Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52969

⸱

6 oktober 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

In dit artikel

Samenvatting

Menselijk dubbele infectie is moeilijk te repliceren in vitro. Echter, menselijke malariaparasieten kunnen gemakkelijk worden gekweekt in vitro, net als vers geïsoleerde humane perifere bloedmononucleaire cellen die natuurlijk besmet zijn met HIV. Dit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van vroege immuunresponsen op malariaparasieten in de context van HIV-co-infectie.

Samenvatting

Malaria en HIV co-infectie is een groeiende gezondheidsprioriteit. Momenteel richt de meeste onderzoek naar malaria of HIV zich echter op elke infectie afzonderlijk. Hoewel het begrijpen van de ziektedynamica voor elk van deze pathogenen afzonderlijk vitaal is, is het ook belangrijk dat de interacties tussen deze pathogenen worden onderzocht en begrepen.

We hebben een veelzijdig in vitro model van HIV-malaria co-infectie ontwikkeld om gastheer immuunresponsen op malaria in de context van HIV-infectie te bestuderen. Ons model maakt het mogelijk om uitgescheiden factoren in cellulaire supernatanten, celoppervlak en intracellulaire eiwitmarkers, evenals RNA expressieniveaus te bestuderen. Het experimentele ontwerp en de gebruikte methoden beperken de variabiliteit en bevorderen de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van gegevens.

Alle in dit model gebruikte pathogenen zijn natuurlijke humane pathogenen (Plasmodium falciparum en HIV-1), en alle geïnfecteerde cellen zijn natuurlijk geïnfecteerd en vers gebruikt. We gebruiken menselijke erythrocyten geparasiteerd met P. falciparum en gehandhaafd in continue in vitro cultuur. We verkrijgen vers geïsoleerde perifere bloedmononucleaire cellen van chronisch HIV-geïnfecteerde vrijwilligers. Elke gebruikte conditie heeft een geschikte controle (P. falciparum geparasiteerd vs. normale erythrocyten), en elke HIV-geïnfecteerde donor heeft een niet-HIV-geïnfecteerde controle, waaruit cellen op dezelfde dag worden geoogst. Dit model biedt een realistische omgeving om de interacties tussen malariaparasieten en menselijke immuuncellen in de context van HIV-infectie te bestuderen.

Inleiding

Co-infectie, infectie met meerdere gelijktijdige infecties, is de norm in de natuurlijke omgeving. Co-infectie kan een grote impact hebben op de ziekte pathologie en op de klinische behandeling van iedere infectie. In de context van co-infectie, vaccins en werkzaamheid van het geneesmiddel, alsmede diagnostische tests kunnen negatief beïnvloed (besproken in 1). Ondanks het belang, de meeste pathogeen onderzoek beschouwt eenmalig infecties.

Malaria en HIV-1 (HIV) zijn belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Gebieden van malaria en HIV endemiciteit delen een brede geografische overlap, waardoor miljoenen mensen het risico lopen van co-infectie en dus een risico op meer ernstige klinische ziekte 2-10. De twee ziekten negatief interageren. Bij HIV-geïnfecteerde individuen, hogere HIV virale lading en tijdelijke dalingen in CD4 + T-cel aantallen te zien tijdens een malaria infectie, terwijlmalariaparasiet lasten en risico's van de klinische en ernstige malaria zijn hoger in co-geïnfecteerde individuen 2,3,5,7,8,10. De mechanismen die HIV verhoogt malaria ernst worden niet volledig begrepen en garandeert verder onderzoek.

Hier beschrijven we een werkwijze waarmee malaria en HIV-infectie kan worden bestudeerd in vitro. Specifiek, maakt deze werkwijze voor de behandeling van malaria-specifieke immuunresponsen in de context van HIV-infectie. Onze protocol beschrijft een veelzijdige co-kweeksysteem met vers geïsoleerde perifere mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit chronisch HIV geïnfecteerde donoren en in vitro gekweekte P. falciparum geparasiteerde erytrocyten (PfRBC). Het effect van HIV antiretrovirale therapie volgende reacties kunnen worden onderzocht met behulp prospectief PBMC uit HIV (+) donors en na de behandeling.

