Productie van Nurr-1 Specifieke polyklonale antilichamen Vrij van Cross-reactiviteit tegen zijn naaste Homologen, Nor1 en Nur77

Samenvatting

Hier targeten we selectief antilichamen tegen een specifiek lid van een sterk geconserveerde familie van eiwitten door dieren te immuniseren met hun meest uiteenlopende regio's, gevolgd door het verwijderen van kruisreactieve antilichamen door middel van pre-adsorptie.

Samenvatting

De nucleaire receptor subfamilie 4 (NR4A) bestaat uit 3 gerelateerde eiwitten die een DNA-bindend domein (DBD) en een ligand-bindend domein (LBD) delen. Het nucleair receptorgerelateerd 1-eiwit (Nurr1 of NR4A2) speelt een sleutelrol bij het onderhoud van het dopaminerge systeem. Dopamine-disfuncties geassocieerd met het Nurr1-gen omvatten onder meer de ziekte van Parkinson, schizofrenie en manisch-depressieve stoornis. Bovendien geeft recent bewijs aan dat Nurr1 ook in andere hersengebieden zoals de hippocampus wordt tot expressie gebracht en een cruciale rol speelt voor leren en geheugen. De andere leden van de familie zijn nerve growth factor IB (Nur77 of NR4A1) en neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 of NR4A3). Om de precieze functionele rollen van Nurr1 in dopaminerge en andere hersengebiedgerelateerde neuronale disfuncties te onderzoeken, waren antilichamen nodig die geen kruisreactiviteit vertonen tegen Nur77 en NOR1. Aangezien de eiwitten meer divergent zijn in hun LBD's dan in hun DNA-bindende domeinen, zou immunisatie met gezuiverde LBD's antilichamen opleveren die specifiek zijn voor Nurr1 met minimale reactiviteit tegen Nur77 en/of NOR1. Hoewel anti-Nurr1-antilichamen met succes werden gegenereerd, vertoonden deze significante immunoreactiviteit tegen de andere leden van de familie. Affiniteitschromatografie over geïmmobiliseerd Protein A gevolgd door pre-adsorptie tegen geïmmobiliseerde Nur77 en NOR1 LBD's leverde Nurr1-specifieke antilichamen op die vrij waren van kruisreactiviteit. Hier richten we ons selectief op antilichamen tegen een specifiek lid van een sterk geconserveerde familie van eiwitten door dieren te immuniseren met hun meest divergente regio's, gevolgd door het verwijderen van kruisreactieve antilichamen door pre-adsorptie. Het doel van het protocol is om de specificiteit van polyklonale antilichamen te verhogen door pre-adsorptie tegen kruisreactieve antigenen.

Inleiding

De transcriptiefactor Nurr1 en homologen (Nur77 en Nor1) behoren tot de nucleaire receptor subfamilie 4A (NR4A) ^1. Ze zijn ook weesreceptoren omdat hun endogene liganden nog niet zijn geïdentificeerd. Nurr1 werd eerst gekloneerd in 1992 en hoewel bekend is tot expressie in de hersenen ^2, werd de essentiële rol voor de ontwikkeling en instandhouding van middenhersenen dopamineneuronen blijkt uit knockout muizen studies ^3. Daarnaast werd de belangrijke rol voor het behoud van middenhersenen dopamineneuronen onlangs aangetoond door een conditionele knockout studie ^4. Door deze elegante studies tonen Nurr1 kritische rol voor middenhersenen dopamine neuronen, zijn vele verdere studies grotendeels gericht op het dopaminesysteem neuronen en dopamine-gerelateerde neurodegeneratieve stoornis, ziekte van Parkinson (PD) ^5.

Met name Nurr1 zich niet alleen in de middenhersenen dopamine (MDA) neuronen, maar ook in divers hersengebieden ^2, suggereert dat het functionele rol in veel niet-DA gebieden die sterk wordt ondersteund door recente studies aantonen dat Nurr1 speelt een belangrijke rol in diverse hersenfuncties kan hebben. Voor voorbeelden werd aangetoond dat geheugen inducerende activiteiten zoals leren of andere hippocampus-afhankelijke taken resulteert in opwaartse regulatie van Nurr1 expressie in de hippocampus ^6,7. Bovendien neerhalen van Nurr1 expressie in de hippocampus was de houdbaarheid op lange termijn geheugen en / of synaptische plasticiteit ^8-11 aantasten, wat sterk suggereert dat Nurr1 speelt diverse rollen in verschillende hersengebieden. Dus, met als doel de celtype-specifieke en subcellulaire expressie van Nurr1, is het wenselijk Nurr1-specifieke antilichamen die geen kruis-reactiviteit vertonen met homologen Nur77 of Nor1 gebruiken. Dit artikel beschrijft een pre-adsorptie protocol om Nurr1-specifieke antilichamen en presenteren aanvullende gegevens toont zijn specificiteit te genereren.

