Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Samenvatting

Om hersenreorganisatie onder pathologische omstandigheden te bestuderen, gebruikten we miniosmotische pompen voor directe eiwitbezorging in de hersenen, waarbij we de bloed-hersenbarrière omzeilden. Trajecttracers worden vervolgens geïnjecteerd om veranderingen in hersenconnectiviteit onder invloed van het eiwit te bestuderen.

Samenvatting

Farmacologische behandeling in diermodellen van cerebrale ziekten brengt het probleem met zich mee van herhaalde injectieprotocollen die stress bij dieren kunnen veroorzaken en resulteren in tijdelijk weefselniveaus van het medicijn. Bovendien is medicijntoediening aan de hersenen delicaat vanwege de bloed-hersenbarrière (BBB), waardoor de intracerebrale concentraties van selectieve geneesmiddelen na systemische toediening aanzienlijk worden verminderd. Daarom is een systeem dat zowel constante medicijntoediening zonder piekniveaus als het omzeilen van de BBB mogelijk maakt, noodzakelijk om voldoende hoge intracerebrale concentraties van geneesmiddelen te bereiken die ondoorlaatbaar zijn voor de BBB. In deze context vertegenwoordigen miniosmotische pompen een ideaal systeem voor constante medicijntoediening tegen een vaste bekende snelheid dat het probleem van dagelijkse injectiestress bij dieren ontwijkt en dat ook kan worden gebruikt voor directe hersenlevering van geneesmiddelen. Hier beschrijven we een methode voor implantatie van miniosmotische pompen en post-operatieve zorg die aan dieren moet worden gegeven om deze techniek met succes toe te passen. We bedden het genoemde experimentele paradigma in standaardprocedures die worden gebruikt voor het bestuderen van neuroplasticiteit in de hersenen van C57BL6-muizen. Zo werden dieren blootgesteld aan 30 minuten herseninfarct en geïmplanteerd met miniosmotische pompen die via een canule met de schedel waren verbonden om een pro-plasticiteitsdrug te leveren. Gedragstesten werden gedurende 30 dagen van de behandeling uitgevoerd. Na verwijdering kregen de dieren injecties van anterograde tracttracers om neuronale plasticiteit in de chronische fase van herstel te analyseren. De resultaten gaven aan dat neuroprotectie door het toegediende medicijn gepaard ging met een toename van motorische vezels die de middellijn van de hersenen bij doelstructuren overstaken. De resultaten bevestigen de waarde van deze technieken voor geneesmiddeltoediening en hersenplasticiteitsstudies in de moderne neurowetenschappen.

Inleiding

De aflevering van eiwitten en farmacologische verbindingen in de hersenen zijn belangrijke strategieën voor het bestuderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan hersenziekten en het evalueren van kandidaat-moleculen voor nieuwe behandelingen ^1,2. In de experimentele neurowetenschappen is de aflevering van vectoren zoals plasmiden of adenovirussen een belangrijk hulpmiddel geworden voor het bestuderen van langetermijneffecten van eiwitten in de hersenen ^3,4. Enkelvoudige injecties van vectoren hebben het voordeel van een systeem dat op zichzelf al zeer stabiele niveaus van het therapeutische middel in de hersenen handhaaft ⁴. Echter, voor langetermijnexperimenten met gezuiverde geneesmiddelen induceert systemische toediening via intraperitoneale injectie stress bij muizen of ratten, en is het niet de beste keuze wanneer een gerichte hersenreactie nodig is, die ook grote doses van het medicijn vereist⁵. Mini-osmotische pompen vormen een ideaal systeem voor langdurige directe medicijntoediening in de hersenen door zowel lage toegankelijkheid tot de hersenen als pieken van medicijnconcentratie te omzeilen, aangezien de aflevering van het medicijn direct gebeurt in een gerichte plaats in de hersenen en tegen een vaste stromingssnelheid bepaald door het gekozen pompmodel^2,6,7. Inderdaad, dit systeem heeft ons in staat gesteld om hersenherstel na een beroerte met succes te bestuderen door de toediening van verschillende geneesmiddelen zoals recombinant humaan erytropoëtine (rhEpo) en vasculair endotheelgroeifactor ^6,7.

Hersenplasticiteit is essentieel voor het herschikken van verbindingen als reactie op hersenletsels. Plasticiteit is een breed concept dat varieert van de vorming of eliminatie van synaptische contacten, groei van dendritische stekels en ook verlenging of terugtrekking van langeafstandsverbindingen^8,9. Er werd eerder gedacht dat de hersenen niet in staat zouden zijn om verbindingen na een laesie te herstellen. Maar veel benaderingen hebben aangetoond dat deze, indien goed gestimuleerd, de connectiviteit opnieuw kunnen tot stand brengen ^6,7,10. Een techniek die bijzonder nuttig is om dit te bestuderen, is het gebruik van tractustracers. Anterograde tractustracers zijn verbindingen die neuronen kunnen binnendringen bij de soma en zich vervolgens langs de axonen verspreiden totdat deze hun doelstructuren bereiken. Twee voorbeelden zijn cascade blauw (CB) en biotinyleren dextran amine (BDA). Daarentegen komen retrograde tractustracers, zoals cholera toxine B (CTB) of fluorogoud (FG), het neuron binnen via het axon-uiteinde en verspreiden zich vervolgens terug naar de soma en onthullen zo de oorsprong van neuronen die de injectieplaats targeten.

Hier presenteren we de methoden die we gebruiken voor het implanteren van mini-osmotische pompen voor directe aflevering van eiwitten of geneesmiddelen die potentiële effecten hebben op neurale plasticiteit, evenals de injectie van BDA en FG om input- en outputverbindingen naar de motorische cortex te onthullen. BDA zal ook worden gebruikt als een voorbeeld van een tractustracer die wordt gebruikt om verhoogde plasticiteit van axonen te demonstreren die na een beroerte uit het co ontstaan onder behandeling met rhEpo.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de regering (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 en G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) gebaseerd op NIH Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren.

1. Voorbereiding van de mini-osmotische pompen

1. In een steriele omgeving (bijv., Celkweek kap), verkrijgen de pomp katheter stromingsmoderator, hersenen infusiecanule en de afstandhouder schijven te gebruiken (Figuur 1).
2. Voor levering van medicijnen direct in de ventrikels gebruik een vulring zodat alleen de punt van de punctienaald in contact is met het ventrikel. Houd de canule ondersteboven met een pincet. Voeg twee druppels cyanoacrylaat lijm (CA) en de invoering van één afstandhouder disc.
3. Laat de canule op een plat oppervlak naar boven, zodat de lijm tussen de vulring en de canule droogt.
4. Snijd de katheter in secties van ongeveer 2,5 cm.
5. Voor each pomp stelt een minimum van 300-350 pl van de oplossing van belang deze is nodig om de pomp waardoor alle lucht extruderen volledig vullen erin om de vorming van belletjes in de katheter te voorkomen. Bubbles zal de stroom van het belemmeren oplossing in de hersenen.
6. Sluit de katheter zorgvuldig om de stroom moderator.
7. Met behulp van een 2 ml spuit verbonden met de naald door de herseninfusiekit, vul de pomp tot een kleine hoeveelheid oplossing ontsnapt de pomp, waardoor luchtbellen voorkomen erin.
8. Vul zorgvuldig de stroom moderator en katheter met aandacht voor eventuele luchtbellen die nog in de katheter te voorkomen.
9. Introduceren de stroom moderator in de pomp.
10. Eenmaal gevuld, nauwkeurig de canule verbinden met het uiteinde van de katheter. Indien blijkt dat een bel wordt gevormd verwijdert de canule voorzichtig vullen de katheter met drager of geneesmiddeloplossing en herintroduceren van de canule.
11. Plaats de pump in een container met steriele zoutoplossing en verlaat deze bij 37 ° CO / N.
12. Vóór implantatie controleer voor de vorming zeepbel. Indien nodig (bijv., Belletjes worden waargenomen) verwijderen van de canule en vul de buis. Sluit de canule. Dit zou slechts een paar microliter van de oplossing te nemen.

2. Implantatie van mini-osmotische pompen

Opmerking: Voor deze experimenten dieren werden verdoofd met 1% isofluraan (30% O _2, 70% N _{2 O).} Als dit echter niet beschikbaar is, het gebruik van intraperitoneale injecties van verdoving mogelijk ^11.

1. Zoek het dier in de stereotactische inrichting onder verdoving en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap.
2. Snijd de vacht over de hijad ofwel met een schaar of een scheren machine. Snij zoveel mogelijk zonder beschadiging van de huid.
3. Reinigen van de huid met 70% ethanol en desinfecterende met antibacteriële en fungicide eigenschappen.
4. Met een scalpel open een 1 cm incisie iets naar rechts van de middellijn en de schedel bloot te leggen.
5. Reinig de schedel met een wattenstaafje. Laten weken met 70% ethanol en doorgeven over de schedel. Dit induceert de schedel te drogen.
6. Als de schedel is licht bloeden, gebruik dan een cauterizer elke bloeden punten te elimineren. Bloed voorkomt CA droogt correct op het bot wanneer de canule wordt geïmplanteerd.
7. Gebruik de stereotactische apparaat om een ​​merk te maken op het punt van de schedel waar de canule wordt geïmplanteerd. Voor ventriculaire infusies de linker hersenhelft coördinaten -0,2 mm caudaal, 0,9 mm lateraal van bregma (Figuur 2A).
8. Boor voorzichtig over de schedel het maken van een hoek van 45 °; Dit voorkomt dat de boor per ongeluk gaan op de brain. Herhaaldelijk boren voor een paar seconden en controleer dan hoe diep het gat is. Stoppen met boren zodra de schedel is dunner, maar nog steeds niet volledig doorgedrongen.
9. Breek de hersenvliezen met de punt van een steriele naald totdat volledige toegang tot de hersenen bereikt. Ga voorzichtig om zo de hersenen niet beschadigen.
10. Reinig de schedel met 70% ethanol met behulp van een wattenstaafje.
11. Invoering van een rechte tang onder de huid van het dier in een antero-caudaal. Gebruik de tang om de ruimte te openen onder de huid op de rug van het dier waar de pomp worden geïmplanteerd. Introduceren van de pomp in de rug van het dier verlaten van de katheter en de canule buiten (figuur 2B). De pomp wordt in deze stand gehouden totdat deze wordt verwijderd en geen enkele vorm van fixatie nodig.
12. Plaats voorzichtig vier kleine druppels lijm naast de naald in de canule.
13. Introduceren zorgvuldig de naald door de schedel zonder zijwaarts bewegen. Houd het in positie voor 15-30 sec until de canule volledig bevestigd (figuur 2C.1). Eenmaal op zijn plaats, zal de canule bereiken 2,5 mm in de dorso ventrale richting als men spacer disc is gebruikt. Indien goed aangesloten, zal de canule tot het einde van het experiment blijft vastzitten aan het bot.
14. Plaats één vinger over het tabblad te verwijderen en vervolgens met de andere hand om het afgesneden door zijn nek met een set van de schaar (figuur 2C.2).
15. Sluit de wond op de huid met een 5-0 hechtdraad en enkele druppels povidon-joodoplossing (PVP-I) boven op de wond ter voorkoming van infectie (Figuur 2D).
16. Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Plaats geen geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Houd dieren die zijn geïmplanteerd pompen alleen in hun kooien in de tijd van geneesmiddeltoediening.
17. Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen.

3. Pomp removal

Opmerking: Gewoonlijk experiment eindigt aan het einde van de levertijd toegestaan ​​door de pomp, maar het is mogelijk om de pomp om secundaire experimenten verwijderen als vervolg op de geneesmiddelafgifte. Om tract tracer injecties doen is het dus noodzakelijk om de pomp te verwijderen.

1. Plaats het dier in de seterotactic apparaat onder verdoving en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap.
2. Open de huid voorzichtig door het snijden door de incisie uitgevoerd op de dag van de pomp implantatie.
3. Met een chirurgische klem houd de canule en trek hem uit. Het moet gemakkelijk uit de schedel. Zo zacht bloeden wordt verwacht, stoppen door het plaatsen van een wattenstaafje en wacht 1-2 min.
4. Trek de pomp door de katheter. Hijlp het uit door te duwen, waardoor de druk op de huid.
5. Weer sluit de wond met een 5-0 hechtdraad en voeg een paar druppels van de PVP-I.
6. Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Niet gezet geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Dieren die chirurgie hebben ondergaan kunnen worden samengesteld.
7. Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen.
8. Laat het dier om te herstellen gedurende 10 dagen alvorens tot darmkanaal tracer injectie.

4. Druk Tract Tracer Injectie bij 45 ° hoeken op de juiste Motor Cortex

1. Leg het dier op het stereotactische apparaat onder narcose en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap.
2. Open de hoofdwond.
3. Cleunen de schedel met 70% ethanol met behulp van een wattenstaafje.
4. Invoering van een 5 ul glazen spuit (26S bis) op de verticale houder van de inrichting. Zorg ervoor dat het onderste uiteinde van de glazen houder juist op het vasthoudelement. De spuit mag niet te ver eronder dan is het onmogelijk om deze te plaatsen bij 45 ° vanuit de vertikale stand en de injectie toe.
5. Richt de spuit direct over bregma en zoek de gewenste coördinaten. Voor een injectie op de motorische cortex coördinaten: Punt # 1: 0,5 mm rostraal en 2,5 mm lateraal met betrekking tot bregma. Punt # 2: 1,34 mm rostraal, 2,5 mm lateraal met betrekking tot bregma.
6. Zodra de coördinaten zijn gevestigd, geven hun positie over de schedel met een marker met een dunne punt. Maak slechts één punt in de schedel als buitensporig inkt release mogelijk te verbergen de juiste coördineren.
7. Boor de schedel die de boor bij 45 ° voorzichtig. Zoals in stap 2.8, controleer dan de schedel regelmatig, zodat het niet volledig perforated om schade aan de hersenen veroorzaakt door de boor voorkomen. Gebruik de punt van een spuit te zorgen dat alle bot is verwijderd.
8. Laden 600 nl van darmkanaal tracer verdunning in de spuit.
9. Stel de verticale stand 45 ° naar de rechterzijde van het dier. Onder de microscoop, plaats de punt van de naald van de spuit is recht tegenover het gat.
10. Bewegen in de verticale richting van 1,5 mm. Laat de naald stabiel in deze positie gedurende 30 seconden tot 1 minuut voordat u druk injecties.
11. Injecteer 300 nl van tracer verdunning in drie stappen van 100 nl van elkaar gescheiden door 30 sec. Na de laatste injectie, laat de spuit stabiel bij 30 sec tot 1 min teneinde de tracer stroomt en uit de hersenen voorkomen.
12. Trek langzaam uit de spuit, verplaats het over het tweede gat en herhaal hetzelfde proces met de resterende 300 nl dat zich binnen de spuit.
13. Na de tweede injectie, verwijder de spuit en ga naar de wou sluitennd met een 5-0 hechtdraad en voeg een paar druppels van de PVP-I.
14. Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Niet gezet geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Dieren die chirurgie hebben ondergaan kunnen worden samengesteld. Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen.
15. Laat het dier te laten bekomen van 10 dagen voor het offer.

5. Tract Tracer Observation

1. Verdoven van het dier volledig per institutionele richtlijnen. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap.
2. Perfuseren de dieren met 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7) onder standaardprotocollen ^6.
3. Verwijder de hersenen en post fix door O / N onderdompeling in 4% paraformaldehyde.
4. Cryoprotect hersenen in sucrose op 30% tot de hersenen zinken. Verwijder vervolgens de hersenen en vries ze met 10 sec Immersion in vloeibare stikstof. Houd hersenen bij -80 ° C totdat profielen worden vervaardigd.
5. Produceren secties bij 20 micrometer voor retrograde tract tracer analyse en bij 40 micrometer voor anterograde tract tracer analyse door het snijden op een cryostate.

Opmerking: FG gelabelde neuronen kunnen worden waargenomen als witte bloedcellen onder ultraviolet licht excitatie. BDA wordt gedetecteerd door O / N incubatie met avidine-biotine-peroxidase complex en 3,3 'diaminobenzidine onder toevoeging van nikkel in 0,4% om het contrast van de vezels ^6,7 verbeteren.

Resultaten

We ingediend dieren 30 min van de middelste cerebrale arterie occlusie van de intraluminale hechting werkwijze het induceren van een laesie in het linker striatum en lever rhEPO direct in de hersenen met behulp van mini-osmotische pompen (Figuur 1, Figuur 3) gedurende 30 dagen vanaf 3 dagen na beroerte ^6. Figuur 4 toont een schema van de cortico spinale kanaal dat werd gevonden na CB en BDA injectie en het gebied waar tracers geïnjecteerd. We lieten een verbetering van de grijpkracht en motorische prestaties (figuur 5) na 14 en 42 dagen van rhEPO levering respectievelijk. Levering van BDA in de rechter motorische cortex van dieren met een beroerte ontvangen links striatum, toonde een toename van de motorische vezels die de middellijn ter hoogte van de rode en gezicht nucleus (figuur 5), demonstreren succesvolle kleuring van kiemen vezels gevolg van farmacologische behandeling met miniosmotic pompen. rhEPO behandeling toegenomen neuronale overleving, vertraagde diffuse astrocytose, verminderde gliale littekenvorming en verhoogde angiogenese in de bestudeerde periode ^6. Door deze zelfde techniek tract tracer injectie kunnen we met succes thalamuskernen die zijn verbonden met de cortex door injectie van de retrograde tracer tract FG (Figuur 6) te detecteren.

Figuur 1. Onderdelen van de mini-osmotische pomp gebruikt in dit protocol. De afstandhouder disc, canule en afneembare tabblad, katheter, stromen moderator en mini-osmotische pomp kan worden waargenomen. Het aspect van de volledig gemonteerde pomp kan worden gezien in figuur 2A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ithin-page = "1">
Figuur 2. Samenvatting van de pomp implantatie belangrijke punten. (A) De muis wordt getoond als geplaatst op het stereotactische apparaat met de volledig geconstrueerde mini-osmotische pomp ernaast. Pijl geeft de voor implantatie coördinaten. (B) De pomp is geïntroduceerd op de rug van het dier en alleen de canule blijft aan de buitenkant. De schedel is al geboord. (C) Aspect van het hoofd na implantatie. (C.1) De canule is op positie, maar het tabblad verwijderbare niet is gesneden. (C.2) Het tabblad verwijderbaar is gesneden en het stikken van de wond kan nu beginnen. (D) Het sterretje toont een recent geïmplanteerd dier in vergelijking met een dier 30 dagen na implantatie (#). Wanneer correct gehuisvest, moet de wond gesloten tot het einde van de procedure blijven zoals getoond op de afbeelding.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Nissl-kleuring vermelding van de plaats van implantatie op de cortex. Een kleine incisie kan worden waargenomen op een deel van de linker cortex (pijl). De breedte van de binnengedrongen zone is ongeveer 50 urn. De geen evidente ernstig weefselveranderingen basis van Nissl-kleuring in vergelijking met het overeenkomstige gebied contralaterale (*). R: rechter hersenhelft. L: Links halfrond. Schaal bar = 300 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Tracttracer injectie strategie als voorheen gepubliceerd door Reitmeier et al. ^6,7. (A) Schematische aangeeft injectieplaatsen voor de luchtwegen tracer BDA in de contralaterale motorische cortex, terwijl CB werd geïnjecteerd in de motorische cortex van het infarct halfrond. Vezels werden gevolgd om de rode kern (niet getoond) en gezicht nucleus (zie figuur 5). (B) De injectie van de anterograde tract tracer BDA naast de motorische cortex weergegeven. Let op de rode pijl die de naald spoor, terwijl de zwarte pijl geeft een paar corticale cellen gelabeld met de BDA. Cx: Cortex. CC: corpus callosum. V: ventrikel. FN: Facial kern. Schaal bar in B = 200 micrometer. Is figuur 4A weergegeven met de vriendelijke toestemming ^6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Terugwinning van een infarct hersenen na aflevering van rhEPO. (A) BDA geïnjecteerd in de contralesional motor cortex wordt dan gedetecteerd in corticobulbar vezels ter hoogte van het gezicht nucleus (Bregma -5,8 mm tot -6,3 mm). Kruising lijnen op elk halfrond werden parallel aan de middellijn en vezels kruisen elke lijn in de richting van de ipsilesional en contralesional halfrond getrokken werden geteld en uitgedrukt als percentage van de totale gelabelde vezels in de corticospinale darmkanaal. Erytropoëtine toegenomen vezel kruisingen in de richting van de contralesional gezicht kern De gegevens zijn middelen + - SD. Gegevens werden geanalyseerd door one-way ANOVA gevolgd door de minst significante verschillen tests §P <0,05 vergeleken met met drager behandelde niet-ischemische muizen. (B) Motor gedrag vertoonden een verbetering van handknijpkracht en coördinatie op het rooster staaftest. De gegevens zijn gemiddelde waardevollees + - SD. Gegevens werden geanalyseerd door tweeweg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door eenzijdige ANOVA / minst significante verschillen tests voor elk tijdpunt. §P <0,05 vergeleken met pre-ischemische basislijn; * P <0,05 in vergelijking met vehikel behandelde ischemische muizen. De figuren 5A en B zijn gereproduceerd met toestemming ^6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Target structuren bereikt na injectie van Fluorogold (FG). (A) injectieplaats van FG naast de motorische cortex zoals aangegeven in figuur 1. Let op de rode pijl die de naald spoor en de witte pijl die een paar gelabelde cellen in de cortex. (B) FG geïnjecteerd in de buurt van de motorcortex wordt gedetecteerd in de VPL. Fi: fimbria. IC: Interne capsule. RT: nucleus reticularis thalami. VPL: Thalamic ventrale posterolaterale kern. Schaal bar = 200 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Gedurende vele jaren heeft het onderzoek naar neurodegeneratieve aandoeningen, zoals ischemische beroerte of traumatisch hersenletsel gericht op de ontwikkeling van neuroprotectieve therapieën die gericht zijn op neuronale overleving in de acute beroerte fase te promoten. De overgrote meerderheid van geneesmiddelen therapieën die zijn gevonden effectief in diermodellen niet wanneer vertaald naar de kliniek. Redenen hiervoor therapeutisch falen omvatten maar zijn niet beperkt tot het ontbreken van aanhoudende geneesmiddeleffecten resulteert in aanhoudende functionele neurologische herstel. Het is dus belangrijk om strategieën te bevorderen hersenen remodeling op de langere termijn te ontwikkelen. Door het bevorderen van neuronale overleving alleen is niet voldoende om succesvol beroerte herstel mogelijk maken, zoals voorgesteld door het grote aantal mislukte neuroprotectie proeven, het stimuleren van neuronale plasticiteit onlangs verkregen groot belang op.

Middelen voor drug delivery zijn intraperitoneale injectie, staart intravasculaire injection, dijbeen injectie, enkele stereotactische injectie van vectoren in de hersenen en bleef constante levering door mini-osmotische pompen. Laatstgenoemde kan omvatten systemische afgifte, wanneer de pomp niet een canule, of die worden orgel gerichte kunnen, zoals we hebben aangetoond voor plaatsing in de hersenen. Met uitzondering van mini-osmotische pompen en het gebruik van virale vectoren, zullen alle andere strategieën fluctuerende geneesmiddelconcentraties induceren. Voor lange termijn experimenten derhalve noodzakelijk om het dier bij de stress van ontvangst frequente injecties. De BBB legt een belangrijke belemmering voor de hersenen opname van eiwitten of geneesmiddelen uit het bloed, waardoor de noodzaak van grote eiwit of geneesmiddel doseringen om therapeutische concentraties in de hersenen te bereiken. Bijvoorbeeld Pellegrini et al. (2013) ⁵ afgegeven rhEPO door intraperitoneale injectie met een dosis equivalent aan 75 IU / dag voor een dier van 30 g (750 IU / dag voor een 300 g rat). Ter vergelijking, de doelgerichte aflevering van rhEpo naar de hersenen liet ons toe om een ​​veel lagere dosis van 10 IU / dag te gebruiken in onze studie voor een succesvolle beroerte herstel, dat ons in staat om het herstel over een groot tijdsbestek te realiseren tegen een vaste rente van 0,25 pl / uur.

In dit werk hebben we aangetoond de wijze van implanteren van minipompjes met een canule verbonden met de schedel om de plasticiteit bevorderend proteïne rhEPO rechtstreeks te leveren in de ventrikel, waardoor het omzeilen van de BBB. Door deze werkwijze rhEPO bevorderd neurologisch herstel in een aantal manieren, waaronder vermindering van infarctgrootte reductie van gliale littekenvorming en inductie van angiogenese. rhEPO bevorderde ook neuronale overleving en hogere projecties van de contralesional motorische cortex naar de gedenerveerde rode kern en gezicht kernen. De kiemen van de vezels werd onthuld door injectie van de anterograde tract tracer BDA in de motorische cortex (figuren 4A en 5A). Een functioneel correleren met de kiemen van de vezels provided door de verbetering van de motorische vaardigheden (Figuur 5B). Daarnaast hebben we aangetoond dat dezelfde benadering tract tracer injectie kan worden toegepast thalamo-corticale verbindingen door injectie van de retrograde tracer tract FG (Figuur 6B) onthullen.

Bij de bereiding van de mini-osmotische pomp, is het essentieel om de eind- en gebruik van spacers te overwegen. We gebruiken een afstandhouder om de lengte van de naald te reduceren 0,5 mm zoals deze wijze de punt van de naald in contact is met het ventrikel op de aangegeven coördinaten (-0,2 mm caudaal, 0,9 mm lateraal, 2,5 mm dorso ventrale met ten opzichte van bregma). Maar als diepere structuren het doel van het onderzoek, is geen spacers nodig. Evenzo, als een externe afleverpunt gewenst is (bijv., De cortex) en vervolgens meer spacer disks nodig. De katheter moet lang genoeg zijn zodat de pomp niet te dicht bij het hoofd, zoals bewegingen van de MOU zal belemmerense, maar ook niet te lang eenmaal geïmplanteerd lange duur kan de katheter te buigen, waardoor het risico van canule verwijdering verhogen door de natuurlijke beweging van de muis. Een sectie van 2 cm van de katheter geeft zeer goede resultaten in termen van mobiliteit en stabiliteit van het implantaat (Figuren 1 en 2). Incubatie van de pomp bij 37 ° CO / N kan de pomp direct beginnen pompen het geneesmiddel in de hersenen op het moment van implantatie.

In de mini-osmotische pomp implantatie is het essentieel om te verzekeren dat de schedel juist vóór implanteren van de canule wordt gedroogd. Meestal reiniging met 70% ethanol wordt het bot te drogen induceren, maar als continue bloeden wordt gevonden, gelijk aan de schedel voorzichtig met een cauterizer zal volledig drogen. Het is essentieel om te verzekeren dat de invoering van de naald verticale en langzaam mogelijk. Eenmaal in positie, en terwijl de lijm droogt, het plaatsen van de vinger op de top van de canule voorkomt dat zijwaartse ovre van de schedel. Speciale aandacht moet worden gegeven aan de wond en de plaatsing van de canule. Het is belangrijk dat de insnijding niet wordt uitgevoerd precies boven de middellijn van de schedel maar enigszins naar rechts. Bij het sluiten van de wond indien de incisie werd gemaakt in de middellijn, de huid zal worden overbelast, waardoor het risico van wondopening verhogen. Het maken van de insnijding aan één zijde iets zal de hechting punten om vanaf het hoogste punt van de canule. Bijgevolg zal er minder spanning op de hechtdraad punten en de wond goed te genezen. De dieren moeten alleen worden gekooid en gecontroleerd elke dag, vooral tijdens de eerste 10-15 dagen na de implantatie. Bij wonddehiscentie, wonden moeten zo snel mogelijk gesloten. Als de canule wordt verwijderd of het dier weer een infectie experiment moet worden beëindigd. Re-implantatie van de canule wordt afgeraden. Het is zeer belangrijk voor een succesvolle implantatie voldoende hoeveelheden weefsel ad gebruikenhesive (niet te veel!) als het degradeert het bot en verhoogt het risico van canule verwijderd. Echter het gebruik van te weinig kleefmiddel wordt evenmin de canule bevestigd aan het bot vast te houden. De mini-osmotische pompen kunnen uitvoeren medicijnen opgelost in een grote verscheidenheid van stoffen als enige beperking dat deze het oplosmiddel biocompatibel. Bovendien, aangezien het volume klein (200 ui) moet men bepalen of de concentratie die nodig is voor het experiment geschikt en precipitatie veroorzaken in de pomp.

Darmkanaal tracing met ofwel anterograde of retrograde tracers is een zeer goed gevestigde techniek om de hersenen connectiviteit en plasticiteit te bestuderen. Zorg moet worden gegeven aan het gebruik stereotactische frames bij het ​​injecteren om nauwkeurigheid op gericht het hersengebied men wil bestuderen (bijv injectie te voorkomen op het corpus callosum bij het ​​inspuiten van de cortex).

Voor alle chirurgische ingrepen en om de pijn te verminderen enontsteking, moeten de dieren behandeld met 0,1 mg / kg buprenorfine voor de interventie en Caprofen bij 4 mg / kg eenmaal per dag gedurende drie dagen na de ingreep.

Kortom, deze benadering levert een goede hulpmiddel om invloed van eiwitten of farmacologische samenstelling in de beschadigde brein, die een werkwijze die goed geschikt is voor onderzoek naar hersenplasticiteit.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alzet miniosmotische pomp. Model 2004.	Alzet	000298	Geneesmiddel container
Hersinfusie set 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Geneesmiddel hersenafleveringssysteem
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylaatkleefstof voor canule adhesie aan de schedel
75N glazen spuit	Hamilton	87900/00	Injectie van tract tracers
Biotine Dextran Amine (10.000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactisch apparaat voor coördinaagbepaling, pompimplantatie en tract tracer injectie.