We hebben dit systeem gebruikt om de impact van HIV-infectie te onderzoekenmalaria-specifieke aangeboren immuunrespons 11,12 en konden vaststellen dat malaria-specifieke IFNy en TNF responsen geremd in NK-cellen, NKT-cellen, γδ T-cellen van HIV (+) donoren pre- en post-HIV antiretrovirale therapie . Bovendien, waren we in staat om dit systeem te gebruiken om te bepalen dat monocytische functies ook worden aangetast bij HIV (+) donoren, maar herstellen na HIV antiretrovirale therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol vereist de werving van donoren voor serum en RBC te worden gebruikt voor parasiet cultuur en HIV (+) en de niet-geïnfecteerde donoren PBMC isolatie. Institutional Review Boards moeten alle studies keuren en alle donoren moeten geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de bloedafname te bieden.

LET OP: Het werken met menselijke bloedmonsters en menselijke malariaparasieten nodig voorzorgsmaatregelen. Draag altijd een laboratoriumjas, handschoenen, en werken in een level 2 bioveiligheid kast. In het geval van accidentele percutane blootstelling aan de menselijke malaria, rapporteren aan gezondheid en veiligheid voor de profylactische behandeling. Extra veiligheid overweging moet ook worden ingevoerd voor het werken met HIV (+) bloed. Draag een back sluiten laboratoriumjas. Dubbele handschoen (top handschoen moet worden latex). Voer alle hanteren in een level 2 bioveiligheid kast. Gebruik geen glas of scherpe voorwerpen gebruiken. Gebruik geen afzuiger. Plaats alle vervuilde items in virox oplossing of bleekmiddel voor een minimum van 1 uur voorafgaand aan het weggooien.Was alle oppervlakken met virox en UV 1 uur na gebruik. Merk op dat elke instelling een eigen specifieke bioveiligheid voorschriften die moeten worden gevolgd zal hebben. Meld alle accidentele blootstelling aan HIV-besmet bloed naar gezondheid en veiligheid voor de evaluatie en behandeling van eventuele post-exposure profylaxe.

Opmerking: Verschillende stammen van P. falciparum malariaparasieten bestaan. ITG werd gebruikt voor deze experimenten, maar andere stammen kunnen worden gebruikt. Uitstekende aanwijzingen voor het invriezen en ontdooien Plasmodium falciparum parasieten zijn beschikbaar op de website MR4 13.

1. Het maken van RPMI-A voor malariaparasiet Cultuur

  1. Voeg RPMI-0 door het mengen van 950 ml van DDH 2 O, 1 pakje RPMI-1640 poeder, 6 g HEPES, 2 g natriumbicarbonaat en 1,35 mg hypoxanthine.
  2. Dooi hitte geïnactiveerd humaan serum uit twee verschillende donoren. AB donoren best maar elk kan worden gebruikt als parasieten worden gekweekt in O-typerode bloedcellen (RBC). Omkeren buizen te mengen. Als serum bevat deeltjes of dik centrifugeren op 2000 tpm en vervolgens filteren vloeibare deel met behulp van een 0,45 pm filter.
  3. Met een 0,2 urn filtereenheid filter 180 ml RPMI-0, 20 ml humaan serum (10 ml van elke donor) en 0,5 ml van 10 mg / ml gentamycine.
    Opmerking: menselijke serum kan het filter verstoppen zodat in een filtereenheid kan nodig.
  4. Label het medium fles met RPMI-A, de datum, en de bron van het serum. Koelkast totdat vereist. RPMI-A kan blijken troebel is gekoeld. Dit is normaal, maar toenemende bewolking is een teken van besmetting.
    Opmerking: Parasite groei kan variëren in verschillende donor serum. Het is een goed idee om alle menselijke serum batches voor een goede parasiet groei te testen alvorens het te gebruiken.

2. Voorbereiden Human Red Blood Cells voor Parasite Cultuur

Opmerking: Blood donoren moeten soort O.

  1. Verzamel 7-10 ml bloed in zuur-citrate-dextrose (ACD) buizen. Schrijf ID en de datum van de winning op het etiket van de donor.
  2. Store bloed bij 4 ° C totdat het nodig is. Gebruik bloed voor parasiet culturen binnen 1 maand.
  3. Veeg de bovenkant van de buis met 70% ethanol. Verwijder voorzichtig stop en gooi. Transfer bloed in een buis van 15 ml. Spin gedurende 3 min bij 1000 x g. Verwijder plasma door aspiratie.
  4. Schorten RBC met een gelijk volume van warme RPMI-0. Spin gedurende 5 min bij 1000 x g. Verwijder de buffy coat door aspiratie, hersuspenderen in 5 ml RPMI-0 en herhaal het wassen 2 keer.
  5. Verwijder het supernatant en voeg genoeg RPMI-A een mengsel dat 50% RBC volumeprocent produceren.
  6. Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is.

