Methodenartikel

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

DOI:

10.3791/52948

⸱

12 juni 2015

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, California State University, Long Beach, 2Ximedica, 3School of Engineering, Brown University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkheid van celmigratie is te zien aan de ontwikkeling van het menselijk leven. Wanneer cellen migreren, genereren ze krachten en brengen deze krachten over naar hun omgeving, wat leidt tot beweging en migratie van cellen. Om de mechanismen die celmigratie kunnen veranderen en/of beïnvloeden te begrijpen, kan men deze krachten bestuderen. In theorie bevat het begrijpen van de fundamentele mechanismen en krachten die ten grondslag liggen aan celmigratie, de belofte van effectieve benaderingen voor de behandeling van ziekten en het bevorderen van cellulaire transplantatie. Helaas zijn moderne chemotaxiskamers die zijn ontwikkeld meestal beperkt tot twee dimensies (2D) en hebben ze complexe diffusiegradiënten die het experiment moeilijk te interpreteren maken. Daarom hebben we een direct-viewing kamer ontwikkeld voor chemotaxisstudies, die wordt beschreven in dit artikel, die het mogelijk maakt om moderne chemotaxiskamer obstakels te overwinnen, in staat om celkrachten en specifieke concentratie binnen de kamer in een 3D-omgeving te meten om 3D celmigratie te bestuderen. Wat nog overtuigender is, is dat deze aanpak het mogelijk maakt om diffusie door 3D collageen matrices met succes te modelleren en de diffusie coëfficiënt van een chemoattractant door meerdere verschillende concentraties van collageen te berekenen, terwijl het systeem eenvoudig en gebruiksvriendelijk blijft voor tractiekrachtmicroscopie (TFM) en digitale volumecorrelatie (DVC) analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De geprefereerde beweging van cellen naar een concentratiegradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol bij pathologische en fysiologische processen in het lichaam. Dergelijke voorbeelden zijn huid en slijmvliezen wondgenezing 1, morfogenese 2, 3 ontsteking en tumorgroei 4,5. Ook is aangetoond dat kankercellen kunnen migreren door zowel individuele als collectieve cel migratiestrategieën 6. Bovendien kan instabiliteit diffusie mechanismen scheiding van enkele of geclusterde cellen van een tumor die / object induceren en dan kan immigratie naar een bron van voedingsstoffen en dus binnendringen grotere gebieden en weefsels 7.

Bovendien is aangetoond dat diverse migratiemechanismen actief kunnen zijn in 2D en 3D, vanwege verschillende rollen van adhesiemoleculen 8. Daarom is een verhuizing naar fysiologisch relevante in vitro assays om celbeweeglijkheid te onderzoeken in een measureable en eenvoudige manier van belang is bij het ​​begrijpen van de cel beweging verschijnselen 9. Helaas, de moeilijkheid bij het analyseren van celmigratie, een uitgebreide kwantificeerbare chemotaxis assay vereist meestal een lange moeizame methode, gebaseerd op de meting van onpartijdig celmotiliteit en transport verschijnselen modellen.

Past experimentele benaderingen naar cel chemotaxis onderzoeken onder meer de Boyden kamer 10 en de onder agaroseanalyse 11. Echter, in deze vroege assays, celmigratie experimenten niet de beweging met betrekking tot tijd te controleren. More, belangrijker, de concentratie gradiënten voor de experimenten waren niet goed gedefinieerd of volledig begrepen terwijl slechts het behoud van de signalering niet meer dan een paar uur. Bovendien vroeg chemotaxis kamer pogingen beperkt cel migratie naar twee dimensies en niet toestaan ​​dat de ene naar de kinetiek van migratie 12 bewaken. Kijkend naar de Boyden kamer, een eindpunt assayzou niet toestaan ​​dat de onderzoeker migratie visueel observeren en kon niet direct onderscheid chemotaxis (directionele beweging) van chemokinesis (random beweging). Bovendien zijn een aantal variabelen-verschillen in de porie grootte en dikte van de membranen-maakte de kamer zeer moeilijk om gemakkelijk te reproduceren en verborgen de migrant reactie van cellen om chemokines 13,14.

