Modellen voor trombo-embolische beroertes zijn essentiële hulpmiddelen voor het optimaliseren van de recanalisatietherapie. Hier beschrijven we een muismodel voor trombotische beroerte gebaseerd op een tijdelijk cerebraal hypoxisch-ischemisch (tHI) letsel, dat trombose en infarct veroorzaakt en gunstig reageert op weefselplasminogeenactivator (tPA)-gemedieerde fibrinolyse in een therapeutisch venster vergelijkbaar met dat bij beroertepatiënten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Trombotische Stroke model op basis van Transient Cerebrale hypoxie-ischemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stroke onderzoek heeft vele tegenslagen doorstaan in het vertalen van neuroprotectieve therapieën in de klinische praktijk. In tegenstelling, de echte therapie (tPA trombolyse) produceert nauwelijks voordelen mechanische occlusie gebaseerde experimentele modellen die preklinisch onderzoek beroerte domineren. Deze splitsing tussen de bank en bed suggereert de noodzaak om tPA-responsieve modellen in dienst in preklinische beroerte onderzoek. Hiertoe wordt een eenvoudige en tPA-reactieve trombotische slagmodel uitgevonden en hierin beschreven. Dit model bestaat uit transiënte occlusie van de eenzijdige halsslagader en levering van 7,5% zuurstof via een gezichtsmasker bij volwassen muizen gedurende 30 min, terwijl de rectale temperatuur dier op 37,5 ± 0,5 ° C. Hoewel reversibele ligatie van de eenzijdige halsslagader of hypoxie elke onderdrukte hersenbloedstroom alleen transiënt, de combinatie van beide beledigingen heeft langdurige reperfusie stoornissen, fibrine en bloedplaatjes afzetting en grote infarct in het midden cerebrale slagader geleverd grondgebied. Belangrijk-staartader injectie van recombinant tPA op 0,5, 1, of 4 uur na Thi (10 mg / kg) die tijdsafhankelijke vermindering van de sterfte en de infarctgrootte. Dit nieuwe slagmodel is eenvoudig en kan worden gestandaardiseerd laboratoria experimentele resultaten te vergelijken. Verder induceert trombose zonder craniectomy of invoering voorgevormde embolie. Gezien deze unieke verdiensten, de THI-model is een nuttige aanvulling op het repertoire van preklinisch beroerte onderzoek.
Inleiding
Trombolyse recanalization is de meest effectieve behandeling van acute ischemische beroerte in de klinische praktijk 1. Maar de meeste preklinische neuroprotectie onderzoek werd uitgevoerd in een tijdelijke mechanische obstructie model (intraluminale hechtdraad middelste cerebrale arterie occlusie) dat snelle herstel van de cerebrale bloedstroom bij verwijdering van de vasculaire occlusie produceert en vertoont weinig of geen voordelen met tPA trombolyse. Er is gesuggereerd dat de twijfelachtige keuze takt modellen droegen, ten minste gedeeltelijk, de moeilijkheid bij het vertalen neuroprotectieve therapie bij patiënten 2,3. Daarom is er een toenemende roep om het gebruik van tPA-responsieve trombo-embolische beroerte modellen in preklinisch onderzoek, maar dergelijke modellen hebben ook technische problemen (zie Discussie) 4-7. Hier beschrijven we een nieuw trombotische beroerte model gebaseerd op eenzijdige voorbijgaande hypoxie-ischemie (THI) belediging en haar antwoorden op intraveneuze tPA therapie 8.
De THI beroerte model werd ontwikkeld op basis van de Levine procedure (permanente ligatie van de eenzijdige gemeenschappelijke halsslagader, gevolgd door blootstelling aan voorbijgaande hypoxie in een kamer), die werd uitgevonden voor experimenten met volwassen ratten in 1960 9. De oorspronkelijke Levine procedure vervaagde in de vergetelheid, omdat alleen produceerde variabele hersenschade, maar dezelfde insult veroorzaakt consistente neuropathologie knaagdieren pups toen het werd opnieuw geïntroduceerd door Robert Vannucci en zijn collega's als een model van neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie (HIE) in 1981 10. In de afgelopen jaren zijn sommige onderzoekers opnieuw aangepast de Levine-Vannucci model volwassen muizen door het aanpassen van de temperatuur van de hypoxische kamer 11. Het is aannemelijk dat de inconsistente hersenletsels in het oorspronkelijke Levine kunnen opkomen van wisselende lichaamstemperaturen van volwassen knaagdieren in de hypoxische kamer. Om deze hypothese te testen, hebben we de Levine procedure gewijzigd door het toedienen van hypoxische gasvia een gezichtsmasker, terwijl de knaagdieren kerntemperatuur bij 37 ° C op de operatietafel 12. Zoals verwacht stringente lichaamstemperatuur sterk toegenomen reproduceerbaarheid van HI-geïnduceerde hersenpathologie. De HI belediging triggers ook coagulatie, autofagie en grijs- en witte stof letsel 13. Andere onderzoekers hebben ook gebruik van de HI model om na een beroerte ontstekingsreacties 14 onderzoeken.
Een uniek kenmerk van de HI slagmodel is dat volgt de Virchow triade van trombusvorming, waaronder de stasis van de bloedstroom, endotheliale schade (bijvoorbeeld door HI-geïnduceerde oxidatieve stress) en hypercoagulabiliteit (HI-geïnduceerde bloedplaatjesactivering) ( Figuur 1A) 15. Als zodanig kan de HI model sommige pathofysiologische mechanismen om real-world herseninfarct relevant vast te leggen. Met dit idee in het achterhoofd, hebben we verder verfijnd de HI model met omkeerbare ligatie van de VNilateral carotis communis (dus een voorbijgaande HI insult te maken), en getest zijn reacties op tPA trombolyse met of zonder Edaravone. Edaravone is een vrije radicalen die al in Japan goedgekeurd voor ischemische beroerte binnen 24 uur na het begin 9 behandelen. Onze experimenten toonden aan dat zo kort 30 min voorbijgaande HI triggers trombotische infarct, en dat gecombineerd tPA-Edaravone behandeling verleent synergetische 8 voordelen. Hier beschrijven we gedetailleerde chirurgische procedures en methodologische overwegingen van het THI-model, dat gebruikt kan worden om reperfusie behandeling van acute ischemische beroerte optimaliseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol wordt goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Emory University en volgt de National Institutes of Health Leidraad voor Zorg en gebruik van proefdieren.
1. Setup
- Bereid de chirurgische bed verwarmingskussen verbonden met warmtepomp bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten voor de operatie. Plaats een nek roll met het vat van 3 ml spuit op de chirurgische bed. Bereid de verdoving gas met 2% isofluraan in de medische lucht.
- Bereid geautoclaveerd pincet, schaar, micro naald houders, hemostat, wattenstaafjes en hechtingen. Bereid weefsel lijm en oogzalf.
- Stel de hypoxie-systeem en temperatuurregelaars met warmtelamp en rectale sonde. Bereid hypoxie gas met 2% isofluraan in 7,5% O 2 evenwicht met 92,5% N 2.
- Een uur voor de operatie worden muizen analgesized door subcutane injectie van een langzame-afgifte Meloxicam (4,0 mg / kg).
2. Voorbijgaande cerebrale hypoxie-ischemie (Figuur 1B)
- Verdoven 10-13 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een gewicht van 22-30 g in de anesthesie inductie kamer met 3% isofluraan totdat het dier niet reageert op de voet knijpen, en verwijder het haar op rechts nek met behulp van een elektronische scheerapparaat.
- Plaats muizen op de chirurgische bed verbonden met 2% isofluraan in medische lucht stroomsnelheid van 2 l / min. Secure voorpoten uitgestrekt langs de hals roll aan de zijkanten met behulp van medische tape.
- Reinig de chirurgische site voor incisie met betadine, gevolgd door alcohol en vervolgens wattenstaafjes.
- Onder dissectiemicroscoop, maken een 0,5 cm rechter cervicale incisie met behulp van een rechte tang en een micro schaar ongeveer 0,2 cm lateraal van de middellijn huid.
- Gebruik een paar fijne getande tang om uit elkaar trekken van de fascia en weefsel om de juiste gemeenschappelijke halsslagader (RCCA) bloot te leggen. Zorgvuldig scheiden de RCCA van de nervus vagus met een paar fijne gladde tang.
- Levende knoop twee voorgesneden 5-0 zijden hechtdraad (vrijgeefbare) op de RCCA, en naai de huid met behulp van 4-0 nylon monofilament hechtdraad (figuur 1C).
- Breng oogzalf beide ogen tot droog voorkomen.
- Snel overdracht van de muizen aan hypoxie-systeem en zet de neus en mond in het gezicht-masker met 2% isofluraan in 7,5% O 2 bij stroomsnelheid van 0,5-1 L / min gedurende 30 min.
- Tijdens hypoxie, gebruiken temperatuurregelaars met verwarming lampen om de rectale temperatuur regelen op 37,5 ± 0,5 ° C. Bewaken van de ademhaling bij 80-120 ademhalingen / min. Het onderhoud van de lichaamstemperatuur boven 37 ° C tijdens de hypoxie belangrijk is dat de herseninfarct maken. Lage ademhalingsfrequentie gebeurt meestal na 20 min hypoxie. Verwijder de face-masker en laat normale luchttoevoer als de ademhaling lager is dan 40. Dit duurt 1-2 minuten en telt niet mee in de 30 min hypoxie duur.
- Na hypoxie, overdragenmuizen om een chirurgische bed en laat de twee hechtingen uit RCCA. Sluit de wond met behulp weefsellijm, en muizen terug naar de kooi. Uitsluiten de dieren als zowel van twee live knopen worden onverwacht vrijgelaten na hypoxie.
- Controleer de muizen gedurende 5-10 minuten om te herstellen van hypoxie en anesthesie. Leg de natte voedsel in de kooi en terug te sturen naar dier zorginstelling.
Opmerking: Dieren die milde tot ernstige cirkelen gedrag op 24 uur na Thi zijn gecorreleerd met de hersenen overtreding. De meeste dieren met epileptische symptomen sterven voordat de 24 uur na het tijdstip THI.
3. Laser Speckle Contrast Imaging
Noot: Hoewel dit geen essentiële werkzaamheden van het THI-model kan een tweedimensionaal laser speckle contrast beeldvormingssysteem 16 worden gebruikt om de veranderingen van de cerebrale bloedstroom (CBF) karakteriseren tijdens of na transiënte hypoxie-ischemie. Om de wijzigingen van de CBF onmiddellijk document onder Thi, record na de step 2.6. Alternatief CBF herstel vergelijken na Thi insult Deze procedures kunnen worden uitgevoerd na de stap 2.10.
- Een verdoofde muis in buikligging en uitvoeren van een 1 cm lange middellijn incisie op de hoofdhuid met de schedel bloot maar ongeopend.
- Monitor CBF in beide hersenhelften onder een bloedtoevoer imager volgens het protocol van de fabrikant en beginnen met het opnemen van de bloedtoevoer naar de hersenen direct na de CCAO chirurgie (stap 2.6). Doorgaan voor 50 min.
- Weergeven CBF afbeelding met arbitraire eenheden in een 16-kleurenpalet en analyseren real-time de geselecteerde gebieden met de MoorFLPI software instructies van de fabrikant (figuur 2).
- Na het opnemen van de CBF, sluit de hoofdhuid met weefsellijm en terug te keren het dier naar de kooi.
4. tPA Administration
- Injecteer dieren in de staartader met het oplosmiddel of 10 mg / kg recombinant tPA (220-300 &# 956, l van 1 mg / m tPA) en 0,5, 1 of 4 uur na tCCAo plus hypoxia (figuur 4).
5. Brain Damage Detection met verschillende opties
Opmerking: Om de hersenen monsters verzamelen, euthanaseren de muizen op 1, 4 of 24 uur na THI.
- Voer kwantificering van infarctvolume door in vivo 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride methode (TTC) bij 24 uur na Thi belediging als eerdere beschreven. 17
- Intraperitoneaal injecteren van dieren met 1,4 M mannitol oplossing (~ 0,1 ml / g lichaamsgewicht) 30 minuten vóór transcardial perfusie. Transcardial perfuseren muizen met PBS, gevolgd door 10 ml 2% TTC.
- Verwijder de hersenen van dieren met chirurgische instrumenten na 10 minuten en plaats in 4% paraformaldehyde voor bevestiging nachts en in sectie 1 mm dik met een vibratoom.
- Snap een serie van vier doorsnede hersenen dia's door digitale microscoop en quantify het infarctvolume als de verhouding van het infarctgebied (wit gebied rechts) op het gebied van de onbeschadigde, contralaterale hemisfeer met de ImageJ software.
- Ook het uitvoeren van trombose vorming door immunofluorescentie op 1 uur na Thi belediging.
- Bevries de vaste hersenen in oktober verbinding en deel de hersenen bij 12 micrometer dikte met behulp van een cryostaat.
- Incubeer de hersenen dia met konijnen anti-fibrinogeen-antilichaam (1: 100) gevolgd door geit anti-konijn Alexa Fluor 488 kleurstof (1: 200) om de fluorescentie mbt een fluorescentiemicroscoop.
- Als alternatief voeren vaartuig obstructie door staartader injectie van 100 ul 2% Evans blauwe kleurstof bij 4 uur na THI belediging.
- Euthanaseren de muizen en snel snijden het hoofd naar de hersenen te verwijderen in 4% paraformaldehyde na Evans blauw injectie. Opmerking: Het duurt 5-10 minuten voor Evans blauwe circulatie met blauwe kleur van zowel de voor- en achterpoten.
- Sectiop vaste hersenen bij 100 micrometer dikte met behulp van een sledemicrotoom en observeer de fluorescentie met een emissie filter 680 nm op een fluorescentiemicroscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tweedimensionaal laser speckle contrast imaging (LSCI) 16 werd toegepast om de veranderingen van de cerebrale bloedstroom (CBF) vergelijken door 30 min transient eenzijdige carotis occlusie (tCCAO), 30 min blootstelling aan hypoxie (7,5% zuurstof) en 30 min eenzijdige carotis ligatie onder hypoxie (THI). Dit experiment toonde dat tCCAO onder normoxie onderdrukte de CBF de carotide geligeerd halfrond ~ 50% boven de basislijn, die snel hersteld tot boven 85% na de vrijgave van de carotis occlusie (R in ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beroerte is een belangrijk gezondheidsprobleem van groeiende betekenis voor elke samenleving met een vergrijzende bevolking. Wereldwijd, een beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak met een geschatte 5,9 miljoen fatale gebeurtenissen in 2010, wat overeenkomt met 11,1% van alle sterfgevallen 18. Stroke is ook de derde belangrijke oorzaak van disability adjusted life years (DALY's) verloren wereldwijd in 2010, een stijging van de vijfde positie in 1990 19. Deze epidemiologische gegevens o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de NIH-subsidie NS074559 (aan C. K.). We danken alle medewerkers die hebben bijgedragen aan onze onderzoeksartikelen waarop de huidige methodologierapport is gebaseerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weken oud (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesie |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesie |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesie |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxie systeem |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxie systeem |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperatuurregelaars |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperatuurregelaars |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | chirurgische opstelling |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | chirurgische opstelling |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | chirurgisch instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | chirurgisch instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | chirurgisch instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | chirurgisch instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | chirurgisch instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | chirurgische benodigdheden |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | chirurgische benodigdheden |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | chirurgische benodigdheden |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | oogdroogte preventie |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laserbron | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | hersensectie voor in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | hersenbeeldvorming |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | hersensectie voor IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Vasculair perfusie detecteren |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | hersensectie voor histologie |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasie |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID pijnstilling |
Referenties
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807(2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