3. Handhaving van Parasite Cultures

  1. Pre-warm RPMI-A tot 37 o C.
  2. Plaats ontdooid parasieten (zie MR4 protocol ontdooien) in een T25 kolf met 5 ml van RPMI-A en 75 pl gewassen humane RBC voor een hematocrit van ~ 3%.Opmerking: Hematocriet meet het volume van RBC opzichte totale volume. Berekenen hematocriet meten van het volume van verpakte RBC tot het totale volume van medium met RBC. Neem aan dat de ontdooide parasieten dragen 75 pl RBC. Door toevoeging van 150 gl RBC voorraad (wat overeenkomt met het toevoegen van 75 ui verpakte RBC) aan de kolf er in totaal 150 ul van RBC in 5 ml medium, wat overeenkomt met een hematocriet van 3% (150 gl / 5000 pi x 100% = 3%).
  3. Gas de kolf gedurende 30 sec met parasieten gasmengsel (1% O2, 3% CO2, balans N2). Seal en plaats de kolf brede zijde in een 37 ° C incubator mogelijk te maken voor het grootste oppervlak voor gasuitwisseling.
  4. Om het medium te veranderen en te controleren op parasitemie (moet dagelijks worden gedaan), zorgvuldig verplaatsen de kolf als aan de RBC laag niet verstoren. Met behulp van een steriele unplugged Pasteur pipet te trekken uit het kweekmedium zonder verstoring van het bloed laag.
  5. Om pa controlerenrasitemia, verwijderen van een 10 ul monster van het bloed laag, leg het op een glasplaatje en het gebruik van een tweede glasplaatje creëren een dunne bloed film. Laat slide drogen.
  6. Plaats 4 ml vers RPMI-A in de kolf, meng, gas voor 30 sec, en de plaats in de incubator bij 37 ° C.
  7. Vlekken op de schuif met behulp van de hemA3 kleuring kit volgens protocol van de fabrikant.
    1. Voor een optimale kleuring, dip schuift bij de vaststelling oplossing voor 10 sec, oplossing die ik voor 10 sec, en oplossing II voor 30 sec. Afspoelen met water en laat dia's om te drogen.
  8. Bereken parasitemie door het tellen van het aantal PfRBC (gebrandschilderd donkerpaars) ten opzichte van het totale aantal RBC (gebrandschilderd roze). Telling in totaal 300 cellen nauwkeurigheid.
  9. Wanneer parasieten een parasitemie van 5% hebben bereikt, de uitbreiding van de cultuur in een T75 kolf met 40 ml RPMI-A, en 500 ul van RBC.

4. Parasite Synchronisatie

Opmerking: De dag voor thij experimenteren, de parasiet cultuur synchroniseren door behandeling met alanine. Alleen ring stadium parasieten en niet-geïnfecteerde RBC zal deze behandeling overleven. Alanine synchronisatie zal u een pure trophozoite cultuur de volgende dag, dat kan worden gebruikt in de co-cultuur experimenten geven. Zorg ervoor te beginnen met een parasiet cultuur die de meeste ring parasieten bevat.

  1. Bereid alanine oplossing door het mengen van 8,01 g alanine (300 mM) en 0,365 g Tris (10 mM) in 300 ml van DDH 2 O. Breng de pH tot 7,4. Filter gesteriliseerd met behulp van een 0,2 urn filtereenheid.
  2. Pre-warm alanine oplossing tot 37 o C.
  3. Spin down de parasiet cultuur (5 min x 1000 x g), en verwijder het medium.
  4. Resuspendeer pellet in 19 volumina alanine-oplossing (1 ml verpakt RBC aan 19 ml alanine oplossing). Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
  5. Spin 5 min x 1000 x g. Zuig supernatant. Was in RPMI-0 keer. Zuig supernatant en resuspendeer in RPMI-A en pas hematocriet tot ~ 3%. Gals kolf en terugkeer naar de 37 o C.
    Opmerking: Voor co-cultuur experimenten minimaal parasitemie van 5% trofozoïeten nodig is, met 10% parasitemie beschouwd als optimaal.