Protocol

Opmerking: De samenstelling van alle hieronder genoemde oplossingen kunnen worden gevonden in de Materials / Equipment Table.

1. Proteïne A kolom antilichaamzuivering

1. Equilibreer een proteïne A-kolom spin en alle benodigde buffers tot kamertemperatuur gedurende 15 min voor het begin van de procedure.
2. Verdun het immune serum 1: 1 met Protein A IgG Binding Buffer. (5 ml serum wordt aanbevolen).
3. Tik voorzichtig een proteïne een spin-kolom op de bank boven naar elke hars die in de dop kan worden ingediend verjagen. Verwijder de dop en voorzichtig snap de bodem sluiting. Plaats de kolom in een 15 ml collectie buis en laat opslagoplossing uitlekken.
4. Voeg 5 ml Proteïne A IgG bindingsbuffer en laat de oplossing uitlekken.
5. Breng het verdunde immune serum op de kolom en verzamel de doorstroom. Voor het beste resultaat, voeg een monstervolume dat een concentratie van antilichamen bevat minder dan 80% van de antilichaambinding capacit de kolomy.
6. Was de kolom met 15 ml Proteïne A of IgG bindingsbuffer totdat de absorptie bij 280 nm lager is dan 0,1.
7. Voeg 100 pl neutralisatiebuffer vijf gemerkte verzamelbuizen.
8. Voeg 5 ml IgG Elution Buffer aan de Proteïne A-kolom en het verzamelen van 1 ml fracties in elk van de buizen met de 100 ui Neutralisatie Buffer.
9. Meet de absorptie van elke fractie bij 280 nm en een zwembad fracties met een absorptie van meer dan 0,5. Houd de samengevoegde fracties op ijs pas klaar voor dialyse.
10. Regeneratie van de kolom door toevoeging van 8 ml IgG Elution Buffer en laat de oplossing door de kolom.
11. Spoel de kolom met Proteïne A IgG bindoplossing tot eluens pH weer 7,4.
12. Sla de kolom door toevoeging van 5 ml opslagoplossing (0,02% natriumazide in PBS). Bij benadering 3 ml blijven de kolom cap bodem en zet het bovendeksel. Bewaar de kolom bij 4 ° C.
13. Bepaal de lengte of dialyseslang naar behoefte volgens de instructies van de fabrikant. Met behulp van 16 mm diameter platte buis gebruiken 5.47 cm van de buis lengte per ml oplossing worden gedialyseerd. Snij de buis en spoelen met PBS pH 7,4 gedurende 15 tot 30 min.
14. Vouwen en clip ene uiteinde van de dialyse tubing, breng de samengevoegde IgG-bevattende fracties dialyseslang geëquilibreerd in PBS pH 7,4 en sluit het andere uiteinde.
15. Dialyseer bij kamertemperatuur tegen 200 volumina PBS pH 7,4 gedurende 2 uur.
16. Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyze nog eens 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
17. Wijzig de dialyse buffer (vers PBS pH 7,4) en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C.
18. Houd de gedialyseerde antilichaam oplossing bij 4 ° C tot klaar om de vereiste zuiveringsstappen.
19. Beoordeel de antilichaamconcentratie met behulp van de absorptie bij 280 nm en de molaire absorptiecoëfficiënt van antilichamen bij 280 nm van 210.000 M ^-1 cm ^{-1 12.}