Met het nieuwe begrip van microfluidics, hebben nieuwe kamers en micro-apparaten onderzocht als een instrument om mobiele motoriek onder interstitiële stroom omstandigheden te onderzoeken of chemotaxis 15,16. Onder deze nieuwe apparaten, werden nieuwe cel metrics geïntroduceerd en onderzocht, zoals het effect van shear stress op een mobiele 17,18. Helaas, het verleden en de huidige microfluïdische chemotaxis kamers beperkt studies van de cel migratie naar 2D-substraten een belangrijke tegenslag omdat veel biologische processen, met inbegrip van de tumorcel invasie en metastase, en immune celmigratie, betrekken 3D migratie.

Directe observatie-kamers waar chemoattractant oplossing in contact met een 3D gel met cellen zijn eveneens ook gemeld 19,20. Deze kamers hebben twee compartimenten, een met een chemoattractant en één bevattende cellen zijn verbonden naast elkaar horizontaal 21 of concentrische ringen 22. Deze systemen worden aangegeven in de juiste richting, maar geen chemotaxis systeem houdt gedurende langere tijd.

Daarnaast hebben onderzoekers ook onderzocht door middel van diffusie collageenmembranen in dialyse-cellen, alsook de diffusie van tracer moleculen door collageen monsters onderworpen aan hydrostatische druk 23-25. Sommige diffusie experimenten collageen gels afhankelijk fysische en chemische modificaties van de gel met behulp van magnetische velden en chemische incorporatie 26. Een populaire methode voor het modelleren van diffusiviteit in collaGenous weefsels gebaseerd op de fluorescentie beeldvorming van continue punt fotobleken. Deze werkwijze is geopenbaard anisotropie in de diffusie coëfficiënten van macromoleculen in georiënteerde collagene weefsels. Toch is fotobleken gebruikt in gewrichtskraakbeen en niet-collageen matrices. Terwijl soortgelijke dienen de nodige modelleren experimenten doorgevoerd specifiek begrip van de diffusiecoëfficiënt van collageen gels. Wat nog belangrijker is, zijn de systemen niet een methode voor het meten van mobiele troepenmacht benutten.

Helaas zijn de meeste systemen lijken te ontbreken een of twee belangrijkste elementen voor een ideaal systeem: het toestaan ​​van cell tracking, een diffusie gradiënt begrip met een chemotactische factor door de matrix, een relatief eenvoudige set-up met een gemak van de reproduceerbaarheid, het minimaliseren van cel-cel interacties, en het vermogen om dimensionele eenheden voor het kwantificeren (bijvoorbeeld snelheid, kracht, specifieke concentratie) te meten. Møghe et al. 27 voorgesteld een systeem dat de meeste van deze eisen waarbij cellen oorspronkelijk werden gedispergeerd door de gel in plaats gericht op het filteroppervlak voldaan, maar was moeilijk krachten die de cel genereert meten.

Hiervoor presenteren we een vlakke gradiënt diffusiesysteem chemotaxis onderzoeken 3D collageenmatrix, waarmee men moderne diffusiekamer beperkingen van bestaande assays, die is gebaseerd op time-lapse microscopie, samen met beeldanalyse technieken om cellen te meten overwinnen krachten in een 3D-omgeving. Dit protocol is een eenvoudige, maar innovatieve manier om een ​​eenvoudige 3D diffusiekamer die kunnen worden gebruikt om 3D chemotaxis in verschillende cellen te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D-Mold ontwerp en Onderdelen

  1. Schimmel
    1. Voor het werken, het verkrijgen van een siliconenelastomeer kit, een live-cell imaging kamer, een 22 mm glazen dekglaasje en een bewerkte aluminium metalen kubus met afmetingen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereid de live cell imaging kamer te vormen door het plaatsen van het dekglaasje in de onderste houder en monteren van de rest van de kamer overeenkomstig de door de leverancier.
    2. Vervolgens, met behulp van een tang, plaatst u de bewerkte aluminium kubus in het midden van het live-cell imaging kamer huisvesting en op de top van het dekglaasje, en stel vervolgens opzij.
    3. Meng siliconenelastomeer oplossingen volgens het protocol van de fabrikant tot 5 ml van elastomeer te maken.
    4. Met behulp van een wegwerp lab spatel, giet siliconenelastomeer oplossing in live cell imaging kamer Setup en niet geplaatst gefreesd aluminium metalen kubus bewegen. Plaats het systeem op het lab bank, op een veilige plaats O / N voor het genezen.
    5. De volgende ochtend, deconstruerende live-cell imaging kamer, zoals aanbevolen door de fabrikant en trek mal met behulp van een tang. Met behulp van een tang, voorzichtig pak het bewerkte aluminium metalen kubus van schimmels. Ga naar de gootsteen en spoel de mal met gedemineraliseerd water. Plaats de vorm op keukenpapier gedroogd.
    6. Eenmaal droog, met een hobby mes, snijd spleten door de schimmel, afstand van 2,34 mm van elkaar langseinde, binnen de siliconen mal. Zorg ervoor dat de mal blijft op een veilige en droge plaats tot u klaar bent om het systeem te bouwen voor een experiment zijn.
  2. Hydrofiele en hydrofobe dekglaasjes Bereiding
    1. Om de collageen matrix te hechten aan een oppervlak hydrofiel maakt dekglaasjes:
      1. Met behulp van een wegwerp pipet, te meten uit 150 ul van 3-aminopropyl-trimethoxysilaan en giet oplossing in een 50 ml buis. Voeg 30 ml 100% ethanol aan de 50 ml buis met een tweede wegwerppipet en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Ponze oplossing in een glazen petrischaal en zet apart.
      2. Giet 15 ml van 100% ethylalcohol in een tweede petrischaal en zet opzij (zorg ervoor om gerechten te labelen).
      3. Met behulp van een nieuwe disposable pipet, te meten uit 30 ml gedemineraliseerd water en giet oplossing in een 50 ml buis. Dan worden op een nieuwe wegwerpbare pipet handeling uit 1875 gl glutaaraldehyde en giet oplossing in dezelfde 50 ml buis en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Giet het mengsel in de derde petrischaal, en zet apart.
      4. Met behulp van een tang, neem een ​​22 mm ronde glazen dekglaasje en spoel beide kanten met 100% ethanol mengsel met behulp van een wegwerp pipet.
      5. Plaats gespoeld glazen dekglaasje in 3-aminopropyl-trimethoxysilaan met 30 ml 100% ethanol oplossing schaal en laat zitten in oplossing gedurende 5 min.
      6. Met een pincet, neem glas dekglaasje en spoel opnieuw met 100% ethanol-oplossing met wegwerp pipet.
      7. Drop gespoeld glas dekglaasje in 1875pl glutaaraldehyde en 30 ml gedeïoniseerd water mengsel en laat gedurende 30 min.
      8. Na 30 minuten, verwijder glazen dekglaasje met een pincet en spoelen met gedeïoniseerd water en plaats op droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur.
      9. Herhaal dekglaasje dompelen en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen.
    2. Maak hydrofobe dekglaasjes door het gegeven protocol.
      1. Voeg 500 ul van tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 gl azijnzuur en 19,4 ml hexaan in een 50 ml buis en vortex gedurende 2 min. Giet oplossing in een glazen petrischaal en zet apart.
      2. Met behulp van schone tang, neem een ​​glas dekglaasje en neerzetten in bereide gemengde oplossing gedurende 2 minuten. Na 2 minuten zijn verstreken, neem glas dekglaasje met een pincet en spoelen met gedemineraliseerd water met behulp van een wegwerp pipet en plaats dekglaasje op het droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur. WINKEL dekglaasje in plastic Petrischalen tot gebruik.
      3. Herhaal dekglaasje DIPPing en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen.

2. vormstelsel

  1. Voor het gebruik van mallen, met behulp van een wegwerp pipet spoel de mal met 90% ethylalcohol over een chemisch afval container. Vervolgens plaatst de vorm in een petrischaal gevuld met gedemineraliseerd water en laten zitten O / N.
  2. Neem de schimmel uit de oplossing met behulp van een tang en leg ze op een handdoek aan de lucht drogen voordat u de vormstelsel.
  3. Terwijl de mal is de lucht drogen, snijd het plein hydrofiele dekglaasjes in twee rechthoeken iets groter dan 3,95 mm x 5,99 mm met een hoge precisie-diamant schrijvende tool. Schuif elke snede rechthoek dekglaasje in de sleuven gesneden in de siliconen mal.
  4. Draai de mal ondersteboven en breng vacuüm vet langs de bodem van de siliconen mal met een wegwerpbare pipet. Vervolgens, draai de mal rechts achter-kant naar boven en druk op de bodem van de vorm op de cirkelvormige hydrofiele glas coverslip een afdichting.
  5. Met wegwerphandschoenen, pak de samengestelde mal en plaats in een wegwerp petrischaal en vervolgens in een bio-kap. Schakel UV Bio-kap lamp voor 1 uur te steriliseren de mal voordat experimenten optreedt.

3. Collageen mengsel en 3D Matrix

  1. Voor het bereiden van het mengsel collageen, kleurstof en cellen te bereiden voor beeldvorming volgens standaardprotocollen 28.
  2. Met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29,30, in een bio-kap, meng cel media en chemoattractant in een 15 ml buis chemoattractant gewenste concentratie. Pipetteer 5 ml specifieke celmedium-chemoattraetantconcentratie oplossing in een 15 ml buisje en zet de oplossing in een verwarmd waterbad.
  3. Met behulp van een pipet, extract 5 ml van alleen mobiele media in een tweede 15 ml buis en plaats in een verwarmd waterbad op te warmen de oplossing voor microscopie experimenten.
  4. In een bio-kap, pipet 30 ui 10X fosfaatbuffered oplossing (PBS) in microcentrifuge buis. Voeg 6 pi van 1 N natriumhydroxide (NaOH) in dezelfde micro centrifugebuis en vortex gedurende 15 seconden.
  5. Verkrijgen van collageen I staart rat oplossing uit de koelkast en te verplaatsen naar de bio-kap met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29. Zorg ervoor dat het collageen nog koud is. Pipet 168.3 ul van collageen in dezelfde micro centrifugebuis.
  6. Voeg vervolgens 18 ul van geel-groen fluorescent-carboxylaat gemodificeerde microsferen met een pipet aan dezelfde micro-centrifugebuis. Vortex de microcentrifuge buis met alle oplossingen voor 30 sec.
  7. Voeg 77,7 ul van gewenste cel media-cel-mengsel (ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml concentratie) in micro centrifugebuis toe en meng met een pipet tip voor 20 sec. Zonodig weg matrixdichtheid door de aangepaste collageen mengsel aangepast aan de toevoeging van fluorescerende kralen en cellevensvatbaarheid tabel (Tabel 1).
  8. Pipetteer 300 & #181; l van collageen-cel mengsel in het centrum goed (goed # 2) van de bereide vormstelsel. Plaats de vorm op een wegwerp petrischaaltje verplaatsen in een standaard incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2.
  9. Verwijder het systeem uit incubator en plaats terug in de bio-kap. Behulp van een tang, verwijder beide hydrofobe dekglaasjes door klemmen op de bovenkant van elk dekglaasje en trekken omhoog en van de matrijs.
  10. Verplaats het hele systeem om de gewenste microscopie en image te zorgen collageen schimmel kanten zijn nog steeds rechtstreeks naar zorgen voor een vlakke diffusie verloop.
  11. Met het systeem nog onder de microscoop, telkens met 100 ul enkel-kanaals pipet, voeg 100 pl celmedium in well 1. Vervolgens, telkens met 100 gl enkelkanaals pipet voeg 100 pl celmedium met chemoattractant gewenste concentratie in well 3.
  12. Onmiddellijk na het toevoegen van oplossingen in zowel putjes begonnen imaging.

4. Imaging en DiffusionModellering

  1. Als men wil de diffusiecoëfficiënt voor de specifieke collageen dichtheid aan de specifieke concentratie te berekenen vinden, volg dan de onderstaande protocol:
    1. Volg de gegeven protocol bovenstaande titel "Collageen mengsel en 3D Matrix," in plaats van het genereren van mobiele media met chemoattractant gewenste concentratie, maken 5 uM rhodamine in een 15 ml buis met behulp van standaard berekeningen en protocollen 30.
    2. Afbeelding 3D collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscoop met een argon laser (488 nm) om de fluorescentie te vangen. Afbeelding elke 2 of 3 seconden tot 7 uur.
  2. Voor Diffusion Modeling: Het gebruik van het wiskundige model hieronder weergegeven, schrijven computational software code voor de verwerking en analyse van deze algemene stappen.
    figure-protocol-1
    1. Importeer afbeeldingen in computational software voor herschalen en het normaliseren van de maximale Intendiversiteit. Zet beelden naar een grijze kleur-kaart van het beeld om de rand te selecteren. Kies een as langs het midden van de afbeelding, rechts van het midden en links van het midden.
    2. De computationele softwarecode, trek de genormaliseerde intensiteit samen met de werkelijke intensiteit en het verschil tussen de twee.
    3. Vervolgens, het invoeren van de parameters die nodig zijn voor de montage (concentratie, tijd en lengte).
    4. Zet de genormaliseerde concentratie versus tijd en concentratieprofiel over de x-as met de kromme aan de gegevens.
    5. Bereken de coëfficiënt van diffusie met behulp van de computationele softwarecode.

5. Experimentele Metingen

  1. Terugverwijzend naar de diffusievergelijking, herschrijven van de vergelijking om de specifieke concentratie vinden op iedere plaats binnen het systeem als getoond in onderstaande.
    figure-protocol-2
    Waar:
    L = lengte van the collageenmatrix
    x = locatie in onderzoek
    D = coëfficiënt van diffusie
    t = verstreken tijd
  2. Tijdens chemotaxis experimenten zorgen voor de specifieke tijd dat moment chemokine toegevoegd aan het systeem op te nemen. Zodra celmigratie beweging wordt gevonden, ervoor te zorgen dat confocale time-lapse-opname op te nemen en noteer de specifieke tijd en locatie van de rand waar de beeldvorming voorgedaan.
  3. Tijdens data-analyse, sluit de bekende verstreken tijd, plaats en diffusie coëfficiënt voor de specifieke cel in de vergelijking met de genormaliseerde specifieke concentratie op enig punt in het collageen voor zowel diffusie celexperimenten vinden.

6. Tracking Cell Migratie Gebruik makend van TFM

  1. Om celmigratie volgen met behulp van TFM / DVC technieken Volg de onderstaande protocol:
    1. Na toevoeging van chemoattractant gewenste concentratie in well 3, start de 3D beeldvorming van collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscope te vinden een cel te onderzoeken.
    2. Zodra een bewegende cel wordt gevonden, plaatst de cel in het midden van het gezichtsveld en gebruiken een piëzo-elektrische motor (om de afbeelding in de z-as), het elke 1 of 2 min.
    3. Voor de berekening van de cel troepenmacht en vervorming, het genereren van een computationeel code om de verplaatsingen van de fluorescentie kralen na de TFM / DVC protocollen 31 te vinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen van de test om de migratie van de cellen nauwkeurig te beoordelen vertrouwt op een goede opzet van het systeem. Daarom is het essentieel voor zorgen dat het diffusiesysteem matrijs nauwkeurig ontwerpen en grote zorg in het plaatsen van hydrofobe en hydrofiele dekglaasjes, zie figuur 1. Als het systeem goed ontworpen en tijdens de diffusie modelleringsfase zorgen voor een voorbeeld goede lineaire startlijn, men in staat fijn bereiken fluoresceert beelden, zoals weergegeven in figuur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stappen voor een succesvolle diffusie experimenten met of zonder cellen zijn: juist het opzetten van de mal vergadering; ontwikkeling van de benodigde handigheid om schade tijdens de extractie van hydrofobe dekglaasjes voorkomen; zorgen voor een zeer goede lineair startlijn te kunnen berekenen van de diffusiecoëfficiënt vinden; experimentele berekeningen van zowel collageen en chemoattractant corrigeren; correct gebruik van live cell imaging systeem om matrix zorgen niet uitdroogt; en onderhouden van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Drs. Jonathan Reichner en Angle Byrd graag bedanken voor hun inzichten in celexperimenten. Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Silicone elastomer kitDow Corning Corp182 SIL ELAST KIT.5KGeen twee-onderdeel mix met een 10:1 mix
Live cell imaging chamberLive Cell InstrumentCM-B18-1CMB voor 18 mm ronde dekglasjes
22 mm Glass CoverslipFisher ScientificNC0180281Neuvitro Corp. dekglasje 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knifeX-ActoX3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilaneSigma-Aldrich281778-5ML
GlutaraldehydePolysciences, Inc00216A-10Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tubeFisher Scientific14-432-22Standaard vloermodel en tafelcentrifuges
Glass Petri dishFisher Scientific08-747AHerbruikbare Petri-schalen: Compleet (60 x 15 mm)
ForcepsFisher Scientific22-327-379Fine Point Forceps
Cover glassesFisher Scientific12-518-105ARechthoek; 30 x 22 mm; Dikte nr. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctylGelestSIT8174.0
Acetic acidSigma-Aldrich320099Azijnzuur ACS reagens, ≥99,7%
HexaneSigma-Aldrich296090watervrij, 95%
Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023200 proof, voor moleculaire biologie
High-precision diamond scribing toolLunzerPV-081-3Straalschrijver met rechte verlengde punt,.020" (.50 mm) diameter door.200" (5.0 mm) puntlengte
Vacuum greaseDow Corning14-635-5CHigh-Vacuum Grease
15 ml tubeFisher Scientific14-959-49D15 ml conische centrifugeerbuizen met hydrofobe, biologisch inert oppervlak
10x phosphate buffered solutionFisher ScientificBP399-5001,37 M natriumchloride, 0,027 M kaliumchloride en 0,119 M fosfaatbuffer
1 N sodium hydroxideSigma-Aldrich38215Natriumhydroxide concentraat
Collagen I, rat tailBD Biosciences354236Rat tail 
Micro centrifuge tubeFisher Scientific02-681-332Volume: 2,0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
steriele; eenvoudig verpakt
[header]
Carboxylate-modified microspheresInvitrogen F-8813Carboxylaat-gemodificeerde microspheren, 0,5 µm, geel-groen fluorescerend (505/515), 2% vaste stof
RhodamineSigma-Aldrich83689Rhodamine B voor fluorescentie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236(1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284 (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Onderzoek naar chemotaxis3D collageenmatrixanalyse van celmigratietractiekrachtmicroscopiedigitale volumecorrelatieconfocale microscopiefabricage van siliconenmatrijzenhydrofobe dekglasjeschemoattractantgradi nt

Gerelateerde artikelen