpopulaties te bevestigen wordt gepresenteerd. Dit protocol maakt het mogelijk om de niveaus van herbicideresistentie te bepalen en toe te passen op een breed scala aan onkruidsoorten en herbiciden met kleine aanpassingen.

Samenvatting

Robuuste protocollen om vermeende herbicideresistente onkruidpopulaties op het niveau van de hele plant te testen, zijn essentieel om de resistentiestatus te bevestigen. De gepresenteerde protocollen, gebaseerd op bioassays met hele planten uitgevoerd in een kas, kunnen gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala aan onkruidsoorten en herbiciden door middel van geschikte varianten. Zaadmonsters van planten die een herbicidebehandeling op het veld hebben overleefd, worden verzameld en droog op een lage temperatuur bewaard totdat ze worden gebruikt. De kiemingsmethoden verschillen afhankelijk van de onkruidsoorten en het type zaaddormantie. Zaailingen in een vergelijkbare groeifase worden overgeplant en in de kas onder de juiste omstandigheden gehouden totdat de planten de juiste groeifase hebben bereikt voor herbicidebehandeling. Nauwkeurigheid is vereist om de herbicide-oplossing te bereiden om oncontroleerbare fouten te voorkomen. Andere cruciale stappen zoals het toepassingsvolume en de snelheid van spuiten worden ook geëvalueerd. De voordelen van dit protocol, in vergelijking met andere gebaseerd op bioassays met hele planten met één herbicidedosering, hebben betrekking op de hogere betrouwbaarheid en de mogelijkheid om het resistentieniveau af te leiden. Snellere en goedkopere in vivo of in vitro diagnostische screeningstests zijn voorgesteld (Petrischaal-bioassays, spectrofotometrische tests), maar deze leveren alleen kwalitatieve informatie en het brede gebruik ervan wordt belemmerd door de arbeidsintensieve instelling die sommige soorten mogelijk vereisen. Voor routinematig resistentietesten kan de voorgestelde bioassay met hele planten worden toegepast bij slechts één herbicidedosering, waardoor de kosten worden verlaagd.

Inleiding

Herbiciden zijn de meest intensief gebruikt onkruidbestrijding maatregel, goed voor maximaal 50% van de wereldwijde markt van gewasbeschermingsmiddelen ^1. Ze zijn relatief goedkoop gereedschap, voorkomen arbeidsintensief en tijdrovend grondbewerking praktijken, en uiteindelijk resulteren in een kosten-effectieve, veilige en winstgevende productie van levensmiddelen ^2. Echter, de grote fenologische en genetische variabiliteit aanwezig in veel onkruidsoorten, samen met een over-afhankelijkheid van herbiciden gebruik, vaak resulteert in de selectie van de herbicide-resistente onkruid populaties. De introductie van selectieve herbiciden met een zeer specifieke metabole doelgroep ^3-5 is dramatisch toegenomen het aantal gevallen verzet door de jaren heen. Tot op heden zijn 240 onkruidsoorten (140 tweezaadlobbigen en eenzaadlobbigen 100) wereldwijd resistentie tegen verschillende herbicide werkingsplaatsen (SOA) ⁴ ontstaan. Dit is een grote zorg voor het beheer van onkruid en meer in het algemeen voor de duurzame productie van gewassen.

e_content "> Vroege opsporing van resistentie, op basis van betrouwbare tests vaak uitgevoerd in een kas, is een belangrijke stap om herbicide resistente onkruiden te beheren. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld op basis van de doelstellingen, de gewenste mate van nauwkeurigheid, tijd en middelen beschikbaar zijn, zoals Naast de onkruidsoorten als ^6-12. Wanneer echter de bevestiging van het resistentieprofiel van nieuwe onkruid biotype is vereist (dat wil zeggen een groep individuen die verschillende fysiologische kenmerken hebben, waaronder het vermogen om één of meer herbiciden behoren tot een overleven bepaalde groep toegepast in een dosis die ze normaal zouden regelen), een robuuste hele plant bioassay heeft in een gecontroleerde omgeving ^{4, 11} worden uitgevoerd.