5. Parasite en RBC Voorbereiding voor co-cultuur experimenten

  1. Met een verhouding van 3 PfRBC per PBMC in co-kweek-experimenten een ontstekingsreactie veroorzaken. Om totale PfRBC berekenen parasitemie gekwantificeerd door een dun bloeduitstrijkje zoals beschreven in 3,5 en hematocriet door telling van het aantal RBC per ml kweek parasiet behulp van een hemocytometer.
    Aantal PfRBC =% parasitemie x totale RBC / ml x ml van de cultuur. Bijvoorbeeld: 10 ml kweken bij 10 x 10 6 RBC / ml en 10% parasitemie is gelijk aan 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
  2. Draai de parasiet kweek gedurende 5 min bij 1000 xg (RT). Zuig medium en resuspendeer in 6 x 10 6 PfRBC per ml in RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 aangevuld met L-glutamine en HEPES, 10% hittegeïnactiveerd FBS, 1,5 ml gentamycine, 5 ml van 100 mM natriumpyruvaat, 5 ml 10 mM MEM niet-essentiële aminozuren, 5 ml 5 mM β-mercaptoethanol).
  3. Neem controle bloed (geïnfecteerde RBC van dezelfde donor voor het onderhoud van de parasiet cultuur), berekenen hematocriet en hersuspenderen in RPMI-S + op hetzelfde aantal RBC per ml als parasiet cultuur.

6. Isolatie van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC)

  1. Verzamel veneuze bloed in natrium heparine buisjes (groene top) van zowel een chronische HIV (+) donor en een HIV (-) controle. Laat EDTA als anti-coagulant calcium chelerende werking EDTA beïnvloedt celfunctie. Gemiddeld verwachten tussen de 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml bloed. Bij een kenmerkend experiment laat 30 ml bloed van elke donor. Het bloedvolume moet worden aangepast aan de experimentele eisen.
  2. Zo snel mogelijk en zeker binnen een uur van het bloed worden verzameld,het bloed van de buizen en plaats te verwijderen in een plastic 50 ml buis. Monocyten in het bijzonder geactiveerd en vasthouden aan glas, dus is het belangrijk dat als glazen bloedafnamebuisjes gebruikt cellen zo snel mogelijk worden verwijderd.
  3. Draai het bloed bij 1000 g gedurende 15 minuten en verzamel plasma (dit kan worden gebruikt voor andere studies indien nodig - als deze stap overgeslagen kan zijn). Verdun het bloed gelijk volume van koude DPBS.
  4. Plaats 15 ml Ficoll RT in een 50 ml buis. Langzaam, met een steriele plastic transferpipet, laag bloed / DPBS oplossing over de Ficoll zonder mengen. Een maximum van 25 ml bloed / DPBS oplossing kan worden gelaagd over elk 15 ml Ficoll.
  5. Draai de hellingen gedurende 30 min bij kamertemperatuur bij 600 x g. Zorg ervoor dat de instelling 'geen rem' op.
  6. Nadat de cellen gecentrifugeerd, zoeken naar het grensvlak tussen de twee fasen. Dit is waar de PBMC zijn. Met behulp van een steriele plastic transferpipet verzamelen van de PBMC van de interface (zieFiguur 1). Besmetting te minimaliseren door RBC.
  7. Plaats verzamelde cellen in 50 ml buizen met niet meer dan 20 ml per buis. Bovenbuis tot 50 ml met een steriele koud DPBS.
  8. Draai de cellen gedurende 10 min bij 4 ° C bij 300 x g.
  9. Gooi supernatant, resuspendeer pellet in 5 ml steriel koud DPBS en bundelen alle cellen van dezelfde donor in een buis. Top tot 50 ml met een steriele DPBS, en herhaal het wassen stappen 2 keer.
  10. Resuspendeer cellen in 10 ml RPMI-medium + S.
  11. Verwijderen 20 pi aliquot en mengen met 20 pi van trypan blue. Pipet 10 ul in een hemocytometer en tel de levende cellen (cellen die geen gebruik hebben gemaakt van de blauwe kleurstof - alle blauwe cellen zijn dood). Gebruik een hemocytometer om aantal cellen te berekenen in een oplossing als volgt.
    Opmerking: Een haemocytometer heeft een raster van bepaalde afmetingen, zodat het gebied dat onder de lijnen bekend.
    1. Zorg ervoor dat de hemocytometer schoon is. Plaats het dekglaasje over de counting omgeving. Belasting 10 pi celoplossing door het plaatsen van de pipetpunt in één van de V-vormige putjes. Het oppervlak onder het dekglaasje vult door capillaire werking.
    2. Plaats de geladen hemocytometer onder een microscoop. De volledige rooster van de hemocytometer bevat 9 vierkanten van 1 mm 2 per stuk. Tel alle cellen in elke grote plein. Als er te veel cellen aanwezig zijn, verdun de oplossing verder en hertelling.
    3. Bereken cel concentratie als volgt: Totaal aantal cellen / ml = (totaal cellen geteld / # vierkantjes) x verdunningsfactor x 10.000 cellen / ml, bijvoorbeeld (500 cellen / 5 vierkantjes) x verdunningsfactor van 20 x 10.000 cellen / ml = 20 x 10 6 cellen totaal.
  12. Stel medium tot een uiteindelijke concentratie van 10 x 10 6 per ml (RPMI-medium + S).

7. Malaria / HIV Co-infectie Cultuur

  1. Plaat 100 pl geïsoleerde PBMCs en 400 ul RPMI-medium + S een 24-putjes plaat (1 x 10 6 PBMC per putje). Verzekerendie putten worden opgezet in drievoud: 3 putten voor geïnfecteerde RBC, 3 putten met PfRBC, 3 putten met middelgrote en 3 waterputten met PMA / Ionomycine. Dit is zowel voor HIV (+) en HIV (-) monster.
  2. Voor de PfRBC putjes, plaats 3 x 10 6 PfRBC in elk van de putten (500 ui parasiet kweek bereid in 5,2).
  3. Voor geïnfecteerde RBC putjes plaats 500 pl van de geïnfecteerde RBC kweek bereid in 5,3 in elk van de putjes.
  4. Voor medium putjes plaats 500 pl RPMI + S-medium in elk van de putjes.
  5. Voor PMA / Ionomycine putten, bereiden PMA / Ionomycine oplossing (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Plaats 500 ul van deze oplossing in elk putje.
    Opmerking: Als potente stimulatoren van T-cel cytokine secretie, PMA en lonomycine worden gebruikt als een positieve controle om te garanderen cellen functioneel.
  6. Plaat staan ​​bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
  7. Optioneel: gebruik teveel cellen voor fenotypische analyse met behulp van flowcytometrie of op te slaan in een RNEen stabilisatie oplossing voor toekomstige mRNA-expressie analyse.

8. Detectie van Malaria Immune Responses

Opmerking: Voer co-kweek-experimenten zolang 4 dagen. Nr medium verandering nodig in deze tijd. Het optimale tijdstip zal afhangen van het celtype van belang en de gestelde vraag. Een incubatie van 12-48 uur is optimaal voor monocytische reactie op PfRBCs, terwijl lymfocyt responsen werden best waargenomen bij 72-96 uur. De tijdstippen moeten worden geoptimaliseerd op basis van de wetenschappelijke vraag. Kortere periodes (2-4 uur) kan worden gebruikt als de interactie tussen intact PfRBC en PBMC is van belang.

  1. Spin plaat bij 300 xg gedurende 3 minuten tot pellet cellen. Verzamel 700 pi kweeksupernatant uit elk putje.
  2. Spin supernatant bij 1000 xg gedurende 5 minuten om vrij van vuil.
  3. Aliquot heldere supernatant indien nodig, label en bevriezen bij -20 ° C onder tot analyse van uitgescheiden factoren te zijn performed.
  4. Analyseer cytokine / chemokine reacties met ELISA of bead array (volg stelde protocollen van de fabrikant).
  5. Verzamel cellen die overblijven in de plaat in een RNA stabiliserende oplossing en benut voor mRNA expressie analyse door kwantitatieve real-time PCR 14-16.

9. Intracellulaire Flowcytometrie voor mobiele-specifieke Ccytokine Reacties Met behulp van PBMC co-gekweekt met P. falciparum geïnfecteerde RBC

Opmerking: Zoals de lengte van co-kweek genoemd zal afhangen van het celtype van belang. Indien geïnteresseerd in monocytische reactie op een kortere incubatieperiode PfRBC nodig. Duurt langer om aangeboren lymfocyt responsen γδ T-cellen, NK-cellen, NKT-cellen), en nog langer voor CD4 en CD8 T-cellen. Optimalisatie nodig zal zijn.

  1. 6-8 uur voorafgaand aan de analyse toe 1 pl 1000x Brefeldine A aan alle putjes. Zet de plaat tot 37 o C incubator. Na 6-8 uur incubatie, laat de plaat op ijs gedurende 15 min.
  2. Verwijder cellen van de putjes met behulp krachtig pipetteren en plaats ze in gelabelde microcentifuge buizen. Schrapen kan worden verplicht om monocyten te verwijderen.
  3. Spin cellen gedurende 5 min bij 1000 x g. Verwijderen supernatanten. Resuspendeer cellen in 500 pi van stromingscytometrie buffer (1x DPBS, 2% warmte geïnactiveerd FBS, 0,02% natriumazide).
  4. Verdeel cellen up zodat elk monster: een buis volledig antilichaamkleuring (240 ui), en één buis fluorescent min één (FMO) controle antilichaam kleuring (240 ui). Zwembad een kleine hoeveelheid van elk monster (20 ul) van de ongekleurde flowcytometrie control (deze wordt gebruikt bij het opzetten van de flowcytometer).
  5. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
  6. Incubeer de cellen met geconjugeerde anti-humaan CD16 / CD32 (5 ug / ml) in 50 gl flowcytometrie buffer gedurende 15 min bij 4 ° C aan Fc-receptoren te blokkeren.
  7. Voeg 1 ml van flowcytometrie buffer aan elke buis. Spin cells gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
  8. Resuspendeer cellen in 50 ui buffer flowcytometrie met een vooraf bepaalde concentratie van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen gewenste celoppervlak markers. Pre-mix genoeg antilichaam oplossing voor alle monsters te worden gekleurd. Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 20 min. Beschermen tegen light.Note: Hoeveelheid elk antilichaam moeten worden geoptimaliseerd. We routinematig vlek voor CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Getitreerd hoeveelheden van deze antilichamen worden in tabel 1.
  9. Voeg 1 ml van flowcytometrie buffer aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
  10. Voeg 100 ul van Cytofix / Cytoperm oplossing aan elke buis. Incubeer cellen gedurende 20 min bij 4 ° C. Bescherming tegen licht.
  11. Voeg 1 ml Perm / wasbuffer (10x geleverd als concentraat - verdunnen tot 1x behulp DDH 2 O) aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
  12. Voeg 100 μl van perm / wassen buffer FMO controle antilichaam kleuring buizen en meng om cellen mengen.
  13. Voeg 100 ul van perm / wasbuffer met een vooraf bepaalde concentratie van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voor gewenste intracellulaire markers (bijv cytokines / chemokines) volledig antilichaamkleuring tubes.
    Opmerking: Hoeveelheid elk antilichaam moeten worden geoptimaliseerd. We routinematig kleuren met anti-TNF en anti-IFNy-antilichamen. Getitreerd hoeveelheden van deze antilichamen worden in tabel 1.
  14. Incubeer alle buizen gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Bescherming tegen licht.
  15. Voeg 1 ml Perm / Wash buffer aan elke buis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g. Verwijderen supernatanten.
  16. Resuspendeer cellen in 300 ul buffer flowcytometrie met 1% paraformaldehyde. Laat zitten voor een minimum van 15 minuten te neutraliseren HIV.
  17. Bereid enkel antilichaam gekleurd monsters met behulp van compensatie kralen, moet worden gebruikt voor compensatie ingesteld op de flowcytometer. De vorm van compensatieparels zal afhangen van de gebruikte antilichamen (bijv., anti-muizen-Ig, anti-rat / hamster Ig). Vortex kralen. Voeg een druppel kralen per antilichaam. Voeg gelijke hoeveelheden antilichaam zoals gebruikt voor kleuring. Voeg 200 ul van flowcytometrie buffer. Deze zijn nu klaar voor gebruik. Er is geen noodzaak om de parels te wassen.
  18. Verwerven monsters op een flowcytometer zo spoedig mogelijk en binnen 24 uur voor het beste resultaat. Tandem kleurstoffen zijn gevoelig voor dissociatie met berging dus we raden onmiddellijke overname, indien mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De grafieken tonen de niveaus van IFNy productie van NKT-cellen (figuur 2), via CD56 + CD3 + γδ- poorten van de NKT-cellen populatie te verkrijgen (data niet getoond). De cellen werden gedurende 72 uren voorafgaand aan kleuring. Eenmaal gekleurd, 100.000 CD3 + cellen werden verkregen op de flowcytometer om groot genoeg populaties van NK, NKT en γδ cellen (cellen van belang) te verkrijgen. Een minimum van 5600 NKT-cellen worden op elke grafiek. TNF-productie wordt verkregen op dezelfde wijze (gegevens ni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ons protocol is geoptimaliseerd om zo realistisch studie HIV-malaria co-infectie in vitro. Eerst verse menselijke RBCs en serum zijn vereist voor malariaparasiet cultuur. Dit is essentieel voor een gezonde populatie van malariaparasieten verkrijgen. Parasiet lysaten kan niet worden vervangen voor levende parasieten als cytokine productie is veel sneller en intenser bij het ​​gebruik van live-P. falciparum geïnfecteerde RBC (PfRBC) 17,18. Bovendien activeren van celtypen zoals NK-cellen, vere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

