Methodenartikel

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

12.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

23 oktober 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Inzicht in de complexe werkingen van de hersenen vereist geavanceerde onderzoeksinstrumenten. Hier demonstreren we een nieuwe op zijde-collageen gebaseerd 3D-geengineerd model van zenuwweefsel dat lijkt op een hersen-achtige architectuur. Het model kan worden gebruikt om de assemblage van neuronale netwerken, axongeleide, cel-cel interacties en elektrische activiteit te bestuderen.

Samenvatting

Ondanks enorme inspanningen om de anatomie, samenstelling en functie van de hersenen te ontcijferen, blijft het het minst begrepen orgaan van het menselijk lichaam. Om een dieper begrip van het neurale systeem te verkrijgen, streven wetenschappers ernaar het weefsel simplistisch te reconstrueren door het in vitro samen te stellen uit basisbouwstenen met behulp van een weefselengineeringbenadering. Onze groep ontwikkelde een weefsel-geengineerd zijden en collageen-gebaseerd 3D hersen-achtig model dat de witte en grijze materie van de cortex nabootst. Het model bestaat uit een zijden poreuze spons, die vooraf is gezaaid met rattenhersencelv-afgeleide neuronen, ondergedompeld in een zachte collageenmatrix. Gepolariseerde neuronale uitgroei en netwerkvorming wordt waargenomen met afzonderlijke axon- en cellichaamslokalisatie. Deze compartimentele architectuur maakt de unieke ontwikkeling van niches mogelijk die natuurlijk neuraal weefsel nabootsen, waardoor onderzoek naar neuronale netwerkassemblage, axon-geleiding, cel-cel- en cel-matrix-interacties en elektrische functies mogelijk wordt.

Inleiding

Het centrale zenuwstelsel (CNS) kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van aandoeningen waarbij vasculaire, structurele, functionele, infectieuze of degeneratieve. Naar schatting 6,8 miljoen mensen per jaar sterven als gevolg van neurologische aandoeningen, die een groeiende sociaal-economische last vertegenwoordigt wereldwijd 1. Slechts enkele van de aandoeningen beschikbare behandelingen. Daarom is er dringend behoefte aan innovatieve therapeutische strategieën voor patiënten met neurologische aandoeningen. Helaas zijn veel CNS-gerichte therapieën falen tijdens klinische studies, voor een deel te wijten aan het gebruik van onvoldoende pre-klinisch onderzoek modellen, die niet de beoordeling van acute en chronische effecten met fysiologisch relevante functionele uitlezing toestaan.

Ondanks aanzienlijke onderzoeksinspanningen van de afgelopen decennia, is er een enorme hoeveelheid onbekend over de structuur en functie van het centrale zenuwstelsel. Om meer kennis op te doen, diermodellen vaak onsed model pathologische toestanden, zoals traumatisch hersenletsel (TBI) of dementie, vooral in preklinische studies. Echter, dieren aanzienlijk verschillen van mensen zowel anatomie van CNS, evenals in functie genexpressie en metabolisme 2-4. Anderzijds, 2D in vitro kweken zijn de gebruikte methode om celbiologie onderzoeken en worden routinematig gebruikt voor drug discovery. Echter, 2D celkweken niet de complexiteit en fysiologische relevantie ten opzichte van menselijke hersenen 5-7. Hoewel er geen vervanging voor de lage kosten en eenvoud van 2D celkweek onderzoeken of de complexiteit door diermodellen kunnen 3D weefselengineering verbeterde onderzoeksmodellen genereren om het vacuüm tussen de 2D in vitro en in vivo technieken te sluiten. 3D tissue engineering biedt meer fysiologisch relevante bereikt door 3D cel-cel interacties en extracellulaire signalen die de Biomaterialen experimentele omstandigheden. Despite de significant bewijs achter de waarde van 3D-culturen, zijn er momenteel slechts een paar 3D-CNS weefsel modellen zoals stamcellen afgeleide organoïde culturen 8-10, neurospheroids 11 en verspreid hydrogel culturen 12,13. Geavanceerde technische methoden waaronder meerlagige lithografie 14 en 3D printing 15 zijn gebruikt voor het bestuderen long-, lever- en nierweefsel. Er is echter weinig CNS 3D-modellen die het mogelijk maken gecompartimenteerde neuronale groei, zoals het nabootsen van de corticale architectuur en biologie. Gescheiden groei van neurieten van neuronale cellichamen is eerder in 2D culturen aangetoond met behulp van microfabricage 16,17 waardoor de studie van de axon darmkanaal tracing, calciuminflux, netwerkarchitectuur en activiteiten. Dit idee inspireerde ons om een 3D-gepolariseerde zenuwweefsel, waar cellichamen en axonale stukken bevinden zich in verschillende compartimenten nabootsen van de gelaagde architectuur van de hersenen 18 ontwikkelen . Onze benadering is gebaseerd op het gebruik van unieke zijde scaffold ontwerp dat een hoge dichtheid van cellen herbergt in een gesloten volume en maakt uitgroei van dichte axonale netwerk een collageengel. Hier laten we de volledige assemblage procedure van de hersenen-achtig weefsel met inbegrip van het schavot fabricage en neuronale cultuur.

Protocol

Het hersenweefsel isolatie protocol werd goedgekeurd door de Tufts University Institutional Animal Care en gebruik Comite en voldoet aan de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institutional Animal Care en gebruik Comite B2011-45).

1. Silk Steiger Voorbereiding

  1. Voorbereiding van zijde oplossing van Bombyx mori cocons zoals eerder beschreven 19,20.
    1. Snijd elke cocon in 8 gelijke stukken met een schaar. Gebruik ongeveer 11 cocons voor 5 g van gefragmenteerde cocons. (15 min)
    2. Bereid 2 L van 0,02 M Na 2 CO 3 oplossing en breng het aan de kook met een hete plaat. (15 min)
    3. Weeg 5 g versnipperde cocons en kook ze in Na 2 CO 3 oplossing voor 30 min. Roer het kokende zijde om de paar minuten met een spatel. Deze stap, ook wel van ontgommen, zuivert zijde fibroin van hydrofiele eiwitten, sericins. (30 min)
    4. Wring de fibroin met de hand en spoel het in gedestilleerd water minstens drie keer te spoelen resterende sericine en chemicaliën. (5 minuten)
    5. Plaats de natte fibroin op een petrischaal en droog de fibroin extract in de stroomkap O / N.
    6. De volgende dag de wegen droog fibroin massa en plaats de fibroin in een glazen beker. (15 min)
    7. Om de fibroin in 9,3 M oplossing LiBr Bereken het vereiste volume (in ml) LiBr ontbinden de massa droge fibroïne vermenigvuldigen met 4. Giet langzaam LiBr oplossing via zijdefibroïne en dompel alle fibroïnevezels behulp spatel. Bedek het bekerglas om verdamping te voorkomen en plaats deze bij 60 ° C gedurende 4 uur om de vezels te lossen. (15 min)
    8. Met behulp van de spuit, het verzamelen van de fibroïne oplossing uit de beker en plaats hem in de MWCO 3500 dialyse cassettes. Presteren dialyse tegen gedestilleerd water gedurende 48 uur. Ververs het water om de paar uur.
    9. Met behulp van de spuit, het verzamelen van de fibroin oplossing vande cassettes in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 9000 rpm twee keer (~ 12.700 xg) bij 4 ° C gedurende 20 min. Giet de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis na elke centrifugeren stap en de pellet gooi. (40 min)
    10. Meet de concentratie van de fibroïne door schatting van het drooggewicht. Giet 1 ml van zijde oplossing in een weeg boot. Droog het monster in de oven bij 60 ° C gedurende 2 uur. Weeg de droge zijdefibroïne en bereken de concentratie van zijdefibroïne oplossing door vermenigvuldiging verkregen gewicht van 100. De verwachte concentratie van zijde oplossing is 6-9% (w / v).
    11. Pas de zijde concentratie 6% (w / v) door verdunning in gedestilleerd water.
      Stopplaats: De vloeibare zijdefibroïne kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand in een gesloten container.
  2. Bereiding van poreuze draagstructuren van zijde oplossing.
    1. Zeef de korrels NaCl scheiden de granules grootte 500-600 pm, die zal worden gebruikt in latere stappen. Gooi de korrels grootte beneden 500 pm en boven 600 urn. (15 min)
    2. Giet 30 ml 6% zijde oplossing in het polytetrafluoretheen (PTFE) mal (Figuur 1). Verstrooien voorzichtig 60 g gezeefde NaCl over de zijde. Tik de houder een uniforme laag zout te verkrijgen. Incubeer 48 uur bij kamertemperatuur aan de zijde polymeriseren.
    3. Plaats de scaffold PTFE schimmel in de oven bij 60 ° C gedurende 1 uur om de polymerisatie te voltooien en damp resterende vloeistof.
    4. Plaats de inhoud van de PTFE matrijs in een bekerglas met 2 liter gedestilleerd water gedurende 48 uur om uit te logen het zout. Veranderen 2-3 keer per dag het water. Verwijder de spons scaffolds uit de vorm wanneer het zout volledig uitgeloogd stoppunt. De sponsen kan worden opgeslagen ondergedompeld in water bij 4 ° C in een gesloten houder te voorkomen dat de steigers tegen uitdroging.
    5. Als u klaar bent, knip de steigers met 5 mm diameter biopsie punch. Voorgesneden de steigers tot ongeveer 2 mm in hoogte te bereiken. PuNCH ​​het midden van de steiger met 2 mm punch biopsie (figuur 2A). (1 hr)
    6. Autoclaaf de steigers ondergedompeld in water om ze te steriliseren (nat cyclus, 121 ° C, 20 min) stoppunt. De sponsen kan worden opgeslagen ondergedompeld in water bij 4 ° C in een gesloten houder te voorkomen dat de steigers tegen uitdroging.
    7. Voor de geplande cel enten dompel de steigers in steriele 0,1 mg / ml poly-D-lysine (PDL) oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    8. Was de steigers 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om niet gebonden PDL verwijderen. (30 min)

2. Isolatie van Rat corticale neuronen

  1. Ontleden cortex uit embryonale dag 18 (E18) Sprague-Dawley ratten zoals eerder beschreven door Pacifici en Peruzzi 27 na goedgekeurde protocol dier wordt verkregen. (2 uur)
  2. Incubeer 10 cortex in 5 ml 0,25% trypsine met 0,3% DNase I (van bovine pancreas) gedurende 20 min bij 37 ° C.
  3. Inactivatie van het trypsine door toevoeging gelijk volume van 1 mg / ml soja-eiwit.
  4. Vermaal de cortex met 10 ml pasteurpipet op en neer te pipetteren 20 totdat een enkele celsuspensie gegenereerd. Wees voorzichtig en vermijd luchtbel vorming. (10 min)
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 127 xg gedurende 5 min.
  6. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml kweekmedium (Neurobasal medium, 1x B27 supplement, 1x Glutamax, 1% penicilline / streptomycine). Tel de cellen. De verwachte concentratiecel ongeveer 2x10 7 / ml. (20 min)

3. Construct Vergadering en Cultuur

  1. Scaffold enten met cellen.
    1. Verplaats de steriele steigers en alle benodigde gebruiksvoorwerpen in een celkweek kap. Met behulp van een steriel pincet plaats de steigers in een 96-well celkweek plaat toekenning van een steiger per putje. (10 min)
    2. Dompel de steigers in celcultuur medium in evenwicht hen voorafgaand aan het zaad celing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. (10 min)
    3. Zuig het overtollige van het medium uit de steigers.
    4. Breng 100 pi celsuspensie / scaffold. (10 min)
    5. Incubeer de cellen bij 37 ° CO / N om celhechting aan de steiger.
    6. De volgende morgen zuigen de niet gehechte cellen en toepassen 200 pl / putje vers kweekmedium. (10 min)
  2. Steiger inbedding met collageen matrix. (2 uur)
    1. Plaats 10x PBS, water, 1 N NaOH en rat staart I collageen op ijs. Bereid een werkoplossing van collageen volgens de instructies van de fabrikant. Onderhouden op ijs totdat de cel gezaaid constructies zijn klaar (maximaal 1 uur).
    2. Verwijder de cel geplaatste zijde constructies uit de incubator en zuig het overtollige medium.
    3. Steriele tang overdracht van de steigers aan de lege putjes van de putjesplaat en dompel elke steiger in 100 gl 3 mg / ml collageenoplossing. Plaats de weefselkweek plaat terugin de incubator gedurende 30 minuten om polymerisatie van collageen toestaan.
    4. Breng 100 ul voorverwarmde celcultuur medium / putje. Cultuur constructen één week waarbij het medium elke dag vervangen slechts de helft van het volume van het medium.

4. Microscopie Analyse

  1. Levend / dood kleuring (1 uur)
    1. Bereid voorraadoplossing van propidiumjodide (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) in gedestilleerd water.
    2. Bereid voorraadoplossing van fluoresceïne diacetaat (FDA) 2 mg / ml in aceton.
    3. Bereid werkende oplossing bevattende 10 uM en 0,15 uM PI FDA verdund in PBS. Vooraf verwarmen van de oplossing tot 37 ° C in een waterbad.
    4. Was de cellen met voorverwarmd PBS het serum esterases verwijderen. Zuig het PBS.
    5. Breng de voorverwarmde werkoplossing aan de cellen gedurende 2 minuten en wassen met PBS.
    6. Gebruik epifluorescerende microscoop het imago van de cellen (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). De vlek blijft stabiel op 40 min. Langdurige kleuring kan leiden tot niet- specifieke kleuring gevolg van PI opname door de cellen en co-localisatie van PI / FDA in cellen.
  2. Immunokleuring
    1. Op het gewenste tijdstip van cultuur vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Vanwege de toxiciteit van de PFA dampen vaststelling stap moet in de zuurkast worden uitgevoerd.
    2. Was steigers met 3x PBS stoppunt. De PFA gefixeerd constructen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende enkele dagen alvorens verdere stappen.
    3. Incubeer de steigers in 0,2% Triton, 0,25% runderserumalbumine (BSA) in PBS met primair antilichaam O / N bij 4 ° C.
    4. De volgende dag kleuroplossing weggooien en was de steigers 3 x 30 min met PBS om het niet-gebonden primair antilichaam te verwijderen.
    5. Incubeer de monsters met secundair antilichaam verdund in 0,2% Triton, 0,25% BSA in PBS gedurende 2uur bij KT.
    6. Verwijder de kleuroplossing en was de steigers 3 x 30 min met PBS om het niet-gebonden secundair antilichaam te verwijderen.
    7. Afbeelding de steigers behulp van een confocale microscoop met 20x objectief neem 100 urn z-gedeelten van het monster met 1 urn stap. De dunne neurites de beeldresolutie moet van minimaal 1024 x 1024 pixels te visualiseren.
  3. RNA, DNA en eiwit isolatie
    Opmerking: RNA, DNA en eiwit isolatie wordt uitgevoerd met een commerciële AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Met behulp van een steriel pincet overdracht van de steigers van de cultuur plaat naar een 2 ml steriele buis. Plaats een steiger per buis.
    2. Voeg 200 ul RLT-buffer aan elke buis.
    3. Verstoren het construct door fragmenteren met steriele microscissors.
    4. Om de verstoorde weefsel te homogeniseren, de overdracht van de inhoud van de buis naar de spin kolom. Spin gedurende 2 minuten op volle snelheid in een microcentrifuge.Het lysaat wordt gehomogeniseerd als het door de spin kolom passeert.
    5. Verzamel de stroom door en gebruik het onmiddellijk te isoleren RNA, DNA en eiwitten volgens de fabrikant protocol.
    6. Kwantificeren van de opbrengst van de nucleïnezuren andere compatibele methode (bijv NanoDrop).
    7. Kwantificeren eiwitrendement via BCA Protein Assay volgens de instructies van de fabrikant. Meet het resultaat van analyse met gebruik microplaatlezer bij golflengte 562 nm.
      Opmerking: De verwachte opbrengst van nucleïnezuren en eiwitten per construct ten opzichte van de celdichtheid wordt getoond in figuur 4.

Resultaten

Solide zijde sponzen voorgesneden naar de donut vorm vormen een uniek en simpel idee om een verzuilde architectuur lijkt op zenuwweefsel (Figuur 2A) te bereiken. De sterk poreuze structuur van het skelet met poriegrootte van ongeveer 500 urn resultaten in uitzonderlijk hoog specifiek oppervlak zodat het zaaien en groei van hoge celdichtheid in een klein volume (2x10 7 / ml) (Figuur 2B). Daarnaast is de hoge porositeit van de steiger maakt onbeperkte diffusie van voedingsstoffen en afvalstoffen resulteert in een superieure levensvatbaarheid van dichte celculturen gedurende langere tijdframes. Bij het zaaien de neuronen snel en uniform hechten aan het oppervlak van het schavot poriën.

Na celhechting voltooid en cellen in evenwicht gebracht op de zijde substraat, wordt de spons schavot gevuld met zachte collageen matrix teneinde een 3D-omgeving voor axonale netwerkformatie (figuur 3 ). Bij afwezigheid van de collageen matrix de compartimentering van axonen en cellichamen niet mogelijk neuronen groeien extensions alleen op het oppervlak van de poriën resulteert in gemengde netwerken gevonden 2D oppervlakken (figuur 3B). In tegenstelling, de collageengel verschaft een maaswerk die uitgebreide axonale uitgroei in 3D ondersteunt, terwijl neuronale cellichamen blijven zitten aan de zijde scaffold (figuur 3C). Groeipatroon leidt tot compartimentering van cellichamen en pure axonale netwerken (figuur 3D), waarbij de grijze en witte stof van de cortex in de hersenen lijkt.

Naast microscopie, kunnen de constructen worden geëvalueerd met een verscheidenheid aan andere methoden 18, afhankelijk van de vraag achter het experiment. Zo kan de isolatie van DNA, RNA en eiwit van de constructen gemakkelijk worden uitgevoerd met gebruikmaking van commerciële kits (figuur 4). De opbrengst van nucleïnezuren en eiwitten per construct afhankelijk van het aantal cellen eerst gezaaid op de zijde steigers. Hoe meer cellen uitgezet hoe hoger het rendement van DNA, RNA en eiwitten.

figure-results-1
Figuur 1. PTFE mal gebruikt voor zijde spons schavot voorbereiding De afmetingen:.. Diameter van 10 cm, 2 cm hoogte Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. 3D brain-achtig weefsel model. (A) poreuze zijde spons schavot. (B) live / dood kleuring van neuronen op dag 1 na het zaaien op zijde schavot voor collageen inbedden (groene-levende cellen, rode-dode cellen). Panelen aan de rechterkant tonen de magnification van het gebied dat wordt vastgelegd in het rood frames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Neuronale gecompartimenteerd uitgroei in de 3D ​​hersenen-achtig weefsel model (A) Steiger compartimenten:. Rood-cel lichaam compartiment, Blue-axonale compartiment. (B) Neuronale groeipatroon op dag 1 na het zaaien voordat collageen inbedding. (C). Neuronale uitgroei op dag 7 na het zaaien in de cel lichaam compartiment. (D) neuronale uitgroei op dag 7 na het zaaien in het axonale compartiment. Groen -. ΒIIITubulin Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

figure-results-4
Figuur 4. Verwachte opbrengst van (A) RNA en DNA, en (B) eiwit per construct in verhouding tot de hoeveelheid cellen uitgezet per steiger (± SD, n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Discussie

Hier beschreven we de richtlijnen voor het samenstellen van een gecompartimenteerd 3D hersen-achtig weefselmodel. Het model wordt gekenmerkt door een dichte gepolariseerde cultuur van neuronen die resulteert in de ontwikkeling van twee morfologisch verschillende compartimenten: een met dicht opeengepakte cellichamen en een tweede met zuivere axonale netwerken. Over het algemeen bootsen de architectuur van het scaffold en het groeipatroon hersenweefsel na, inclusief de zes lamellaire lagen en de witte stofbanen21.

Het donutvormige weefselmodel op basis van zijden eiwit maakt aanpassingen en afstemming van mechanische eigenschappen mogelijk, evenals veelzijdige structurele vormen, hydrogelvullers en cellulaire componenten. Daarom vormt dit weefselmodel een basisplatform voor een breed scala aan onderzoeken. Zijde is een gunstige kandidaat voor biomateriaalplatforms vanwege zijn biocompatibiliteit, verwerking op waterbasis en robuuste mechanische en afbraakeigenschappen22. De zijden matrix dient ook als stabiel anker om de contractie van collageengels in de loop van de tijd in cultuur te verminderen. De eigenschappen zoals zijdeconcentratie en porositeit van het in dit model gebruikte scaffold zijn eerder aangepast om optimale celgroei en mechanische eigenschappen te bereiken, wat resulteert in een hersen-achtige weefselelasticiteit18,23,24. We raden aan deze parameters constant te houden om het succesvolle resultaat en de reproduceerbaarheid van de experimenten te waarborgen.

De vorming van een 3D neurologisch netwerk werd bereikt door twee soorten biomaterialen met verschillende mechanische eigenschappen te combineren: een stijf scaffold om neurologisch verankering te bieden en een zachter gelmatrix om axonpenetratie en connectiviteit in 3D mogelijk te maken. Selectieve materiaalvoorkeuren van het zijde scaffold en zachte hydrogel bieden het onderliggende principe voor het gecompartimentaliseren van de neuronen van de axonverbindingen. Vanwege de inerte aard van het zijde scaffold is functionering met poly-D-lysine vereist voor neurale hechting. Er kunnen echter ook andere cel-adhesiebevorderende factoren worden toegepast, zoals RGD25 of fibronectine26. Om de vorming van het 3D netwerk te bereiken, moet het zijde scaffold tijdig worden gevuld met hydrogel zodra neuronen aan het scaffold zijn gehecht. Evenzo kan de collageenmatrixvuller worden vervangen door andere hydrogels, waardoor het mogelijk wordt om de invloed van 3D extracellulaire omgevingen op axonnetwerkvorming te bestuderen als platform om nieuwe hydrogels te evalueren op neurologische compatibiliteit. Bovendien kunnen, naast ratten corticale neuronen, andere neuronale bronnen zoals hippocampale neuronen of geïnduceerde pluripotente cel (iPSc)-afgeleide neuronen worden gebruikt. Bovendien kan het weefselmodel worden gebruikt om heterocellulaire interacties te bestuderen door gliacellen samen met neuronen op te nemen en om complexer hersen-achtig weefsel te bouwen.

Zoals eerder is aangetoond, kan ons model worden gebruikt om neurale functionaliteit in een 3D-micro-omgeving te evalueren met behulp van een verscheidenheid aan tests zoals celviabiliteit, genexpressie, LC-MS/MS en elektrofysiologie, waardoor de fysiologische relevantie van het model wordt aangetoond18. Andere methoden, die vaak worden gebruikt om 3D weefsel-geengineerde constructen te evalueren, zoals immunokleuring en microscopie8,9,11, kunnen ook worden gebruikt om de celdistributie en de mate van axonnetwerkvorming te beoordelen. Er moet echter worden opgemerkt dat vanwege de hoge dichtheid van de collageenmatrix, de penetratie van antilichamen en de diepte van de beeldvorming beperkt is tot enkele honderden micrometer. Bovendien kan de signaal-ruisverhouding worden beïnvloed door niet-specifieke achtergrondfluorescentie. Dit kan worden overwonnen door lipofiele celtracers en genetisch tot expressie gebrachte fluorescente eiwitten te gebruiken, wat de behoefte aan immunokleuring vermindert11. Alternatief kan de beeldvorming worden uitgevoerd met 2-fotonmicroscopie in plaats van de gebruikelijke een-fotontechniek, wat het signaalverlies, fotobleken, kan verminderen en kan worden uitgebreid tot enkele honderden micrometer diepte.

Kortom, het op zijde en collageen gebaseerde hersen-achtige weefsel biedt een robuust platform om neuronale netwerken in 3D te bestuderen en is een startpunt voor de ontwikkeling van meer geavanceerde modellen van neurologische stoornissen in de toekomst. Onafhankelijk van de evaluatiewijze ondersteunt de relatieve eenvoud van dit weefselmodel zijn bruikbaarheid, succes en reproduceerbaarheid.

Openbaarmakingen

Publicatie van deze video-artikel wordt gesponsord door Corning.

Dankbetuigingen

We danken het laboratorium van Dr. Stephen Moss voor het verstrekken van embryonale rattenhersenweefsels. M.D.T. ontwierp het oorspronkelijke protocol. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. werd ondersteund met een postdoctorale beurs van de German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
MWCO 3500 dialysis cassettes Thermo Fisher66110
Heating plateFisher ScientificIsotemp
Centrifuge 5804 REppendorf
SieveFisher ScientificNo. 270, No. 35, No. 30
PTFE moldgemaakt in huis (Figuur 1) 10 cm diameter, 2 cm hoogte
NaClSigma-Aldrich71382
Biopsy Punch 5 mmWorld Precision Instrument501909
Biopsy Punch 2 mmWorld Precision Instrument501908
poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-5MGeindconcentratie 10 μg/ml, opgelost in water
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
TrypsinSigma-AldrichT4049-500ML
DNaseRoche10104159001eindconcentratie 0,3%
Soybean proteinSigma-AldrichT6522-100MGeindconcentratie 1 mg/ml
Neurobasal mediumGibco21103049opwarmen tot 37 °C voor gebruik
B27 supplement 50xGibco17504-044
GlutamaxGibco35050-061
Penicilin StreptomycinCorning30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mgCorning354236eindconcentratie 3 mg/ml
NaOHSigma-AldrichS2770corrosief
Propidium IodideSigma-AldrichP4170-10MGtoxisch
Fluorescein DiacetateSigma-AldrichF7378-5G
Olympus MVX10Olympus
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148toxisch, eindconcentratie 4%
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-10G
anti-βIIITubulin antibody Sigma-AldrichT2200konijn 1:500
anti-rabbit Alexa-546Molecular ProbesA11010geit 1:250
goat serumSigma-AldrichG9023-5ML
Leica SP2 confocal microscopeLeicaobjectief 20X
QIAshredderQiagen79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini KitQiagen80004
Ethyl alcohol, PureSigma-AldrichE7023 
2-MercaptoethanolSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific
BCA protein assayThermo Scientific23225
Plate reader Spectramax M2Molecular Devicesabsorptie 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-typeTedPella1346

Referenties

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D hersenachtig weefselzijde collageen scaffoldneuronale celkweekconfocale microscopieimmunofluorescentiekleuringcorticale neuronen van rattenaxonale groeilokalisatie van het cellichaamweefseltechniekvorming van neurale netwerken
Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.