Een biotype is zelden bestand tegen slechts één herbicide. Elke biotype wordt dus gekenmerkt door een zekere resistentiepatroon, dwz, aantal en type van SoA van herbiciden is het bestand tegen en door een bepaalde weerstandniveau om elke herbicide ^13. De vroege en betrouwbare bepaling van het patroon van kruis of meervoudige resistentie ^{5, 14} is belangrijk voor veldresistentie management.

Vermeldenswaardig is dat herbicideresistentie heeft niets te maken met de natuurlijke tolerantie waard dat sommige onkruidsoorten vertonen richting sommige herbiciden, bijvoorbeeld, tweezaadlobbige soorten vs. ACCase-remmende herbiciden, eenzaadlobbige soorten vs. 2,4-D, heermoes vs. glyfosaat.

Dit document presenteert een robuuste aanpak voor het testen van vermeende herbicide resistente biotypen bemonsterd op gebieden waar de slechte controle van herbicide (s) had gemeld. Relevant varianten de standaardprotocollen met betrekking tot de onkruidsoorten betrokken worden. De voordelen ten opzichte van alternatieve technieken / protocols gebaseerd op ofwel hele plant bioassays met één herbicide dosis ¹⁵ of behandelen zaden in Petrischalen ⁸ zijn aan de hogere reliabiliteit en kan worden afgeleid van de weerstand door de toevoeging van twee herbicide doses in de experimenten. Voor routine resistentietest, dezelfde werkwijzen kunnen worden toegepast op slechts één herbicide dosis, zodat de kosten verlagen.

Evenals waardoor bevestiging van de status van de weerstand, kan de verkregen informatie worden gebruikt voor zowel het optimaliseren van de volgende stappen in het onderzoek en / of het bedenken van geluid weerstand management strategieën.

Protocol

1. Zaad Sampling en opslag

1. Monitor akkers voor ongerechtvaardigde slechte herbicide, dwz niet te wijten aan ongunstige klimatologische omstandigheden of lage kwaliteit herbicide behandelingen.
2. Verzamel een zaadmonster van één soort in een tijd en wijs een unieke code. Rijpe zaden worden meestal verzameld voordat gewassen oogsten van planten die het herbicide behandeling (s) had overleefd. Tijdige-monitor om te zien of de zaden worden vergoten door de moederplant wanneer rijp.
3. Vul een formulier voor elk monster met vermelding van de toegekende unieke code, naam van de soort, de collectie datum, GPS-coördinaten, de gemeente, de naam van de landbouwer, veldgrootte, besmetting niveau, gewas, herbicide (s) gebruikt tijdens het seizoen en historische verslagen van het veld .
4. Verzamel zaden van ten minste 30 willekeurig geselecteerde planten die representatief zijn voor het veld besmetting zijn. Zorg ervoor dat het zaad sample bevat ten minste 5000 rijpe zaden. Voor een obligaat uitkruising onkruidsoorten(Bijvoorbeeld Lolium spp. En Amaranthus spp.), Vermindering van het aantal planten 10-15, waarbij het ​​totale aantal zaden ongeveer 5000 ^11.
5. Sub-proeven van het veld als flarden van onkruid zijn verspreid over grote gebieden (meer dan een hectare) als verschillende herbicide resistente biotypen worden geselecteerd.
6. Store zaden in niet-gesloten papieren zakken gelabeld met de unieke code toegewezen.
7. Laat vocht verdampen maar zaden niet bloot aan hoge temperaturen (dat wil zeggen, voorkomen dat ze in een auto in de zon) of voor extreme temperatuurschommelingen de inductie van secundaire slaaptoestand te voorkomen.
8. Clean (verwijderen kaf, de romp seeds, etc.) en opgeslagen bij omgevingstemperatuur in een droge ruimte. Na het uitvoeren van de eerste resistentietoetsen, slaan de zaden gedurende langere tijd in een donkere kamer bij 4 ° C, bij voorkeur in vacuum afgesloten plastic zakken. Op deze manier zaden hun levensvatbaarheid te behouden voor een aanzienlijk langere tijd.