C.A.M.F. en L.S. hebben deelgenomen aan het ontwerp van het protocol, de verwerving en analyse van gegevens en het opstellen van het artikel.

De auteurs willen Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth en Dr. Ayi bedanken voor hun bijdragen.

C.F. werd ondersteund door een CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) postdoctorale beurs. L.S. wordt ondersteund door een OHTN Junior Investigator Development Award. Het huidige werk werd ondersteund door een Canadian Institutes of Health Research (CIHR) operationele subsidie (MOP-13721 en 115160) en een CIHR New Investigator Catalyst-subsidie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
alanineSigmaA7377
antibodies (zie andere tabel)
BD Cytofix/Cytoperm met BD GolgiPlugBD555028bevat brefeldine A, cytofix/cytoperm buffer en perm/wash buffer
BD Vacutainer ACD Oplossing ABD364506
BD Vacutainer Natrium HeparineBD17-1440-02
DPBS (geen calcium, geen magnesium)Corning21-031-CV
Fetal bovien serumSigmaF1051voor gebruik verhit inactiveren
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamycin (10 mg/ml)Gibco15710-064
Hema3 KleurstellingFisher122-911
HEPESFisherBP310-500
hypoxanthineSigmaH9636
IonomycinSigmaI3909
MEM niet-essentiële aminozuren (10 mM)Gibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640 poederLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 met L-glutamine en HEPESThermo ScientificSH30255.01
natriumbicarbonaat (poeder, celkweek)SigmaS5761
Natrium Pyruvaat (100 mM)Gibco11360
Tris (Trizma base)SigmaT6066
TrizolAmbion15596018
Trypan Blauw (0,4%)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845afhankelijk van gebruikte antilichamen
Parasiet GasmengselOp speciale bestelling3% CO2, 1% O2, rest N2
Apparatuur
0,2 μm filter unit
Glijbanen
T25 flessen
T75 flessen
50 ml buizen
24 well kweekplaten
ongeplugged Pasteur pipetten
plugged Pasteur pipetten
steriele transfer pipetten
hemocytometer
flow cytometer (3 laser)
Antilichamen gebruikt voor flow cytometry
Anti-TNFeBiosciences551487FITC (fluorofoor) 2 μl
Anti-IFNγBiolegend506507PE (fluorofoor) 20 μl
Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (fluorofoor) 1 μl
Anti-CD14Biolegend; BD Biosciences325624; 551487Biotin (fluorofoor) 0,5 μl Streptavin PE-TR (fluorofoor) 0,1 μl
Anti-CD56Biolegend318322PerCP/Cy5.5 (fluorofoor) 5 μl
Anti-γδBiolegend331212APC (fluorofoor) 5 μl
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (fluorofoor) 5 μl
Anti-CD4Biolegend317424Pacific Blue (fluorofoor) 1 μl

Referenties

  1. Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
  2. French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
  3. Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
  4. Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
  5. Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
  6. Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
  7. Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
  8. Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
  9. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
  10. Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
  11. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
  12. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
  13. Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
  14. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  15. Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
  18. Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
  19. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  20. Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102(2012).
  21. Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
  22. Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
  23. Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
  24. Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
  25. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
  26. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
  27. Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HIV malaria co nfectieperifere mononucleaire bloedcellenPlasmodium falciparum kweekflowcytometrie analysecytokineproductie assayaangeboren immuunresponsinterferongamma metingbiosafety level 2 protocolceloppervlaktemarkers
Een
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.