Onderscheidend capillaire actie van Micro-kanalen in Bone-achtige sjablonen kunnen verbeteren Aanwerving van Cellen voor Herstel van de Grote Bony Defect

Samenvatting

Een stapsgewijs generiek proces voor het creëren van een botachtig sjabloon met geconstrueerde microkanalen wordt gepresenteerd. Hoge absorptie- en retentiecapaciteiten van het sjabloon worden aangetoond door capillaire actie via microkanalen.

Samenvatting

Zonder actieve, bloeiende celpopulatie die goed verdeeld en stabiel verankerd aan de ingebrachte template, maakt uitzonderlijke botherstel niet optreden. Bij conventionele sjablonen, de afwezigheid van interne micro-kanalen resulteert in het ontbreken van celinfiltratie, distributie en inhabitance diep in de templates. Vandaar dat een zeer poreuze en uniform verbonden trabeculair-botachtige sjabloon met micro-kanalen (biogene micro-template; BMT) is ontwikkeld om deze hindernissen te pakken. De roman BMT werd gemaakt door innovatieve concepten (capillaire werking) en gefabriceerd met een spons-template coating techniek. De BMT bestaat uit verschillende structurele componenten: onderling verbonden primaire poriën (300-400 pm) dat poriën in trabeculair bot, micro-kanalen (25-70 micrometer) binnen elke trabecula en nanoporiën (100-400 nm) na te bootsen op de oppervlak om cellen te verankeren. Bovendien heeft de BMT gedocumenteerd door mechanische testen studie sim te hebbenIlar mechanische sterkte-eigenschappen aan die van de menselijke trabeculair bot (~ 3,8 MPa) ^12.

De BMT tentoongesteld hoge absorptie, retentie en bewoning van cellen in de brug-vormig (Π) sjablonen (3 cm hoog en 4 cm lengte). De cellen die aanvankelijk werden gezaaid in een einde van de templates direct ingezet bij andere uiteinde (10 cm afstand) door capillaire werking van de BMT op het celmedium. Na 4 uur, de cellen homogeen bezetten de hele BMT en tentoongesteld normale cellulaire gedrag. De capillaire werking goed voor de infiltratie van de cellen gesuspendeerd in de media en de distributie (actieve migratie) gedurende de BMT. Na waargenomen deze mogelijkheden van de BMT, projecteren we BMTs beenmergcellen, groeifactoren en voedingsmiddelen absorberen van de omtrek onder fysiologische omstandigheden.

De BMT kan huidige beperkingen op te lossen via een snelle infiltratie, homogene verdeling en inhabitanvu cellen in grote, volumetrische sjablonen om enorme skelet gebreken te herstellen.

Inleiding

Het uiteindelijke doel van botweefselengineering met synthetische constructen is de incorporatie van de constructen in het gastheerbot, herbevolking van de constructen met gastheercellen en herstel van gas- en lichaamsvloeistofwisseling om de normale botfunctie te herstellen. Er is aanzienlijk onderzoek gemeld in de afgelopen tien jaar over het gebruik van polymere en keramische biomaterialen voor het produceren van scaffolds^1,2. Echter, het ideale materiaal en fabricagetechniek voor optimale botweefselregeneratie is nog niet geïdentificeerd. Bovendien is er een algemene gebrek aan succes in het naar de praktijk brengen van deze technologieën, vooral voor de reconstructie en restauratie van grote botdefecten. Daarom blijft het herstellen van kritisch gedimensioneerde botdefecten nog steeds een klinische uitdaging^1-5.

Idealiter zouden de scaffolds voor botweefselregeneratie biocompatibiliteit moeten vertonen zonder inflammatoire reacties of vreemde lichaam/toxische reacties te veroorzaken, nauw overeenkomende mechanische eigenschappen moeten hebben in vergelijking met die van natuurlijk bot en een mechanisme moeten hebben om diffusie en/of transport van ionen en voedingsstoffen mogelijk te maken. Sterke binding met het gastheerbot, dynamische botgroei, vasculaire ingroei en biodegradatie van de scaffolds zijn evenzeer wenselijk. Hoewel het gebruik van biodegradeerbare polymeer scaffolds vooruitgang heeft getoond in termen van weefselingroei, zijn er controverses over hun gebruik voor botregeneratie.

Niettegenstaande deze uitgebreide inspanningen, hebben de zeer georganiseerde structurele synthetische constructen nog steeds beperkt potentieel bij het overwinnen van de hindernis van passieve celpenetratie. De meeste van deze benaderingen hebben resulteerd in in vitro weefselingroei met doorsneden van minder dan een paar µm tot enkele mm vanaf het externe oppervlak, een onvolledige integratie met gastheerbot, en alleen gedeeltelijke botregeneratie in vivo^6,7. De pionierscellen migreren niet diep in de constructen vanwege het ontbreken van een initiële kracht die hen naar binnen trekt voordat celkolonisatie begint. Bijgevolg vindt celkolonisatie strikt plaats aan de rand van de scaffold, waardoor het een obstakel wordt vanaf de rand tot het midden van de scaffold. Daarom wordt de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen in de binnenste delen van de templates beperkt⁸. Het is dus duidelijk dat de architectuur van de scaffolds (poriëngrootte, porositeit, interconnectiviteit en permeabiliteit) die de transport en diffusie van stoffen doorheen de scaffolds beïnvloeden, cruciaal is voor het bereiken van goed verdeelde celproliferatie en differentiatie^9,10. Hoewel calciumfosfaten in het verleden zijn gebruikt voor scaffoldfabricage, hebben verschillende processen en procedures vaak geresulteerd in calciumfosfaat scaffolds met variërende architectuur. Daarom wordt de selectie van het fabricageproces belangrijk bij het dicteren van de scaffoldarchitectuur die nodig is voor succesvolle botweefselregeneratie.

Kortom, er zijn nog steeds twee belangrijke tekortkomingen van botweefselengineering die moeten worden aangepakt: de initiële celrekrutering in de template vóór celhechting en kolonisatie en de kwaliteit van de stofstroom zowel in als uit de template.

Protocol

1. Polyurethaan (PU) Sponge Voorbereiding als sjabloon

1. Gebruik PU sponsen aan hydroxyapatiet templates met onderling verbonden poriën te produceren. Gebruik elke spons om de primaire trabekels voor de vorming van de template stutten en de vorming van micro-kanalen binnen de trabeculae verschaffen.
2. Knippen en trim 80 ppi (poriën per inch) sponzen in 2 bruggen vormen met afmetingen van 3,5 cm in hoogte x 5 cm x 1,5 cm in de breedte.
   Opmerking: De afmetingen en vormen kunnen worden gekozen overeenkomstig de gewenste primaire poriegrootte: 100 ppi, 80 ppi en 60 ppi.
3. Wordt 100 ml van 4% (w / v) NaOH-oplossing met een bekerglas van 150 ml; Vervolgens dompelen en knijpen tot de voorbereide sponzen volledig doorweekt.
4. Na het weken, plaats de beker met de sponzen in de ultrasonicator (42 kHz).
5. Ultrasoon behandel de PU sponsen voor 15-20 min zonder warmte aan de oppervlakte eigenschappen te wijzigen.
6. Spoelen met gedistilleerdwater voor 5-10 minuten. Tijdens spoelen, knijp de sponzen en laat ze 5 tot 7 keer uit te breiden om de resterende NaOH te verwijderen in de sponzen.
7. Knijp de sponzen met keukenpapier om overtollig water te verwijderen; daarna drogen in een oven bij 60-80 ° C.

2. hydroxyapatiet (HA) Drijfmest Voorbereiding voor Coating

1. Alvorens de HA slurry, meet het gewicht van een beker met een magnetische roerstaaf. Deze meting wordt gebruikt om het poeder / vloeistof verhouding berekenen.
2. Maatregel 10 g van de nano-sized HA poeder.
3. Voeg 20 ml gedestilleerd water in de beker 50 ml. Warmte voor 120-140 ° C en roer met behulp van een hete plaat magneetroerder.
4. Voeg 0,3 g (3% w / w) van polyvinyl alcohol (PVA) (MW 89,000-98,000) per poeder in gedestilleerd water onder roeren bij 300-400 rpm.
5. Roer tot het PVA is opgelost. De oplossing moet helder na volledig oplossen van het PVA worden.
6. Draai off het vuur en voeg 0,1 g (1% w / w) natrium carboxymethyl cellulose (CMC) (ultra-lage viscositeit) voor poeder onder roeren bij 400-500 rpm. De oplossing moet helder na volledig oplossen van het PVA worden.
7. Roer totdat de CMC volledig is opgelost en afkoelen tot kamertemperatuur.
8. Voeg 0,3 g (3% w / w) van ammoniumpolyacrylaat dispergeermiddel per poeder onder roeren bij 300-400 rpm. Roer tot het volledig opgelost.
9. Voeg 0,2 g (2% w / w) glycerol per poeder onder roeren bij 300-400 rpm. Roer tot het volledig opgelost.
10. Langzaam verspreiden de HA-poeder in de oplossing onder roeren bij 600-900 rpm en blijf roeren gedurende 5 min.
11. Sonificeer 5 min met gebruikmaking van een ultrasonicator om dispersie van elke agglomeratie van de HA-poeder verzekeren.
12. Voeg een extra 5 ml gedestilleerd water in het mengsel onder roeren bij 600-900 rpm en verwarm bij 90-100 ° C.
13. Blijf roeren van het mengsel met een magnetische roerder bij 600-800 rpm bij 90-100 ° C in ordER naar het watergehalte verdampt.
14. Meet het gehele gewicht inclusief de beker en het mengsel af en toe tot een poeder / vloeistofverhouding van 1,75-1,8 wordt verkregen.
15. Formatteren van de poeder / vloeistof verhouding, verdeel het gewicht van het poeder door het totale gewicht van het mengsel (2,14), zoals poeder, reagentia en water, min het gewicht van de beker en de roerder (2,1), en verminderd met de HA-poeder (2,2).
    Opmerking: Bijvoorbeeld: Als A (gehele mengsel met inbegrip van poeder, reagentia en water) is 49,05 g, B (beker met roerwerk) is 33,5 g, en dan C (HA poeder) is 10 g.
    C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80
16. Laat de suspensie afkoelen tot kamertemperatuur alvorens te coaten.

3. HA coating, drogen, en Sinteren

1. Coat de bereide PU sponzen met HA coating suspensie met een roestvrijstalen spatel totdat de suspensie homogeen verdeeld over het PU spons op een glasplaat.
   Opmerking: Na het verwijderen van de overtollige smetry sommige poriën kunnen nog worden verstopt met slurry vanwege de hoge viscositeit slurry.
2. Met het oog op interconnectiviteit, uniformiteit, en open poriën te garanderen, iets blazen de HA gecoat templates met behulp van een compressor. Dit proces zorgt ervoor dat de sjablonen homogeen gecoat zowel aan de binnen- als buitenoppervlakken van de PU spons.
   Opmerking: als een homogene coating niet wordt bereikt, zal de HA gecoate templates instorten tijdens het sinterproces en kan ook barsten tijdens het hanteren vanwege de lage mechanische sterkte. Daarnaast is de homogene coating is essentieel bij het creëren microkanalen in de trabeculae.
3. Droog de HA gecoate templates minimaal 5 uur onder koelomstandigheden (20-25 ° C) onder zacht luchtcirculatie. Echter, verlengen de droogtijd basis van de grootte van de matrijs.
   Opmerking: Na het drogen wordt het HA gecoate templates kenmerkend krimpen ongeveer 8% tot 10% in elke richting.
4. Na het droogproces, plaatst de HAgecoate sjablonen op een aluminiumoxide kroes. Dan, plaats ze in een hoge temperatuur oven en gebruik de volgende 8 stappen sinteren profiel.
   1. Verhit 2 ° C / min tot 230 ° C.
   2. Verhit 1 ° C / min tot 280 ° C.
   3. Verhit 0,5 ° C / min tot 400 ° C.
   4. Verhit 3 ° C / min tot 600 ° C. Houd bij 600 ° C gedurende 1 uur.
   5. Verhit 5 ° C / min tot 1230 ° C. Blijf 1230 ° C gedurende 3 uur.
   6. Cool 5 ° C / min tot kamertemperatuur.
      Opmerking: Sinteren zal de HA gecoate spons templates verder krimpen met ongeveer 22% - 25% in elke dimensie.

4. Binnendringen en inhabitancyplaats van Cellen in Template

1. Cultuur pre-osteoblastische MC3T3 cellen in een niet-osteogene media bestaande uit α-MEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica (streptomycine en penicilline) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% _CO2 .
2. Voeg 10 mlvan een celsuspensie bij 10 x 2 ⁶ celdichtheid in een enkel putje in een 6-wells plaat.
3. Plaats de 3 cm x 4 cm x 1 cm brugvormige matrijs verticaal in de 6-wells plaat. Plaats een been van de sjabloon in de plaat met de celsuspensie, en het andere been in een aangrenzende lege put.
4. Laat de sjabloon om de celsuspensie gedurende 10 minuten absorberen.
5. Voeg 5 ml van de media daarna naar de put die oorspronkelijk was gevuld met de celsuspensie.
6. Vul het medium in beide putten om de 2 of 3 dagen tot 7 dagen zijn verstreken.
7. Bepaal de effectiviteit van mobiliteit cel door hematoxyline en eosine kleuring ^11.
   1. Fixeer de cellen en steiger door onderdompeling in 100% EtOH gedurende 20-30 min.
   2. Vlekken met hematoxyline gedurende 1-2 min.
   3. Spoelen met gedestilleerd water voor 1-2 minuten voor het dubbele.
   4. Dehydrateer door onderdompeling in 70%, daarna 95%, daarna 100% EtOH gedurende 1-2 minuten elk.
   5. Vlek met Eosin 20-30 sec.
   6. Spoelen met gedestilleerd water gedurende 12 min voor het dubbele.
   7. Dehydrateer door onderdompeling in 70%, 80%, 90% en 100% EtOH gedurende 1-2 minuten elk.
   8. Het schavot in een acrylhars insluiten voor het snijden en beeldvorming.
8. Bepaal de cellevensvatbaarheid met 3- [4,5-dimethylthiazool-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) cellevensvatbaarheid assay en Levend / dood-assay (Live / dead cel kleuring kit MPTP) op tijdstippen dag 3 en 7 ^11.
   Opmerking: De regeling van het bot-achtige template fabricage protocollen zijn vertegenwoordigd in de "Representatieve resultaten" sessie.

Resultaten

De algemene structuur van de BMT vertoont een unieke driedimensionale sjabloon met trabeculair bot-achtige interne structuren. De BMT bevat macro-poriën, micro-kanalen, en nano-poriën. Duidelijke configuraties volledig onderling verbonden macroporiën (gemiddelde grootte van 320 urn), micro-kanalen (gemiddelde diameter 50 pm) en nano-poriën (gemiddelde grootte van 100 nm) werden geverifieerd met een scanning elektronenmicroscoop (EVO-40; ZEISS) alsook door middel van micro-tomografie.

Figuur 1 toont stapsgewijs gedetailleerde protocollen in het creëren van een BMT. Door nauwkeurige controle van de protocollen van de bereiding van de PU sponzen om het sinterproces (P1 - P7 Figuur 1), de volgende functies kunnen worden gerealiseerd: een zeer dichte en gladde oppervlak na HA bekleden en drogen; een nauwkeurig gevormde en bemeten 3-D template; een volledig onderling verbonden poreuze trabeculaire netwerk vergelijkbaar met die van trabeculair bot; en micro-kanalen within elke trabecula dat intra-ossale kanalen zoals Havers grachten en Volkmann grachten (figuren 2 en 3) na te bootsen. Bovendien relatief hoge mechanische sterkte (~ 3,8 MPa), vergelijkbaar met die van humaan trabeculair bot werd gemeten met een druksterkte proef. Zeer soortgelijk histomorfometrische parameters met die van menselijke wervel trabeculair bot bevestigd door micro-CT analyse ^12. Verschillende magnitudes van capillaire werking werden aangetoond door middel van verschillende capillaire diameters in figuur 4 met behulp van computationele simulatie. Door middel van deze simulaties, we verwacht dat de BMT variërende absorptie tarieven zouden vertonen in de primaire-poriën (300-400 pm) en micro-kanalen (25-70 micrometer) op basis van de diameters. Kleinere haarvaten tentoongesteld sterker absorptiecapaciteit. Deze veronderstelling werd bevestigd in deze proef zoals weergegeven in figuur 5.

De BMT tentoongesteld zeer effectiefvochtopname en retentie door de capillaire werking van de micro-channel structuren; verblauwen stevenel werd toegepast als het vloeibare medium gemakkelijk volgen van de stroming (figuur 5). Op basis van computersimulatie, de BMT met deze configuraties werden waargenomen absorptie en retentie celsuspensies tot 8,5 cm in totale afstand binnen 10 sec. Door een sterke capillaire werking geïnduceerd door de inwendige structuren, de gekleurde medium tot de tegenovergestelde uiteinde van een 3 cm (hoogte) x 4 cm (lengte) x 1 cm (breedte) brugvormige sjabloon in 1 min en 40 sec. Voorts actieve cel mobilisatie en opname in het BMT werd waargenomen (Figuur 6). Vervolgens heeft de homogene cel mobilisatie en aanhechting resulteerde in verbeterde proliferatie en matrix-vorming in een gelijkmatig verdeelde formatie. Bovendien werd lange afstand (~ 10 cm) migratie van cellen door de BMT direct bevestigd na BMT werd verzadigd met de celsuspensie. Se eded cellen overleefden in de template-segment dat werd blootgesteld aan de lucht en niet ondergedompeld in het kweekmedium. In dit experiment werd het kweekmedium op de cellen door uitsluitend de putjes raken alleen de poten van de steiger voorzien. De capillaire werking vertoond door de microkanalen dan toegestaan ​​vers medium naar de top, brugdeel van de steiger te bereiken. Na 3 dagen van cultuur, werd de mal bezig met snel delende cellen. Na 7 dagen cultuur, werd elke trabecula verpakt door extra cellulaire matrices en embedded met ¹³ cellen.

Figuur 1. Het algemene botachtige template fabricage protocol van de voorbehandeling van PU spons (P1) naar de laatste warmtebehandeling (P7). Houd de precieze sinteren profiel als P7 is cruciaal bij het ​​bereiken gunstige mechanische sterkte.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

. Figuur 2 Representatieve stereomicroscoop (AmScope, SM-2TZ-M) beelden (x4) van een 80 ppi formaat PU spons (links), HA gecoat en gedroogd BMT (midden) en gesinterde BMT (rechts) (afmeting: 3. cm hoog x 4 cm in lengte x 1 cm in de breedte). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. SEM micro-CT beelden van een biogeen template: (A) een algemeen beeld van een biogene sjabloon rong> (B, C, D) opnamen microkanalen. Om duidelijke micro-kanalen in de trabekels markeren de sjabloon werd kristalsuiker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

. Figuur 4. Computational berekening van capillaire werking met verschillende diameters kanaal binnen dezelfde tijdsperiode (0,4 ms), terwijl de grootste capillair (d = 300 urn: verstaan ​​primaire poriën) geabsorbeerde het medium (blauw) tot 0,16 mm hoogte, de kleinste capillaire (d = 30 urn: verwijst naar micro-kanaal) opgenomen op de middellange tot 0,415 mm in de hoogte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 5. Beelden werden verschillen van absorptie vermogen van capillaire werking op basis van verschillende maten primaire poriën en micro-kanalen (primaire poriegrootte betrekking op de gemiddelde diameter: 60 ppi ≈ 470 urn, 80 ppi ≈ 320 urn, 100 ppi ≈ 200 pm). De gele lijnen stellen de capillaire werking geïnduceerd door de combinatie van primaire poriën en micro-kanalen. De rode lijnen geven de capillaire werking veroorzaakt door vooral micro-kanalen tentoongesteld in elk trabecula. Zoals weergegeven in (F), de 100 ppi template induceerde de sterkste capillaire werking, waardoor de volledige verzadiging van de sjabloon in 39 sec. De 80 ppi en 60 ppi templates werden vervolgens getest. (B) 0 sec, (C) 0,5 sec, (D) 1,5 sec, (E) 17,0 sec, (F) 39,0 sec, (G) 50,0 sec en (H) 1 min 18 sec na onderdompeling. (Template dimensie: 1cm x 1 cm x 4 cm in hoogte kubusvormige). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Het binnendringen en migratie van cellen uit de putjes geënte (deel I) naar unseeded putjes (punt V) via biogene templates geïnduceerd door capillaire werking. De initieel gezaaide cellen aan het einde van de unseeded been (punt V) onmiddellijk na volledige verzadiging. Na 3 dagen, de samenvloeiing van de cellen was duidelijk gedurende de gehele matrijs. Na 7 dagen, spatiotemporele collageen matrixvorming opgetreden binnen de celpopulaties (H & E kleuring). (Template afmeting: 3 cm x hoogte 4 cm x 1 cm breed). Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Een multicomponent sjabloon waaronder cellen, groeifactoren, voedingsstoffen, enz. Nodig voor een succesvolle botregeneratie en functioneel herstel van kritische afmetingen grote botdefecten. Binnen deze factoren, anatomisch conforme biologische eigenschappen zijn essentieel. Om biologische functionaliteit te bereiken, moet de sjabloon biocompatibiliteit, osteoconductiviteit, mechanische integriteit, voldoende oppervlakte voldoende oppervlaktestructuur en de middelen voor het transport van zuurstof en voedingsstoffen bezitten. Op cellulair niveau is de volgende eigenschappen zijn vooral belangrijk voor functionele herstel van grote botdefecten: vergemakkelijkt penetratie in template (actieve rekrutering), gelijkmatige verdeling over het sjabloon (retentie), versnelde proliferatie en hoge levensvatbaarheid (bewoning). Tenslotte, de daaropvolgende vorming van aanzienlijke extracellulaire matrix en de activering van genexpressie essentieel zijn essentiële biologische processen zoals snelle vascularisatie eennd osteogenesis.

Veel verschillende soorten synthetische substituten zijn voorgesteld om auto- / allo- bottransplantaten vervangen. Echter, de huidige steiger organisatie vertonen een interne micro-omgeving die micro-kanalen en nano-poriën, en daarom niet actief celinfiltratie, distributie en inhabitance diep in de synthetische substituten die groter zijn dan 10 mm te vergemakkelijken. Zij bieden geen fysieke signalen voor baanbrekende cellen om efficiënt, snel en gelijkmatig migreren diep in het bot template. In plaats daarvan, de beperkte passieve rekrutering van cellen leidt tot een ongelijk verdeeld celpopulaties tussen de buitenste en binnengebieden van de steiger. Dit verergert niet alleen de eerste uitdaging van de cellen bereiken van de kern van de matrijs, maar belemmert ook nutriëntenstroom en mobiele communicatie met het andere uiteinde van de synthetische vervanger. Dit type van disproportionele cel werving en bewoning resultaten in cel death en onvolledige botgroei nadat het skelet is geïmplanteerd in het lichaam ^14,15.

Zo hebben we het concept van capillaire werking ingebracht als primaire fysische cue om deze hindernissen te pakken. We hebben grondig ontworpen micro-kanalen in het BMT om de capillaire werking, dat zal goed zijn voor de primaire slepen kracht verantwoorde wijze voor het actief werven van cellen diep in de BMT induceren.

De PU spons coating techniek presenteert een aantal unieke eigenschappen. Ten eerste maakt een eenvoudige bereiding van goed gecontroleerde poreuze trabeculair structuren, die zelf afhankelijk zijn van de bestaande sjablonen structuren (dat wil zeggen, 80 poriën per inch sjabloon 300-400 pm). Dit is zeer belangrijk voor het optimaliseren poriegrootte van ¹⁵ infiltratie van osteoblasten. Ten tweede, de techniek maakt de constructie van onderling verbonden microkanalen, die goed zijn voor de belangrijke rol van het initialiseren cel verplaatsing ¹¹. Ten derde, er zijn bijna geen beperkingen bij het gebruik van de PU spons in termen van het maken van aangepaste vormen en maten van de sjablonen. De maker kan een schaar voor eenvoudige vormen of zelfs berekende lasersnijden voor complexe geometrieën te gebruiken. Met behulp van deze nauwkeurig gecontroleerde technologieën, hebben we de BMT. HA werd geselecteerd als het uitgangsmateriaal vanwege zijn biologische verenigbaarheid en osteoconductieve capaciteit ^17.

In deze studie, zijn er verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt. Tijdens het HA slurry preparaat, als de temperatuur te hoog is en de roersnelheid te laag is, de HA slurry wordt geplakt op onderkant van de beker worden en opdrogen. Na het coatingproces bij uitblazen van de overmaat HA suspensie, een te hoge luchtdruk kan scheuren op het oppervlak van de BMT induceren. Het is belangrijk om de druk betrekkelijk laag goed uitsluitend lucht uit de overmaat HA suspensie lucht te houden. Tenslotte, de tweede en derde stap van het sinterproceszijn meest cruciale (Heat 1 ° C / min tot 280 ° C en Warmte 0,5 ° C / min tot 400 ° C). In dit temperatuurbereik, zal de PU spons volledig uitbranden terwijl de HA wordt dicht. Als dit protocol wordt niet op de voet gevolgd, zal het BMT worden ingeklapt of verkruimeld na het sinteren.

De BMT in deze studie beschreven biedt verschillende voordelen. Ten eerste, de onderling verbonden macro-poriën (300-400 pm) lijken op die van de menselijke trabeculair bot en zorgt voor een soepele beenmerg flow. Ten tweede worden de sjablonen bestaan ​​uit micro-kanalen (25-50 pm) binnen elke trabeculaire septum naar de oorspronkelijke binnendringen botcellen via capillaire werking te versnellen. Zoals aangetoond met computersimulatie ^13, als de template slechts 300 urn poriën (primaire poriën) en geen microkanalen, zou de capillaire werking onvoldoende is voor de volledige verzadiging van de sjabloon met beenmerg. Dit zou met name gelden voor grote omvang gebreken die l zou vereisenarge grootte templates. Micrometer-kanalen vertonen zeer effectief vocht absorptie, en dus verwachten we de micro-kanalen in de eerste plaats verantwoordelijk voor de capillaire werking in onze studie zijn. Ten derde, hebben onze BMTs strategisch geplaatste nano-poriën. Gegevens uit de literatuur geven aan dat cellen zijn bijzonder gevoelig voor nano-patronen ^18,19; Daarom verwachtten we de nano-poriën in de wanden van de microkanalen een rol bij het vergroten celhechting spelen. Nanoschaal poriën (100-400 nm) op het oppervlak van de trabeculaire septa toegelaten geïmmobiliseerde cellen te verankeren. Kortom, het gecombineerde effect van deze drie inwendige structuren resulteerde in verhoogde mobilisatie en cel adhesie hele template. Echter, er zijn een aantal beperkingen van het protocol en de kritische stappen te fabriceren de perfecte BMT. Zo is er vaak een grote hoeveelheid HA slurry bereid gevolg van de moeilijkheid van het bijhouden van een homogene viscositeit tijdens coating. Ook is er een beperking in het makentemplates groter dan 5 cm ³ in volume als gevolg van de werktijd, terwijl coating. De bekledingsdikte is kritisch die afhankelijk van technieken van de maker.

De resultaten van onze studie suggereren dat de BMT kan absorberen en vasthouden cellen potentiële voordelen boven conventionele alloplastisch (of synthetische) scaffolds bieden. Een prospectief onderzoek wordt overwogen om de voordelen van BMT voor osteogenese en / of angiogenese controleren met bot gerelateerde groeifactoren. Daarom dat we dat onze unieke gekenmerkte BMT schavot de belangrijkste belemmeringen onvoldoende beenmerg infiltratie in de synthetische constructies en onvolledige botregeneratie in grote gebreken kunnen pakken.

Het uiteindelijke doel van deze studie is om de huidige paradigma van biotechnologie in het bot wederopbouw en functioneel herstel in kritieke-sized botdefecten vereenvoudigen door het elimineren van de behoefte aan tijd- / arbeidsintensieve beenmergstromal cellen isolatie en expansie processen. Tot slot willen we anatomisch gebruiken conforme 3D-constructies met micro-kanalen en nano-poriën, die een snelle cel absorptie, homogene verdeling en inhabitance opwekken voor de wederopbouw van het bot.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
polyurethaan sponzen	Plastifoam	PU-3215
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	167176
Hydroxyapatietpoeder	Ossgen
Polyvinylalcohol	Sigma-Aldrich	341584
Carboxymethylcellulose natriumzout	Sigma-Aldrich	360384
ammoniumpolyacrylaat	Vanderbilt	DARVAN 821A
Glycerin	Sigma-Aldrich	G2289