2. Kiemrust Breaking

OPMERKING: kiemrust biedt een flexibele en efficiënte mechanisme dat onkruid staat stelt zich aan te passen en volharden in agro-ecosystemen. Om kiemrust verbreken en laten ontkiemen van zaden, verschillende protocollen moeten worden gebruikt afhankelijk van onkruidsoorten, bijvoorbeeld, het type kiemrust ^16.
Er zijn drie belangrijke manieren om slaaptoestand te verwijderen:

1. Vernalisatie
   OPMERKING: Om gelijktijdige kieming en zaailing opkomst, een periode van zaad vernalisatie variërend van een paar dagen tot een week te verkrijgen is vereist om fysiologische slaaptoestand van vele soorten te verwijderen:. Bv papegaaienkruid, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, Polygonum Persicaria , Phalaris paradoxa ^17-19. Een langere periode van maximaal 15 dagen is vereist Papaver rhoeas, Cyperus difformis en Ammania coccinea en tot 30 dagen Schoenoplectus mucronatus 20.
   1. Doe wat gedemineraliseerd water in plastic schaaltjes. Snij twee lagen filterpapier en genieten ze in het water, verwijder overtollige hoeveelheden. Plaats de zaden luchtgedroogd op het papier. Breng de plastic schaaltjes een koelkast bij 4 ° C gedurende de vereiste tijdsperiode.
2. Insnijding
   OPMERKING: sommige onkruidsoorten zijn recalcitrant kieming dan anderen door mechanische slaaptoestand, namelijk zaadhuid kenmerken en de aanwending van een chemische scarification gebruiken zwavelzuur ontkiemen ^21.
   1. Bereid een bekerglas met geconcentreerd zwavelzuur (95-98%). Bereid een beker vol water. De zaden in een omhulsel van niet-geweven stof.
   2. Geniet bijvoorbeeld Echinochloa spp. Of Sorghum halepense zaad voor 20 min of 5 min, respectievelijk in geconcentreerd zwavelzuur.
   3. Neem de envelop uit de beker met behulp van een pincet en zet het in de beker vol met water. Open deenvelop, zet de zaden in een klein vergiet en spoel ze grondig onder stromend water.
   Variant: A. plantago-aquatica heeft een ander protocol ^{22, 23}
   1. Week de zaden gedurende 2 minuten in chloroform. Spoel de zaden met gedemineraliseerd water en droog ze met absorberend papier. Dompel de zaden in 80% zwavelzuur gedurende 5 min.
   2. Doe de zaadjes in een klein vergiet en spoel ze grondig onder stromend water.
3. Post-zaaizaad rijping
   OPMERKING: Zaden van andere onkruidsoorten helemaal niet ontkiemen voor een paar maanden na de vervaldag, ongeacht de gebruikte methode om kiemrust te breken.
   1. Bewaar de zaden voor een periode van ten minste 3-4 maanden bij RT en een lage luchtvochtigheid en volg de bovenstaande protocollen voor kiemrust verbreken (bijvoorbeeld, Oryza sativa var. Sylvatica of P. rhoeas).

3. zaadontkieming

1. Place zaden worden ontkiemd in plastic platen met 0,6% (m / v) agar met 0,1% kaliumnitraat (KNO ₃₎ toegevoegd:
   1. Bereid een oplossing van agar bij 0,6% + 0,1% KNO ₃ via gedeïoniseerd water. Los de agar in een magnetronoven.
   2. Giet de agar oplossing in plastic schaaltjes. Koel de substraat en vervolgens in de zaden.
   Variant: Grond kan ook worden gebruikt als een substraat in plastic schaaltjes. Deze praktijk is bijzonder efficiënt voor Echinochloa spp., S. halepense en Lolium spp.
2. Plaats plastic schotels in een kiemkast voor ongeveer een week met licht en temperatuur afhankelijk van de optimale omstandigheden voor elk onkruidsoorten. Voor de meeste soorten winter, is het temperatuurbereik 15/25 ° C nacht / dag en 12 uur fotoperiode met neonbuizen die een fotosynthetische Photon Flux Density (PPFD) van 15-30 umol m ^-2 sec ^-1. Voor veel soorten zomer, is het temperatuurbereik 15/30 ° C nacht / dag.
   Variant: Some species, zoals S. halepense, moet een warmtebehandeling. Dus na de scarification, zaden van S. halepense worden onderworpen aan de volgende voorwaarden: cycli van 4 uur bij 45 ° C en 20 uur bij 24 ° C gedurende drie dagen in de kiemkast en vervolgens drie dagen onder normale omstandigheden.

4. Seedling transplanteren en groei

1. Transplant vijftien tot twintig zaailingen in plastic bakjes (325 x 265 x 95 mm) gevuld met een standaard potgrond (60% slibrijke leemgrond, 15% zand, 15% en 10% agriperlite veen - in volume).
   OPMERKING: Verplanten plaats van direct inzaaien, kan een uniforme stand van planten in hetzelfde groeistadium te verkrijgen, hetgeen een belangrijke voorwaarde voor de uitvoering van de herbicide behandeling optimaliseren.
2. Identificeer elke lade met een barcode met alle informatie voor de unieke identificatie: bevolking code, herbicide wordt getest, repliceren nummer en progressieve lade nummer <./ Li>
3. Plaats trays in een verwarmde kas en waterplanten als nodig is om het substraat op of nabij veld te handhaven.
   OPMERKING: De groei varieert, afhankelijk van de onkruidsoorten. Vaak tests worden uitgevoerd in de herfst / winter / voorjaar, zo licht wordt aangevuld met 400 W metaalhalogeenlampen, die een PPFD voorzien van ongeveer 150 umol m ^-2 s ^-1 en een 12 uur fotoperiode ^{24, 19.} Zomer wiet soorten met C ₄ fotosynthetische cyclus vereisen doorgaans een hogere lichtsterkte en dus tests worden gedaan in de late lente-zomer of de aangevuld lichtintensiteit is ongeveer 400 umol m ^-2 sec ^-1 met een 14 uur fotoperiode.
4. Gebruik een ander protocol voor sommige onkruidsoorten geïnfecteerd padie, bijvoorbeeld, A. plantago-aquatica, S. mucronatus en C. difformis zoals beschreven in ^22.
   1. Transplantatie de zaailingen in polystyreen trays met 24 round-cellen (55 mm, 64 mm diep) filled met 60% siltig leemgrond, 30% zand en 10% turf (volumeprocent).
   2. Zet de trays in 12 cm diep plastic containers gevuld met water en battened door geschroefd roestvrij stalen staven om te voorkomen dat ze te drijven (figuur 1).
   3. Behoud waterniveau in de containers op 1-2 cm onder het niveau van het bodemoppervlak en voeg 1,5 g kopersulfaat om elke container de algengroei te voorkomen (die 10-12 liter water bevat).

5. Herbicide Behandelingen

1. Behandelingen met pre-herbiciden:
   1. Na ongeveer drie dagen in de kiemkast zoals beschreven in paragraaf 3, verplanten de kiemende zaden in plastic bakjes met de hierboven beschreven substraat en bedekken met een laag van de bodem (ongeveer 1 cm). Dit is een kritieke stap in zodat zaailingen niet zal ontstaan ​​vanwege het herbicide effect dan een buitensporig ingraafdiepte.
   2. Neem het substraat veld Capaplaats door het plaatsen van de bakken, die enkele gaten aan de onderzijde, op schotels gevuld met water.
   3. Eén dag na het uitplanten, behandel het laden met de pre-totstandkomingsherbicide ^25.
   4. Houd het substraat bij of nabij veldcapaciteit door toevoeging van water indien nodig zowel boven als onder door capillariteit van de schotel. Deze werkwijze bevordert de duurzaamheid van het herbicide op de juiste diepte (waarbij de kiemende zaden) van een behandelingseffectiviteit.
2. Behandelingen met post-opkomst herbiciden:
   1. Spray planten toen ze de 2-3 bladstadium te bereiken (dat wil zeggen, groeistadium 12-13 van de Extended BBCH groei schaal ^26).
   2. Vanaf de dag na de behandeling, stel het irrigatiesysteem volgens de waterbehoefte van de onkruidsoorten en het seizoen (bijvoorbeeld voor Echinochloa spp. Het levert water voor 3 min 4 keer per dag, met regelmatige tussenpozen van 9 uur tot 9 pm). Water is disbijgedragen door middel van een automatische beregening systeem.
      Variant: glyfosaat wordt toegepast in de fabriek fase BBCH 14-21.
3. Herbicide bereiding en distributie.
   Opmerking: Alle herbiciden (voor en na opkomst) toegepast als commerciële bereidingen met aanbevolen oppervlakte op twee doses aanbevolen dosis veld (1x) en drievoudige (3x).
   1. Indien nodig, de voorbereiding van de oppervlakte-actieve oplossing in bulk volgens de instructies op het etiket; de eindconcentratie wordt gewoonlijk uitgedrukt als een percentage van het uiteindelijke volume (bijvoorbeeld 0,3%) of volume te verdelen per oppervlakte-eenheid (bijvoorbeeld 1 L ha ^-1).
   2. Gebruik surfactansoplossing als oplosmiddel voor het herbicide (opgeloste) oplossing om de juiste concentratie van het werkzame bestanddeel houden. Bereid de meest geconcentreerde herbicide oplossing eerst (3x). Bereken de hoeveelheid handelsproduct te worden opgelost in de oplossing van oppervlakteactieve stof (of gedeïoniseerd water als eensurfactant is niet nodig) met behulp van de volgende vergelijking:
      Dosis _kruid = [(Dosis _veld x Dosis _max) x V _fin] / V _del
      Waar: Dosis _herb = herbicide dosis (ml), dosis _field = herbicide veld dosis (ml ha ^-1), _max = maximum dosis toegediende, _fin V = eindvolume van de oplossing (L), V = volume _del van het geleverde bench spuit (L ha ^-1).
   3. Verdun (2: 1, v / v) van de herbicide oplossing 3x de minder geconcentreerde ene (1x) bereiden. Deze procedure reduceert de kans op fouten bij het afwegen of pipetteren herbiciden. Herbicide Concentratie wordt uitgedrukt als volume te verdelen per oppervlakte-eenheid (L ha ^-1).
   4. Start de sequentie van behandeling met het herbicide lagere dosis (1x). Op deze wijze behoeft de sproei kast wassen tussen twee behandelingen met dezelfde herbicide.
   5. Verdeel de herbicide solution met een precisie bench spuit levert 300 L ha ^-1 (± 1%), bij een druk van 215 kPa en een snelheid van 0,75 m sec ^-1, een arm voorzien van drie platte ventilator (extended range) hydraulische nozzles .
   6. Was het spuiten kabinet twee keer wanneer het herbicide wordt gewijzigd met bleekwater 1% (v / v) en spoel.
      Variant: glyfosaat wordt met een sproeivolume van 200 l ha ^{-1 27.}
      OPMERKING: Bijzondere aandacht moet worden besteed bij zeer biologische bestrijdingsmiddelen, zoals de sulfonylureas sulfometuron of flazasulfuron, worden gebruikt. In het laatste geval doet een wassing met een bleekmiddeloplossing en andere met ammonia (2,5% v / v), gevolgd door zorgvuldig spoelen met water.