2. Koppeling van LBD eiwitten AminoLink Coupling Resin

1. Bereid twee kolommen, een voor Nor1 en de andere voor Nur77. Volg hetzelfde protocol voor beide eiwitten.
2. Ontdooi de eiwitten te koppelen aan de hars op ijs. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt en de absorptie ervan bij 280 nm ^12.
   1. Alternatief, gebruik dan een eiwitbepaling assay zoals de bicinchoninezuur assay ^13. Wanneer het eiwit wordt opgelost in een amine bevattende buffer dialyseren of bufferuitwisseling tegen de koppelingsbuffer. Wanneer het eiwit in een geschikte buffer (geen vrije amines) verdunnen 4-voudig in koppelingsbuffer.
3. Gebruik 2 ml hars gedurende 2 mg eiwit. Alle stappen die volgen zijn voor 2 ml hars in een kolom 10 ml. Maximaal 10 mg eiwit worden gekoppeld per 1 ml hars (2 ml 1: 1 suspensie).
4. Bereid een 10 ml kolom door op een frit op de bodem en actief PBS pH 7,4 doorheen. Cap tHij bodem van de kolom en voeg 2 ml koppelingsbuffer.
5. Het gewenste volume van slurry (4 ml tot 2 ml hars) te verkrijgen aan de kolom, de onderste dop en laat de kolom drain. Spoel de kolom met in totaal 6 ml (3 hars-bedvolume) van koppelingsbuffer en laat de kolom uitlekken. Na de koppeling buffer is uitgelekt, vervangt de onderste dop.
6. Voeg 2-4 ml eiwit gesuspendeerd in koppelingsbuffer aan de kolom (houd een aliquot van de eiwitoplossing om de koppeling efficiëntie te evalueren door vergelijking van de eiwitconcentratie van het eluaat in stap 2,11 met behulp van de absorptie bij 280 nm of bicinchoninic assay) . Cap en meng uiteinde over uiteinde om een ​​homogene oplossing te hebben.
7. Weeg een lege 1,8 ml microcentrifugebuis en te verplaatsen naar de zuurkast. Overdracht _NaCNBH3 (ongeveer 0,05 g) voorzichtig in de vooraf gewogen buizen. Sluit de buis en wegen van de buis met _NaCNBH3. Laat de buis niet openen buiten de motorkap.
8. Gebaseerd op het gewicht van_NaCNBH3 overgebracht naar de buis maakt een 5 M door toevoeging van 1 M NaOH. Het molecuulgewicht van _NaCNBH3 is derhalve 62,84 g 0,05 g gelijk is aan (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 ^-4 mol) 7,96 x 10 ^-4 mol. Om een 5 M oplossing add (7,96 x 10 ^-4/5) 159 pi van 1 M NaOH te maken.
9. Meet het totale volume van de reactie van het nemen van de hars volume in aanmerking. Voeg 10 pl van 5 M _NaCNBH3 per ml reactiemengsel.
   1. Bijvoorbeeld: voor een 4 ml reactievolume voeg 40 ul 5 M _NaCNBH3. Voor 1 ml hars en 3 ml eiwit toegevoegd, het totale volume 4 ml.
10. Cap de kolom en meng uiteinde over einde. Bevestig de kolom op een buis rotator en laat de reactie doorgaan gedurende de nacht bij 4 ° C.
11. In de ochtend, brengen de kolom aan de chemische motorkap en verwijder voorzichtig de dop zoals sommige gas kan hebben gevormd. Giet de kolom in een schone buis en sla het eluaat om het eiwit con metencentrering met de absorptie bij 280 nm werkwijze ¹² of bicinchoninezuur assay en vergelijken met het uitgangsmateriaal eiwitconcentratie in stap 2.6.
12. Was de hars met 4 ml koppelingsbuffer en laat de kolom drain.

3. Blokkering Resterende Sites

1. Was de hars met 4 ml buffer van quenching. Giet af en vervang de onderste dop. Voeg 2 ml buffer doven en de hars te schorten.
2. Het totale reactievolume beoordelen door het meten van het volume hars en het doven buffervolume voeg 10 pl van 5 M _NaCNBH3 per ml reactievolume.
3. Meng voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 30 min end-over-end. Na 30 min, brengt de kolom in de zuurkast. Verwijder voorzichtig de bovenkant en verwijder de onderste dop en laat de kolom drain in een verspilling buis.
4. Was de kolom met 5 hars volumes wasoplossing. Controleer de wast de aanwezigheid van residuele eiwitten door meting abso het eluaat vanrbance bij 280 nm. Ontkoppelde eiwitten uit zijn gewassen door de hoge zoutconcentratie.
5. Was de hars met 6 ml ontgast PBS pH 7,4 dat 0,02% natriumazide. Houd de kolom bij 4 ° C totdat het nodig is.

4. Zuivering van specifieke antilichamen Nurr1

1. Spoel de Nur77 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de uitgelekte Nur77 LBD gekoppelde kolom in een nieuwe 15 ml verzamelbuis.
2. Voeg 5 ml proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door. Gereserveerd op ijs tot klaar om toe te voegen aan de Nor1 LBD gekoppeld kolom.
3. Spoel de Nor1 LBD combinatie kolom met 10 ml PBS pH 7,4 en laat de kolom drain. Cap de bodem van de kolom en plaats de Nor1 LBD gekoppelde kolom in een 15 ml verzamelbuis.
4. Voeg de doorstroming van het Nur77 LBD coupLED kolom cap de kolom en plaats op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de bovenste en onderste kappen en laat de stroom door.
5. Meet de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm.

5. ELISA-gebaseerde analyse van gezuiverde anti-Nurr1 Antibody

1. Voeg 100 ul proteïne (2,5 ug / ml) aan de putjes van een 96 putjesplaat. Bij testen 3 verschillende eiwitten, voeg 100 pl proteïne 1 aan putjes A1 H4, 100 pl proteïne 2, putjes A5 H8 en 100 pl proteïne 3 aan putjes A9 tot H12. Bedek de plaat en incubeer overnacht bij 4 ° C.
2. Was de beklede putjes tweemaal met 300 ul per putje van PBS pH 7,4 en voeg 300 ul van ELISA blokkeerbuffer het gehele antigeen beklede putjes en incubeer 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
3. Terwijl de plaat blokkeert stelt een gewenste startpositie verdunning van gezuiverd anti-Nurr1 antilichaam (van 10 tot 100 ug / ml) in ELISA blokkerende buffer.
4. Na 2 h blokkering vervangen ELISA blok buffer met 100 pl vers ELISA blokbuffer aan alle putjes.
5. Voeg 100 gl verdunde gezuiverde anti-Nurr1 antilichaam aan alle putjes in rij A. In serie verdunde antilichamen door overdracht 100 pi oplossing van rij A in de putjes in rij B, gevolgd door overdracht 100 pi oplossing van rij tot rij B C voortzetting naar G. rij na het mengen van de oplossingen in de putten in rij G gooi de extra 100 ul. Wells in rij H ontvangt alleen de eerste 100 ul van het blokkeren van buffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
6. Was de plaat drie (3) maal met 300 ui per putje van 0,05% Tween 20 in PBS pH 7,4 en dep de plaat om overmaat wasbuffer te verwijderen.
7. Voeg 100 ul van Horse Radish Peroxidase (HRP) geconjugeerd geit anti-konijn IgG verdund in ELISA blok buffer (1: 8000 verdunning; typische bereik is van 1: 5000 tot 1: 25.000). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
8. Was de plaat three (3) keer zoals beschreven in 5.6. Spoel alle wells door ze te vullen met 300 pl gedeïoniseerd water. Dep het overtollige water door het omkeren van de plaat op absorberend papier.
9. Voeg 100 ul van 3, 3 ', 5, 5' tetramethylbenzidine (verwarmd tot kamertemperatuur) aan alle putjes en incubeer 15-30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
10. Stop de reactie door toevoeging van 50 ui 2 NH ₂ SO _4.
11. Lees absorptie bij 450 nm af te trekken achtergrond bij 650 nm.

Resultaten

Een vergelijking van proteïne A-kolom gezuiverd Nurr1-specifieke antilichamen met proteïne A gezuiverde anti-Nurr1 antilichamen, gevolgd door het door Nur77 LBD en Nor1 LBD kolommen in figuur 1. Zoals blijkt, proteïne-A gezuiverde Nurr1 antilichaam vertoonde een sterke binding om Nurr1 LBD. Toch bleek ook significante binding aan Nur77 LBD en Nor1 LBD. Als eiwit-A gezuiverde Nurr1 antilichamen werden verder gezuiverd met Nur77 LBD en Nor1 LBD, de uiteindelijke affiniteit gezuiverde antilichamen die Nurr...

Discussie

Het succes van dit protocol is gebaseerd op de beschikbaarheid van zuivere eiwitten voor karakterisering van de antilichamen opgewekt tegen een specifiek lid van de eiwitfamilie plaats. Er is geen noodzaak om de antilichamen onder gebruikmaking van proteïne A / G totdat duidelijk is vastgesteld dat er significante kruisreactiviteit met ELISA en Western blotting zuiveren.

Zoals in de tekst, is het belangrijk om te voorkomen suspenderen het eiwit (en) worden verknoopt aan de kolom in een amine...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gezuiverde ligand-binding domein van Nurr1, Nor 1 en Nur77			Colomm Opslagoplossing
AminoLink koppelingshars en kit	Thermo Scientific	44890
Protein A spinkolom	Thermo Scientific	89978
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-031-CV
96-wels platen met platte bodem, hoge rand, 330 μl	Thermo Scientific	3455
10% Normaal Geitenserum	KPL	50-675-69
Melk Diluent/ Blokkeer Concentraat	KPL	50-82-01
IgG Elutie Buffer	Thermo Scientific	21004
Micro BCA Eiwit Assay Kit	Thermo Scientific	23235
Paarden Radish Peroxidase geconjugeerd Geiten anti-Konijn IgG (H+L)	Thermo Scientific	31460
Ni-NTA Hars	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Protein A IgG Binding Buffer	Thermo Scientific	21001
IgG Elutie Buffer	Thermo Scientific	21004
Colomm Opslagoplossing			Fosfaat Buffered Saline met 0,02% natriumazid
Spectra/Por 7 voorbehandelde dialysebuizen	Spectrum Labs	132128
10 ml Wegwerp kolommen	Thermo Scientific	29924
AminoLink koppelingsbuffer			0,1M natriumfosfaat, 0,05% NaN3, pH 7,0
Dempingsbuffer			1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4
Wasoplossing			1M NaCl, 0,05% NaN3
ELISA Blokkeer buffer			1% Normaal Paardenserum (NHS), 1% Normaal Geitenserum (NGS) in 1X KPL melkdiluent
Opslagoplossing			PBS pH 7,4 met 0,02% natriumazid
Micropipetten: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl