Ontwikkeling van Sulfidogenic Slib van mariene sedimenten en Trichloorethyleen Vermindering van een Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Samenvatting

Microbiële sulfaatreductie is een proces van groot belang in de milieubiotechnologie. Het succes van de sulfidogene reactoren hangt onder meer af van de microbiële samenstelling van de slib. Hier presenteren we een protocol om sulfidogene slib uit hydrothermale ventilatiesedimenten in een UASB-reactor te ontwikkelen voor doeleinden van reductieve dechlorering.

Samenvatting

De belangrijkheid van microbiële sulfaatreductie berust op de verschillende toepassingen die het biedt in de omgevingsbiotechnologie. Gecontroleerde sulfaatreductie wordt gebruikt in de behandeling van industrieel afvalwater om grote concentraties sulfaat samen met de chemische zuurstofvraag (COD) en zware metalen te verwijderen. De meest gebruikelijke benadering van het proces is met anaërobe bioreactoren waarin sulfidogene slib wordt verkregen door aanpassing van overwegend methanogene granulaire slib tot sulfidogenese. Dit proces kan lang duren en elimineert niet altijd de concurrentie voor substraat door de aanwezigheid van methaanproducerende organismen in de slib. In dit werk stellen we een nieuwe benadering voor om sulfidogene slib te verkrijgen waarbij hydrothermale ventilatie-afzettingen de oorspronkelijke bron van micro-organismen zijn. De microbiële gemeenschap die zich ontwikkelt in aanwezigheid van sulfaat en vluchtige vetzuren is breed genoeg om sulfaatreductie over een lange periode te ondersteunen zonder remming door sulfide te vertonen.

Dit protocol beschrijft de procedure om de slib te genereren uit de afzettingen in een upflow anaerobe slibdeken (UASB) type reactor. Verder presenteert het protocol de procedure om de capaciteit van de slib aan te tonen om een model van een zeer giftige organische verontreiniging zoals trichlooretheen (TCE) te verwijderen door middel van reductieve dechlorering. Het protocol is verdeeld in drie stadia: (1) de vorming van de slib en de bepaling van zijn sulfaatreducerende activiteit in de UASB, (2) het experiment om het TCE door de slib te verwijderen, en (3) de identificatie van micro-organismen in de slib na de TCE reductie. Hoewel in dit geval de afzettingen werden genomen van een locatie in Mexico, kan het genereren van een sulfidogene slib door het gebruik van deze procedure werken als er een andere bron van afzettingen wordt genomen, aangezien mariene afzettingen een natuurlijk reservoir zijn van micro-organismen die kunnen worden verrijkt in sulfaatreducerende bacteriën.

Inleiding

Een van de belangrijkste bijdragen aan milieubiotechnologie was het ontwerpen van bioreactoren waarbij het slib gebruikt (inoculum) kon presteren onder sulfaat reducerende omstandigheden. Sulfaat (SR) maakt de behandeling van afvalwater dat hoge concentraties sulfaat bevatten naast de gelijktijdige verwijdering van CZV, zware metalen en organische verontreinigingen, een feit dat SR maakt een gewenste eigenschap van het slib ^1. Enkele voorbeelden van afvalwater verontreinigd met sulfaat afkomstig van leerlooierij, papier, farmaceutische en chemische industrie ^1. Echter, de meeste van de literatuur heeft betrekking op slib sulfidogenic wanneer methanogene korrelslib is aangepast aan sulfidogenesis ^2. Deze aanpassing wordt gewoonlijk bereikt door het manipuleren van de CZV / SO ₄ ^2- verhouding in de bioreactor en het toevoegen van chemicaliën aan methanogenen in het slib ^2,3 remmen. Naast de lange tijd dat may vereisen de vorming van de sulfidogenic granules, de concurrentie tussen methanogenen en sulfaatreduceerders en de tolerantie van het slib aan hoge concentraties van sulfide zijn enkele van de belangrijkste problemen die kunnen ontstaan ​​indien de sulfidogenic gebruikt slib in de bioreactor wordt verkregen uit de aanpassing van voornamelijk methanogene slib sulfaat reducerende omstandigheden. In dit werk, de procedure om een ​​overwegend sulfidogenic slib van hydrothermale bronnen sedimenten (Punta Mita, Nayarit, Mexico) in een opwaartse stroming anaerobe slibdeken reactor (UASB) te verkrijgen beschrijven we, dan evalueren we de sulfaat reducerende activiteit in de tijd en voeren een experiment aan de toepassing ervan op de reductieve dechlorering te evalueren. De locatie van het sediment werd gekozen omdat het is vermeld dat doordat er ter vorming van sulfiden vanwege de sulfaat reducerende activiteit vertoond door de microbiële gemeenschap bevolken aldus vastgestelde plaats ^4.

Er zijn several voordelen in het verkrijgen van deze sulfidogenic slib uit sedimenten op de aanpassing van methanogene korrelslib te sulfidogenesis. Sommige van deze voordelen zijn: (1) het is niet nodig om granules de bioreactor te werken, (2) het slib tolereert relatief hoge concentraties van sulfide in vergelijking met andere UASB die werken met aangepaste methanogene slib, en (3) wordt geen concurrentie substraat methanogens zelfs als acetaat wordt toegepast in het mengsel van vluchtige vetzuren die is opgenomen in het kweekmedium om de vorming van het slib te bevorderen.

Deze procedure werd gevolgd om sulfidogenesis bevorderen, omdat mariene sedimenten een natuurlijke pool van diverse micro-organismen zoals sulfaat reducerende bacteriën fermenteren bacteriën en dehalogeneren bacteriën slechts een paar te noemen ^5,6. Het type consortium ontwikkeld uit mariene sedimenten door het gebruik van dit protocol kan de efficiëntie vertonen in sulfaat en dus hoge s ulfate reducerende activiteit in de tijd en een hogere tolerantie voor sulfide bij concentraties hoger dan de gerapporteerde als giftig voor methanogenen en sulfaat reducerende bacteriën. Aan de andere kant, is het waarschijnlijk dat de dehalogeneringsactiviteit vermogen ook in de sedimenten wordt door de protocol hier wordt voorgesteld, maar kan afhangen van de oorspronkelijke microbiële gemeenschap. Deze aanname wordt gedaan op basis van het feit dat reductieve dechlorering kan plaatsvinden hetzij ademhaling of cometabolisme beide omstandigheden die kunnen worden bevorderd mariene microbiële gemeenschap ^7. De teelt van sedimenten aan het slib verkrijgen werd uitgevoerd door toepassing van een mengsel van acetaat, propionaat en butyraat als substraat omdat deze vluchtige vetzuren worden gebruikt door verschillende stammen van sulfaat reducerende bacteriën. Deze zuren zijn ook type koolstofverbindingen vaak gevonden in mariene sedimenten volgens verschillende rapporten in de literatuur over koolstofhoudend materiaal in zee sedimenten ^5,6.

content "> Tenslotte aantal van de giftige stoffen die worden aangetroffen in het grondwater en andere waterlichamen wereldwijd zijn de gechloreerde oplosmiddelen zoals trichloorethyleen (TCE) en perchloorethyleen (PCE). Deze verbindingen zijn toxisch niet alleen de mens, maar Ook voor micro-organismen, met name TCE, die nog steeds wordt beschouwd als een prioriteit verontreiniging door de Environmental Protection Agency in de VS ^8. In dit werk voorgesteld we een experiment waarin de sulfidogenic slib wordt getest op zijn vermogen reduceren TCE bij concentraties die in de range gerapporteerd voor gechloreerde verbindingen biologische afbraak onder methanogene omstandigheden ^9,10. Vermeldenswaard is dat het grootste deel van het onderzoek naar de biologische afbraak van gechloreerde verbindingen is uitgevoerd onder methanogene omstandigheden ^9,10 waard. Wij zijn van mening dat het experiment met TCE in dit protocol wordt voorgesteld, is een goed voorbeeld van de mogelijke toepassingen van het slib. Het doel van dit experiment was om ewaarderen de tolerantie van het slib naar de TCE en TCE effect op de sulfaat reducerende activiteit. Aangezien het meeste onderzoek naar biologische afbraak van gechloreerde verbindingen onder methanogene condities plaatsvindt, dit protocol stelt de vorming van een slib kan worden gebruikt om gelijktijdig: (1) verwijderen sulfaat, (2) verwijderen COD en (3) verwijderen gechloreerde verbindingen. Een volgende stap kan zijn om het slib op de gelijktijdige verwijdering van TCE en zware metalen te evalueren (naast sulfaat en COD), twee aandoeningen die niet onder methanogene condities worden geëvalueerd.

Protocol

Figuur 1. Regeling voor de stappen van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verzamel mariene sedimenten voor de vorming van het slib

1. Identificeer een laagdrempelige onderzeese omgeving ofwel dichtbij warmwaterkraters (door de aanwezigheid van sulfiden, die een hogere sulfaat reducerende activiteit kan duiden) of naar een gebied waar afval van organische stof detecteerbaar.
2. Voor de toepassing van dit werk, duurt ongeveer 3 of 4 kg sediment en laat het water uit de monsters. Plaats de monsters in het donker plastic zakken. Geen koeling nodig.
3. Eenmaal in het laboratorium, houdt de zakken met de monsters in de koelkast als ze niet zullen onmiddellijk worden gebruikt. Voor de toepassing van dit werk, samples kan worden in de koelkast voor weken of maanden voordat u ze gebruikt.
4. Neem een groot deel van het sediment monster (dat wil zeggen 1 of 2 kg) en gebruik een geschikt mesh (0,2 cm) ter verwijdering van sedimenten de grote brokstukken van het koolstofhoudende materiaal te vinden of een stenen die aanwezig kunnen zijn.
   Opmerking: In dit geval is een maaswijdte van 0,20 cm diameter (0,0767 inch) werd gebruikt, maar het kan van een ander formaat volgens de grootte van de deeltjes in het monster.
   1. Na het passeren van het sediment door de mazen, meng de geselecteerde bevorderen dat het gedeelte homogeen gedeelte.
   2. Neem gescheiden kleinere monsters (dat wil zeggen, 2 tot 3 g) de vluchtige gesuspendeerde vaste stoffen (VSS) gehalte te bepalen volgens de standaardmethoden ^11.
      Let op: Zie figuur 2 voor de stappen 1,2 tot 1,4.

Figuur 2. Foto's van de sediment monsters.(A) Sedimentstalen net na na het passeren door de mazen genomen. (B) Sediment monster. (C) Monster genomen voor het wegen voorafgaand aan vluchtige gesuspendeerde vaste stoffen (VSS) bepalen. De petrischaal hoeft niet te worden gesteriliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bioreactor Set Up

1. Voor de toepassing van dit werk, gebruik dan een UASB glazen reactor met een totaal werkvolume van 3 L. alternatief gebruik maken van een 1 of 2 L volume glazen reactor.
2. Op basis van de VSS inhoud van de sedimenten berekenen van de hoeveelheid sediment worden gebruikt als inoculum voor 5 g VSS verkrijgen 1 L.
3. Er rekening mee dat indien de hoeveelheid sediment na berekening te groot, dan ongeveer 25% tot 30% volume van de bioreactor moet plaats ingenomen door de sedimenten.
   1. Noteer de VSS inhoud aangezienverandert wanneer de microbiële gemeenschap verrijkt in de bioreactor. De VSS inhoud is nodig voor de berekening van sulfaat reducerende activiteit in de bioreactor.
4. Ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentratie van het basismedium en bufferoplossing in de bioreactor is vergelijkbaar met de gerapporteerde door Guerrero-Barajas et al. (2014) ^12.
   1. Ervoor zorgen dat de laatste delen van de sedimenten, basaal medium, bufferoplossing en vluchtige vetzuren gelijk aan de uiteindelijke werkvolume van de reactor. De basale medium recept ¹² bevat de juiste concentraties voor de spoormetalen en vitaminen oplossing.
   2. Bereid een voorraadoplossing van basismedium en bufferoplossing in een geschikte concentratie van het werkvolume van de reactor gebruikte (dat wil zeggen, 2, 3 of 4 maal meer geconcentreerd dan gerapporteerd in stap 2,4), zodat wanneer het wordt verdund, is de concentratie die door Guerrero-Barajas et al. (2014)^12).
      Opmerking: De voorraadoplossing van het basismedium is altijd noodzakelijk, echter de bufferoplossing alleen nodig bij het opstarten. Het is niet nodig om bufferoplossing toevoegen nadat deze tijd.
   3. Bereid een voorraadoplossing van vluchtige vetzuren: acetaat, propionaat en butyraat in een 2,5: 1: 1 verhouding COD. Rekening te houden bij de berekening van de natriumacetaat opgenomen in de basale medium. De uiteindelijke CZV-concentratie in de reactor moet 2,7 g / l zijn.
      Let op: Maak deze oplossing in een zuurkast. Draag nitril handschoenen en een bril voor het opstellen van deze oplossing. Rekening houden met de stoichiometrie van de reactie van sulfaat met de vluchtige vetzuren die wordt getoond in figuur 3.
   4. Bereid een voorraadoplossing van natriumsulfaat (Na ₂ SO ₄₎ in een geschikte concentratie te leveren aan de reactor een uiteindelijke concentratie van 4000 mg / l van het sulfaation (SO ₄ ^2-). Als alternatief omvatten the hoeveelheid sulfaat vereist het basismedium in plaats van toe te voegen uit een voorraadoplossing zolang de uiteindelijke sulfaat (SO ₄ ^2-) concentratie gelijk.
5. Plaats de afzettingen in de reactor gemengd met een gedeelte van het basismedium ervoor zorgen dat ze de bodem van de reactor te bereiken.
   1. Doe de rest van het basismedium en bufferoplossing gemengd met het vluchtige vetzuren oplossing en de sulfaatoplossing. Zorg ervoor dat de oplossing van vluchtige vetzuren in de vloeistof wordt gegoten. Let op: Voer deze stap in een zuurkast.
   2. Stel de aansluitingen en leidingen van de reactor naar de recirculatiepomp. Stel de recycling debiet 60 ml / min. Stel de bioreactor in de temperatuurkamer op 34 ° C. Controleer regelmatig of de temperatuurverschillen klein zijn (dat wil zeggen, 34 ± 1,7 ° C)
   3. Stel de aansluitingen op de kolom gasverplaatsing.
      Let op: Zie figuur 4 voor de stappen 2,1-2,5.

   
   Figuur 3. Stoichiometrie van sulfaat reductie met VFA (acetaat, propionaat en butyraat). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

   
   Figuur 4. UASB-reactor. (A) Eerste tijd. (B) Continue regime na 300 dagen van de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

   3. De werking van de reactor te bevorderen Sulfidogenesis en de groei van de micro-organismen

   Opmerking: Laat de entstof van de v verbruikenolatile vetzuren en sulfaat. Hiertoe wacht één week uitvoeren van de eerste analyse van sulfaat, sulfide en COD consumptie.

   1. Na één week incubatie een monster van 5-7 ml van de vloeistof analyse uit te voeren voor CZV, sulfaat en sulfide inhoud en pH volgens standaard werkwijzen ^{11, 13.}
      1. Analyseer sulfide in de vloeistof spectrofotometrisch (bij een golflengte (λ) van 670 nm) door de methyleenblauw methode ^13.
         1. Plaats 5 ml van een zinkacetaatoplossing (2% w / w) in een 25 ml volumetrische kolf en voeg snel 200 ul van het monster op de zinkacetaat-oplossing.
         2. Voeg 2,5 ml van een N, N-dimethyl-p-fenyleendiamine-oxalaat (DMP) oplossing (0,2% w / w in 20% H ₂ SO ₄₎ en 125 gl van de ijzer (III) ammoniumsulfaat-oplossing (10% w / w in 2% H ₂ SO ₄₎ en compleet met gedestilleerd water van 25 ml in de maatkolf. Wacht 30 min voor de reactieoptreden, tijdstip waarop de blauwe kleur wordt gestabiliseerd. ^13.
            Opmerking: Wacht ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 60 minuten om de monsters te testen in de spectrofotometer. Het gedrag van de lezing van de blauwe definitieve oplossing in de spectrofotometer.
      2. Analyseer sulfaat volgens standaardmethoden ^11. Hier kwantificeren sulfaat bariumsulfaat met behulp van een turbidimetrische methode.
         1. Plaats 5 ml van een conditionering oplossing (zoutzuur HCl 1: 1) in een maatkolf van 25 ml, voeg 1 ml van de eerder gecentrifugeerd monster (bij 11.320 x g), voltooi de 25 ml van de maatkolf met gedestilleerd water en Voeg 1 g bariumchloride.
         2. Meng de oplossing gedurende 1 min in een vortex. Wacht 4 min voor de barium sulfaat te vormen en te lezen het monster in de spectrofotometer bij een golflengte (λ) van 420 nm ^11.
      3. Analyseer COD volgens standaardmethoden ^11. U kunt ook gebruik maken van een COD Determinatie kit.
         1. Voorafgaand aan de COD-bepaling, centrifuge het monster grondig (bij 11.320 xg) om de resterende sulfide die kunnen ingrijpen in de bepaling te verwijderen. Indien nodig, centrifuge twee keer: de eerste keer direct na het nemen van het monster en de tweede tijd wachten 6 of 8 uur en dan is de COD-analyse uit te voeren.
         2. Voeg 2 ml van het monster aan een reactie flacon van de COD bepaling kit, sluit de flacon en homogeniseren van het mengsel door voorzichtig schudden. Bereid een blanco door toevoeging van 2 ml gedestilleerd water tot een reactievat en het mengsel gehomogeniseerd.
         3. Plaats de injectieflacons in de digestie reactor bij 150 ° C gedurende 2 uur. Verwijder de flesjes en laat ze in het donker te koelen. Neem de aflezingen van de injectieflacons in de spectrofotometer bij een golflengte van 620 nm.
      4. Het verkrijgen van het volume gas uit de kolom gas verplaatsing.
   2. Wacht tot een 5 tot 7 dagen tot het sulfaat wordt verbruikt. Sulfaat en COD moet een worden geconsumeerdpproximately 85% tot 90% voordat een nieuwe fed-batch wordt gestart.
   3. Zodra sulfaat (en COD) worden verbruikt, volledig Herhaal stap 2.4. Leveren vers medium en nieuwe voedingsmiddelen voor elke partij.
   4. Herhaal de stappen 3.1 en 3.2. Op dit moment moet elke partij duren tussen de 7 en 10 dagen.
   5. Wanneer 3 tot 4 batches zijn voltooid, herhaal stap 2.4, maar verhogen de CZV concentratie 4 g / l.
   6. Herhaal stap 3.1 en stap 3.2.
      1. Herhaal stap 3,3, maar verhoging van de CZV-concentratie tot 6 g / l.
      2. Herhaal 3.6 en 3.6.1 geleidelijk toenemende concentratie COD totdat deze 10 g / l.
         Let op: Maak de grafiek dat de sulfaat concentratie (mg / l) versus tijd (d) presenteert.
   7. Wanneer sulfaat verbruik dan 80% in minder dan 24 uur en dit gebeurt meer dan één week, schakelt de werking van de reactor voor continue modus. Voor de continue modus zet de hydraulische retentietijd (HRT) bij 24 uur en de sulfaat concentratie 4 g / l en de COD te behoudenbij 10 g / l.
      Let op: Na verloop van tijd de sulfaat verbruik moet worden sneller.

   4. sulfaat reducerende activiteit Test

   1. Voorafgaand aan deze test te zorgen dat de bioreactor onder continue regeling weer minder dan 10% variatie in de concentratie overgebleven sulfaat.
   2. Op een bepaalde dag, stop de reactor na één HRT cyclus en gedrag stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
   3. Zodra de bioreactor wordt toegevoerd, nemen 5-7 ml monsters van de vloeistof en analyses uitvoeren voor CZV, sulfaat, sulfide (stap 3,1) en pH ieder uur. Noteer het gasvolume geproduceerd.
   4. Bereken de sulfaat reducerende activiteit volgens de literatuur ^14.
      
      

   SRA = sulfaat reducerende activiteit (mg COD-H ₂ S) / gVSS * d

   m H ₂ S = sulfide concentratie uitgedrukt in mg CZV-H ₂ S

   VSS = vluchtige zwevende stoffen concentratie

   t = tijd (d of hr)

   5. Maak de bijbehorende grafieken die het percentage sulfaat consumptie versus sulfide concentratie in de tijd weergeven in mg / l. Maak de grafieken die percentage van COD verbruik over tijd. Maak de grafieken die pH-variatie in de tijd te laten zien.

   5. Trichloorethyleen (TCE) Reduction Test

   1. Voorafgaand aan deze test te zorgen dat de bioreactor werkt onder continue regeling en bevat minder dan 10% variatie in de concentratie overgebleven sulfaat. Deze test niet starten als sulfaatreductie in de bioreactor kleiner is dan 90%.
   2. Bereid een voorraadoplossing van trichloorethyleen (TCE) met dien verstande dat de uiteindelijke concentratie van deze verbinding in de vloeistoffase van de bioreactor moet 300 uM. Denk aan de partitioning van de verbinding aan de gasruimte met de Henry's Law dimensieloze constante (H') voor TCE bij 34 ° C. H'at 34 ° C voor TCE is 0,4722.
      
      Let op: Bereid deze oplossing in een zuurkast en draag handschoenen en een veiligheidsbril.
      1. Bijvoorbeeld, een 5000 pM voorraadoplossing wordt er als volgt:
         
         TCE gasfaseconcentratie = (0,4722) * (5000) = 2139 uM. Omvat deze concentratie bij de bereiding van de voorraadoplossing aangezien hoeveelheid TCE zal in de kopruimte.
         Dan in de vloeistof (water) van de voorraadoplossing zal de feitelijke concentratie TCE: 5000 + 2139 = 7139 uM. TCE dichtheid = 1,43 g / ml. Zet de uM tot 7139 mg en met de dichtheid van TCE berekent de hoeveelheid TCE van de voorraadoplossing.
         Opmerking: De concentratie van de voorraadoplossing m TCEay lager dan 5000 uM, bijvoorbeeld, 3000 of 1000 uM, dit hangt af van hoeveel volume van deze oplossing kan worden geleverd aan de bioreactor volgens de vloeistoffase volume.
   3. Bereid standaard curves in de gaschromatograaf voor TCE, cis-1,2-dichloorethyleen, trans-1,2-dichloorethyleen, vinylchloride en etheen. Bereid de cis-1,2-dichloorethyleen en trans-1,2-dichloorethyleen standaard curves uit een voorraadoplossing van deze verbindingen volgens dezelfde in 5,2 beschreven voor de TCE voorraadoplossing procedure. Bereid de standaard curves van vinylchloride en etheen door verdunning van de concentratie van elk gas uit de normen (gasflessen).
      1. Bereid de standaard curves van deze verbindingen in een bereik van 20 tot 300 uM. Gebruik de methode gerapporteerd door Guerrero-Barajas et al. (2011) ¹⁵ voor de analyse van deze verbindingen in de gaschromatograaf.
         Let op: Bereid deze standard oplossingen in een zuurkast en draag handschoenen en een veiligheidsbril.
   4. Op een bepaalde dag, stop de reactor na één HRT cyclus en gedrag stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
   5. Zodra de bioreactor wordt toegevoerd, voeg de TCE rechtstreeks aan de vloeistof in de bioreactor van de voorraadoplossing bereid in 5,2 dient de uiteindelijke TCE-concentratie in de vloeistoffase van de bioreactor is 300 uM. Stel de HRT tot 12 uur.
      1. Aan het einde van een HST-cyclus nemen monsters van de vloeistof (500 tot 1.000 III) en het gedrag analyse voor CZV, sulfaat en sulfide (stappen 3.1.1, 3.1.2 en 3.1.3). Neem monsters van de kopruimte (100 om 250 pl) en analyse verricht voor TCE, cis-1,2-dichloorethyleen, trans-1,2-dichloorethyleen, vinylchloride en etheen in de gaschromatograaf.
   6. Herhaal stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
   7. Gebruik geen TCE reductie-test niet herhalen totdat de bioreactor presenteert meer dan 90% sulfaat en 10% minder variatie in zowel sulfaatreductie sulfaat en nog in de bioreactor.
   8. Herhaal 5.4, 5.5 en 5.6 twee of drie keer meer.
   9. Neem sedimentstalen (0,5 g) om identificatie van de micro-organismen voeren net na een TCE van doorstroom is voltooid. Doe dit na 2 of 3 TCE reductie testen.

   6. sulfaat reducerende activiteit Test na TCE Reduction Experiment

   1. Herhaal stap 4 volledig.

   7. Identificatie van Micro-organismen

   1. Monsters te nemen van slib van ongeveer 0,5 g per stuk en voeren totale RNA-extractie volgens de standaard methode ^12.
   2. Amplify het 16S rRNA-gen met reverse transcriptie en leidt de polymerasekettingreactie (RT-PCR) amplificatie een stap ^12.
   3. Het ontwerp van de primers te versterken of te gebruiken als een eerste benadering van de degenen die in de literatuur gesuggereerd ^11. Volg de versterker;icatie procedure voorgesteld in de literatuur ^12.
   4. Construct het 16S rRNA bibliotheken. PCR amplicons kunnen worden gekloneerd door een klonering-kit ^11. Meestal kan 10 kolonies van elke plaat (elke kolonie die een PCR-product) worden gekloneerd. Bereid het plasmide DNA voor sequentiebepaling volgens de werkwijze voorgesteld in de literatuur ^12.
   5. Het gedrag van de sequencing van fragmenten. Opnieuw amplificeren ongeveer 1400 bp van de PCR-producten met de externe protocol voor PCR-amplificatie eerder beschreven (stap 7,4) en kloon volgens de werkwijze voorgesteld in de literatuur ^12. Isoleer het recombinante plasmide uit E. coli kolonies zoals voorgesteld in de literatuur ^12. Geleiden de partiële procedure voor sequentiebepaling met M13 universele primers ^12.
   6. Het gedrag van de sequenties analyse. Lijn de nucleotide sequenties met behulp van de Clustal X en handmatig aan te passen in de teksteditor. Het uitvoeren van BLAST zoekopdrachten van de NCBI database. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) ^12.
   7. Het verkrijgen van de nucleotidesequentie toetreding nummers. Deponeer de nucleotide sequenties van de klonen die in de EMBL nucleotidesequentie-database (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) in de overeenkomstige toegangsnummers (dwz JQ713915eJQ713925 voor sequenties van amplicons) ^12.

Resultaten

Een typische gedrag van de sulfaatreductie in de bioreactor wordt getoond in figuur 5. Het is belangrijk op te merken dat tijdens de eerste weken bedrijf sulfaatreductie verloopt traag. Echter langzaam het verbruik van meer dan 90% van sulfaat in de tijd geeft aan dat de entstof ontwikkelt een microbiële gemeenschap kan reduceren sulfaat en bijgevolg verrijkt sulfaat reducerende bacteriën. De verschillende periodes in de figuur geeft aan dat sulfaat werd het verhogen van de rente in de tijd. Aan het beg...

Discussie

Er zijn verschillende toepassingen van sulfidogenesis in milieubiotechnologie, een van de meest gebruikte toepassingen van het metabolisme van sulfaat reducerende bacteriën in consortia fermenterende bacteriën in afvalwaterzuivering. UASB reactoren behoren tot de belangrijkste gemanipuleerde benaderingen van industrieel afvalwater met hoge concentraties sulfaat. In dit werk, presenteren we een protocol om sulfidogenic slib uit mariene sedimenten te verkrijgen in een UASB-reactor. De kritische stappen in het protocol een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
trichloroethyleen	sigma Aldrich	251402
cis-1,2-dichlooretyleen	sigma Aldrich
trans-1,2-dichlooretyleen	sigma Aldrich	D-62209
vinyl chloride scotty standard	supelco		1.000 ppm v/v in stikstof
etheen scotty standard	supelco		99% zuiverheid
pomp	Masterflex		Model 7553-75
spectrofotometer	elke
microcentrifuge	elke
gasdichte spuiten	elke		100 en 200 microliters
UASB glazen reactor	elke		in ontwerp
gaschromatograaf	elke		FID-detector
capillaire kolom SPB-624	supelco
pH-meter	elke
Viton-slangen	Masterflex
basal medium reagentia	elke
spoormetalen reagentia	elke
vitaminenoplossing reagentia	elke
natriumsulfaat	elke
vluchtige vetzuren	elke
COD-bepalingskit	HACH		bereik 0-15.000 mg/L
TOPO-TA-kloneringskist pCR®4.0	Invitrogen, VS
S.N.A.P. TM Miniprep-kit	Invitrogen, UK
Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit	Invitrogen