6. Verzameling en analyse van de gegevens

1. Door middel van een barcode-lezer, die automatisch herkent elke lade, nemen het aantal planten dat de behandeling als de Visual Geschatte Biomassa (VEB) heeft overleefd. Planten zijn kontgineel zo dood als ze tonen geen actieve groei ongeacht kleur of ander uiterlijk.
   1. Maak de beoordeling drie of vier weken na behandeling (WAT) afhankelijk van de geteste herbiciden (bijvoorbeeld drie WAT voor ACCase remmers en vier WAT voor ALS-remmers of glyfosaat).
   2. Evalueer de algemene werkzaamheid van de behandeling door het opnemen van een vatbare populatie (check S) in alle experimenten, dat wil zeggen, een populatie in een site die nooit of zelden behandeld met herbiciden was verzameld.
   3. Express planten overleven als percentage van het aantal behandelde planten, telde net voor het herbicide behandeling, en het berekenen van de standaardfout (SE) per gemiddelde waarde (gemiddelde waarde van de twee herhalingen).
   4. De VEB wordt verkregen door een visuele vergelijking van plantenbiomassa tussen behandelde en niet-behandelde controle van dezelfde populatie ^{25, 28.} Een score, van 10 naar planten niet beïnvloed door het herbicide (vergeleken met de onbehandelde controle) tot 0 wanneerde planten duidelijk dood, wordt aan elke behandelde bak.
2. Geeft populaties vier categorieën op basis van de resultaten van behandeling met twee doses herbicide resultaten: S wanneer minder dan 5% van planten overleefden de herbicide dosis 1x, SR bij overlevenden varieerden van 5% tot 20% bij herbicide dosis 1x, R wanneer meer dan 20% van de planten overleefden de herbicide dosering 1x en RR als overlevenden meer dan 20% bij herbicide dosis 1x en meer dan 10% bij herbicide dosering 3x ^17.

Resultaten

Om de weerstand status van een vermeende resistente bevolking te beoordelen, is het van fundamenteel belang voor een vatbare controle in de test omvatten om de herbicide effectiviteit te controleren. De resultaten van een screeningtest uitgevoerd op blz rhoeas populaties, onkruid geïnfecteerd tarwe velden, worden in figuur 2, waarbij de effectiviteit van vier-herbiciden op een gevoelige controle (09-36) en de vermoedelijke resistente één (10-91) worden gepresenteerd. Populatie 09-36 werd volled...

Discussie

Verschillende stappen in de protocollen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle evaluatie van herbicideresistentie in een populatie: 1) zaden moeten worden verzameld bij volwassen uit planten die het herbicide behandeling (s) had overleefd. Rijping van de zaden op de moederplant is cruciaal voor problemen bij zaadkieming later voorkomen; 2) de juiste opslag van de zaden wordt aanbevolen om de proliferatie van schimmels die kieming zou voorkomen dat te voorkomen; 3) zaailingen worden behandeld met de juiste groeist...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Paperen zakken	Celcar SAS
Kunststof servies	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparant plastic
Zwavelzuur 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Vliesstof	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Gewicht 17 g m-2
Chloroform >99,5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Kaliumnitraat >99,0%	Sigma-Aldrich	P8394
Kunststof containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Kunststof trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyreen trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 ronde cellen (6x4)
Kopersulfaat	Sigma-Aldrich	451657
Agriperliet	Blu Agroingross sas	AGRI100
Turf	Blu Agroingross sas	TORBA250
Kiemkast	KW	W87R
Spuitmonden	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	Het tweede type spuitmonden worden alleen gebruikt voor glyfosaat
Streepjescodegenerator	Toshiba TEC	SX4
Labels met streepjescode	Felga	TT20200	Inlijmlabels met afgeronde hoeken
Streepjescodelezer	Cipherlab	8300-L	Draagbare dataterminal
Bankspuit			In eigen beheer gebouwd
Herbiciden inbegrepen in de resultaten:
Commercieel product	Actief ingrediënt	Bedrijf	Opmerkingen
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Tent te gebruiken met Hussar WG
Dash		BASF	Tent te gebruiken met Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyfosaat	Monsanto
Trend		Dupont	Tent te gebruiken met Granstar en Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro