Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Samenvatting

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Samenvatting

Om te voldoen aan de zevende wijziging van de cosmeticarichtlijn en de Europese REACH-wetgeving van de EU, worden gevalideerd niet-dierlijke alternatieve methoden voor een betrouwbare en nauwkeurige evaluatie van oculaire toxiciteit bij de mens nodig. Om aan deze behoefte te pakken, hebben we een oogirritatietest (EIT), dat een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model dat gebaseerd is op de normale menselijke cellen maakt gebruik ontwikkeld. Het EIT is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS Geen Categorie) vereisen scheiden. De test maakt gebruik van twee afzonderlijke protocollen, die is ontworpen voor vloeibare chemicaliën en een tweede, soortgelijk protocol voor vaste testartikelen. Het EIT voorspellingsmodel maakt gebruik van een enkele periode blootstelling (30 min voor vloeistoffen, 6 uur voor vaste stoffen) en een enkele levensvatbaarheid van het weefsel cut-off (60,0% zoals bepaald door de MTT-test). Op basis van de resultaten van 83 chemicaliën (44 vloeistoffen en vaste stoffen 39) EIT bereikte 95,5 / 68,2 / 81,8% en sensItivity / specificiteit en nauwkeurigheid (SS & A) voor vloeistoffen, 100.0 / 68.4 / en 84,6% SS & A voor vaste stoffen, en 97,6 / 68,3 / en 83,1% voor de totale SS & A. Het EIT zal in belangrijke mate bijdragen aan de indeling van de oogirritatie potentieel van een breed scala van vloeibare en vaste stoffen, zonder het gebruik van dieren voor het testen van de regelgeving te voldoen. De EpiOcular EIT methode werd in 2015 geïmplementeerd in de testrichtsnoeren OESO TG 492.

Inleiding

Consumentenproducten zoals cosmetica, wasmiddelen en schoonmaakmiddelen omvatten een verscheidenheid van chemische stoffen die ernstige schade kan veroorzaken als ze contact met de ogen. Daarom is het testen van deze middelen voor oogirritatie vereist door de VS en de EU regelgevende instanties om de veiligheid van de consument ^{1 te garanderen.} Een beoordeling van de oogirritatie potentieel van mengsels en formuleringen is ook een vereiste voor de naleving van REACH (Registratie, Evaluatie, Autorisatie en beperking van chemische stoffen) wetgeving voor de etikettering van cosmetische ingrediënten in het kader van de EU-cosmetica voor het vervoer van chemische producten, en voor de etikettering van pesticiden en huishoudelijke producten ^2. Momenteel, regelgevende instanties nodig oculaire gevaren met behulp van het wereldwijd geharmoniseerd systeem voor de indeling en etikettering van chemische stoffen (GHS) ^3. GHS is voornamelijk gebaseerd op de Draize oogirritatie test, de meest gebruikte oogirritatie assay waarin vreemde stoffen en mixtures worden direct ingebracht in de conjunctivale zak van het konijnenoog ^4. Volgens GHS-classificatie, GHS-categorie 1 (oculair corrosieve) verwijst naar chemische stoffen die ernstige initiële letsel veroorzaken aan het oog weefsels of ernstige schade aan het oog en de visie die niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na blootstelling ^3,5 testen. GHS-categorie 2 verwijst naar chemische stoffen die significante veranderingen in het oog dat zijn volledig omkeerbaar binnen 21 dagen van de blootstelling te produceren testen. Chemicaliën test die geen corrosieve of irriterende stoffen worden aangeduid als GHS Geen categorie.

Al meer dan 40 jaar, heeft het konijn Draize oogtest is bekritiseerd voor zijn gebrek aan reproduceerbaarheid, overschatting van menselijke reacties, en het gebruik van levende dieren ^5-8. Deze zorgen hebben vele voorstellen voor verbetering en vermindering, en vervanging van de in vivo proef ⁹ aangemoedigd. De behoefte aan gevalideerde niet-dierlijke alternatieven werd verder versterktdoor de goedkeuring van het zevende amendement op de cosmeticarichtlijn, die het gebruik van dieren in de beoordeling van de veiligheid van cosmetische producten (in 2005) verboden en ingrediënten (in 2009) ^2.

Sinds 1996 is de gereconstrueerde cornea-achtig weefsel model op grote schaal gebruikt door de cosmetische industrie om het irritatie potentieel van grondstoffen, oppervlakteactieve stof gebaseerde formuleringen te evalueren, en samengestelde mengsels die zijn ontworpen voor gebruik in of in de nabijheid van het oog ^10-13. Gebruik van het RHCE weefsel model maakt het mogelijk direct actuele toepassing van het testmateriaal op het weefsel oppervlak in zijn oorspronkelijke, onverdunde vorm. Op deze wijze kan niet in water oplosbare preparaten worden getest zonder ze te verdunnen met oplosmiddelen. In antwoord op EURL ECVAM (Europese Unie referentielaboratorium Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden) verzoek om een ​​breed toepasbaar, eenvoudig, en economische methode van de oogirritatietest (EIT), dat gebruik maakt van een single belichtingstijd en is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen te scheiden van materialen die niet etikettering nodig hebben ontwikkeld (figuur 1) ^14. Op basis van de resultaten van 83 chemicaliën (44 vloeistoffen en 39 vaste stoffen), het EIT bereikte 95,5 / 68,2 / en 81,8% sensitiviteit / specificiteit en nauwkeurigheid (SS & A) voor vloeistoffen, 100,0 / 68,4 / en 84,6% SS & A voor vaste stoffen en 97,6 / 68.3 / en 83,1% voor de totale SS & A.

In 2007, een multi-laboratorium pre-validatie studie gesponsord door Cosmetics Europe (voorheen Colipa) onder auspiciën van de EURL ECVAM geëvalueerd de relevantie en betrouwbaarheid van het EIT met het doel om het te brengen formele bevestiging ^15. In deze studie werden 298 onafhankelijke studies uitgevoerd in zeven onafhankelijke laboratoria. Studie resultaten toonden 99,7% overeenkomst voorspelling met een lage coëfficiënten van variatie tussen alle deelnemende laboratoria ^15. Als gevolg daarvan in 2010 het EIT protocol ging een formele EURL ECVAMvalidatie programma. De validatie studie gebruikte 104 gecodeerd testchemicaliën, met inbegrip van afzonderlijke stoffen en chemische mengsels, die in vivo referentiegegevens (Draize oogirritatie gegevens) beschikbaar waren. Op basis van het succes van dit werk, werd een OESO-ontwerp testrichtsnoer ingediend in 2014. Verwacht wordt dat het EIT aanzienlijk zal bijdragen aan de indeling van oogirritatie potentieel van een breed scala van materialen volgens de VN-GHS-indeling en etikettering systeem.

Protocol

1. Voorbereiding van het RHCE weefsels voor de behandeling - dag 0

1. Na ontvangst van de commerciële menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) kit, controleer alle kit onderdelen voor integriteit (voor kit details Standard Assay Kit Components (tabel 1) en apparatuur en materialen die nodig zijn om het EIT assay (tabel 2) uit te voeren. Op de dag van ontvangst, evenwicht weefsels (in zijn 24-en scheepvaart container) aan RT gedurende 15 min.

Bedrag	Reagens	Voorwaarden	Bron	Beschrijving	Houdbaarheidsdatum
1	Verzegelde 24-well plaat van EpiOcular weefsels (OCL-200)	2-8 ° C	MatTek	Bevat 24 tissUES van celkweek inserts, pakket op agarose	72 hr
1 fles, 200 ml	EpiOcular proefmedium (OCL-200-ASY)	2-8 ° C	MatTek	DMEM medium op basis	21 dagen
1 fles, 100 ml	Ca ++ Mg ++ -Gratis Dulbecco's-PBS (DPBS)	RT	Sigma-Aldrich, D5652 of equiv.	Gebruikt voor het spoelen van inserts	1 jaar
4	6-well platen	RT	Valk	Gebruikt voor het behoud van de weefsels tijdens assay-protocol	NA
2	12-well platen	RT	Valk	Gebruikt tijdens assay-protocol	NA
2	24-well platen	RT	Valk	Gebruikt MTT assay uit te voeren	NA
1 flacon, 0,5 ml	Methylacetaat (CAS # 79-20-9)	RT	Sigma-Aldrich, Cat # 186325	Gebruikt als PC in de assay	1 maand

Tabel 1: standaard Assay Kit Components.

/ Materiaal	Nodig voor:
Bevochtigde incubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ± 10% vochtigheid)	Incuberen weefsels voorafgaand aan en tijdens assays
Laminaire stroming kap	Veilig werken onder steriele omstandigheden
Vacuümpomp (optioneel)	Opzuigen medium en oplossingen
Plate reader-fotometer (96 putjes)	Reading OD
Plaat shaker	Extraction van formazan
Steriel, stompe randen tang	Omgaan met weefsel inserts
Stophorloges	Termijn voor de toepassing van de test materialen en andere getimede stappen in het protocol
Waterbad (37 ± 1 ° C)	Warming media en MTT oplossing
Mortier en een stamper	Slijpen korrelige vaste stoffen
Verdringerpomp pipet (50 ui)	Toepassing van viskeuze en halfvaste stoffen en suspensies
Instelbare pipetten (200 gl-2 ml)	Aanbrengen van vloeibare materialen, assaymedium en MTT
Pre-gesteriliseerde tips (200 ul en 20 ul), Rainin Cat # HR-200F en HR-20F (of gelijkwaardig)	Aanbrengen van vloeibare materialen, assaymedium en MTT
Brede opening pre-gesteriliseerde tips (250 pl), Rainin Cat # HR-250WS (of equivalentalent)	Toepassing van viskeuze en halfvaste stoffen en suspensies
8 oz / 220 ml specimen containers, Falcon Cat # 3.540.200 (of gelijkwaardig)	Spoelen weefsels
Steriel eenmalig gebruik spuiten (bijvoorbeeld 1 ml tuberkulin spuit Omnifix-F, B. Braun AG, kat. No. 9161406V)	Levering van ~ 50 mg vaste stoffen (optioneel)
Ted Pella micro spatel / lepel, Ted Pella Inc, Cat # 13504 (of gelijkwaardig, scherpe lepel of bot curette, bv Aesculap, No: FK 623)	Levering van ~ 50 mg vaste materialen
Ca ++ en Mg ++ vrij Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (Ca ++ Mg ++ vrije-DPBS): Sigma-Aldrich, Cat # D5652 (of equivalent)	Spoelen weefsels tijdens test
Steriel gedemineraliseerd water, weefselkweek waardering (kwaliteit biologische of gelijkwaardig)	Gebruik als NC
96-well platbodem platen Falcon (of equivalent)	Voor het lezen OD
Wattenstaafje swaps (steriele)	Voor het drogen van het weefseloppervlak (optioneel)
Plakband of Parafilm	Afdekplaten tijdens formazanproduct extractie
MTT-100 testkit	Bevat MTT thiazolyl tetrazolium bromide reagens (Sigma # M-5655) en isopropanol extract.

Tabel 2: Apparatuur en materialen die nodig zijn om het EIT uit te voeren.

2. Onder steriele omstandigheden, open de plastic zak met de 24-wells plaat met het RHCE weefsels en verwijder het steriele gaasje. Inspecteer alle weefsels voor luchtbellen tussen de agarosegel en plaats. Niet kweken met luchtbellen onder het inzetstuk bedekking> 50% van het inzetstuk gebied defecte weefsels of weefsels while ch zijn volledig bedekt met vloeistof.
3. Label de 6-well platen met het testvoorwerp of controlecodes en blootstellingstijden. Aliquot 1,0 ml Assay Medium (geleverd bij de kit), voorverwarmd tot ca. 37 ° C, in de putjes van gelabelde 6-wells platen.
4. Gebruik steriele pincet om elke insert bevattende RHCE weefsel in het gelabelde 6-wells plaat verwijderen en het inzetstuk. Tijdens deze stap verwijdert alle resterende verzendkosten agarose dat zich aan de buitenzijde van het inzetstuk door zachte blotting op steriel filtreerpapier. Los eventuele luchtbellen gevangen onder de inserts.
5. Pre-incubeer het RHCE weefsels in de 6-well platen standaard kweekomstandigheden (SCC, vochtige atmosfeer met 5 ± _1% CO2 bij 37 ± 1 ° C) gedurende 1 uur.
6. Na 1 uur werd vervangen proefmedium met 1,0 ml vers proefmedium voorverwarmd tot 37 ° C en incubeer de RHCE weefsels bij SCC condities (overnight = O / N) (16-24 uur).

. ove_title "> 2 Pre-behandeling - Dag 1

1. Nadat de O / N incubatie toepassing 20 gl ^Ca2 + ^Mg2 + -vrij-Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, voorzien) met een geschikte inrichting pipetteren. Als de DPBS niet verspreid over de weefsels, tik het inzetstuk op de plaat te verzekeren dat de DPBS plast gehele weefseloppervlak.
2. Incubeer de RHCE weefsels bij SCC 30 ± 2 min.
   Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om weefselhydratie en te bootsen in vivo omstandigheden.

3. testmateriaal Blootstelling Procedures

1. Breng iedere testvoorwerp en controles RHCE weefsels dupliceren (n = 2). Het testvoorwerp doseringsprocedure verschilt vloeistoffen en vaste stoffen. Lokaal toepassen 50 ul van vloeistof testen artikelen met behulp van een pipet. De belichting voor vloeistoffen is 30 min. Breng 50 mg vast testvoorwerpen met een waterpas lepel (gekalibreerd om 50 mg natriumchloride houden). De ex-Posure tijd voor vaste stoffen is 6 uur.
   Opmerking: Vloeistoffen worden gedefinieerd als vloeibare stoffen (bijvoorbeeld vloeistoffen, gels en crèmes) die kunnen worden aangebracht onder toepassing van een inrichting pipetteren. Vaste stoffen worden gedefinieerd als niet-vloeibare stoffen (bijvoorbeeld poeders, harsachtige of wasachtige materialen) die niet kunnen worden aangebracht met een pipet.
   1. Indien de fysische toestand van te testen niet eenvoudig te bepalen, plaatst de vaatjes met testartikel in een waterbad gedurende 15 min (37 ° C). Volg EIT protocol voor vloeistoffen voor degenen testen artikelen die vloeibaar bij 37 ° C.
   2. Gebruik een positieve verplaatsing pipet voor bijzonder viskeuze materialen.
2. Dosis de negatieve controle en de positieve controles en daarna de dosis de test artikelen.
   1. Breng 50 gl van de negatieve controle (NC) en positieve controle (PC) het RHCE weefsels met een standaard pipet. De NC is steriel gedeïoniseerd water; de PC is methylacetaat (CAS # 79-20-9). Breng de NC en PC voor 30 min bij testening vloeibare testartikelen en gedurende 6 uur bij het testen van solid-test artikelen.

4. Test Artikel Exposure - Dag 1

1. Voor de behandeling van vloeistof testen artikelen, volg dan de timing schema in tabel 3. Laat 1 minuut intervallen tussen toepassingen van elke test artikel gelijke blootstelling voor alle weefsels te garanderen.
   1. Na 30 ± 2 min DPBS voorbehandeling, topisch 50 pl NC en PC, en elke vloeistof testvoorwerp dien lokaal op het RHCE weefsels met behulp van een geschikt apparaat pipetteren.
   2. Breng 50 gl van het testartikel vloeistof direct op het weefsel aan het bovenoppervlak bedekken. Afgesneden van de smalle punt van de pipet tip om de opening voor viskeuze materialen te verbreden. Voor zeer viskeuze materialen toepassen testartikel een doseerinrichting (een vlak geleide cilinder met een diameter enigszins kleiner dan de binnendiameter van het weefsel insert of a plastic punaise), keren de dosering device en plaats het op het weefsel, zodat de test artikel gelijkmatig contact van het weefsel oppervlak.
   3. Als testartikel niet verspreid over het weefsel, tik de insert om ervoor te zorgen dat het zich verspreidt over het hele weefsel oppervlak. Mechanische spreiding van de testartikelen (bijvoorbeeld met een pipet tip) wordt niet aanbevolen aangezien dit de weefsels beschadigen.
   4. Incubeer de weefsels bij SCC 30 ± 2 min.
2. Voor de behandeling van vaste testvoorwerpen - Dag 1, volgt de timing schema in tabel 4 Een 2 min intervallen tussen applicaties elk testvoorwerp gelijke belichting voor alle weefsels verzekeren..
   1. Na 30 ± 2 min DPBS voorbehandeling toepassen 50 pl NC en PC topisch op het RHCE weefsels met behulp van een geschikt apparaat pipetteren.
   2. Voor vaste testvoorwerp toepassing, verwijder de inzetstukken (n = 2) vanaf de put en plaats ze op een steriel oppervlak (bijvoorbeeld het deksel van amultiwell plaat) om een ​​test artikel morsen in het medium te voorkomen.
   3. Met behulp van een lepel genivelleerd, topisch ongeveer 50 mg van het testartikel op het weefseloppervlak toegepast; ervoor zorgen dat het oppervlak van het weefsel volledig bedekt het testvoorwerp. Als de test artikel niet verspreid over het weefsel, schud de insert zachtjes van links naar rechts om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt gedekt door de test artikel. Mechanische spreiding van de testartikelen (bijvoorbeeld met een pipet tip) wordt niet aanbevolen aangezien dit de weefsels beschadigen.
      1. Indien nodig, malen kristallijne poeders met een vijzel en stamper om beter contact tussen het testvoorwerp en het weefsel te garanderen.
      2. Als alternatief, plaats poeders direct op de weefselkweek in de insert met behulp van een 1 ml spuit met zijn kop afgesneden. Spul poeders in de spuit als de zuiger wordt getrokken terug en vervolgens toepassen door op de zuiger naar beneden.
      3. Wanneer de buitenwand van het inzetstuk contaminated bijvoorbeeld door poeders, veeg de deeltjes af met een steriel gaasje.
   4. Na het doseren, terug het weefsel de 6-well platen met kweekmedium en incubeer bij SCC gedurende 6 uur ± 15 min.

5. Spoelen

1. Bereid een reeks van drie schone bekers (150 ml) per test artikel en vul elk van hen met 100 ml DPBS. Voor elke test artikel, maken gebruik van een andere set van drie bekers.
2. Aan het einde van de 30 ± 2 min blootstelling voor vloeibare stoffen of 6 uur ± 15 min belichting voor vaste stoffen, te verwijderen en de doseerinrichting niet gebruiken als het gebruikt werd.
3. Til de inserts die het RHCE weefsel uit het medium door grijpen de bovenrand van de plastic 'kraag' met fijne tang. Gebruik gebogen pincet te hanteren en decanteren te vergemakkelijken. Spoel de weefsels twee tegelijk door het houden van de dubbele inserts samen met hun kragen behulp van een tang. Wees voorzichtig not naar de weefsels beschadigen met de tang.
4. Giet de test artikelen of controles uit het weefsel oppervlak op een schone absorberend materiaal (papieren handdoek, gaas, enz.)
5. Dompel de inserts in de eerste beker van DPBS, werveling in een cirkelvormige beweging in de DPBS gedurende ongeveer 2 seconden, til de inserts, zodat ze meestal worden gevuld met DPBS, en giet de vloeistof terug in de beker. Herhaal dit proces drie keer in de eerste beker.
6. Spoel de inzetstukken in de tweede en derde bekers DPBS drie keer per dezelfde wijze.
7. Decanteer de vloeistof die in het inzetstuk op het absorberende materiaal. Draai de insert om een ​​benaderende hoek van 45 ° (open einde naar beneden) en raak de bovenlip om het absorberende materiaal.
   Opmerking: Als het niet mogelijk is al het zichtbare testmateriaal verwijderen, geen verdere spoeling moet worden gedaan om weefselbeschadiging te voorkomen als gevolg van overmatig gebruik.

6. Post-weken

1. Na het spoelen,onmiddellijk onderdompelen weefsels in 5 ml proefmedium eerder opgewarmd tot KT in een gelabelde 12-wells plaat.
2. Incubeer de weefsels gedurende 12 ± 2 min voor vloeibare stoffen of 25 ± 2 min voor vaste materialen ondergedompeld bij kamertemperatuur om de verwijdering van alle resterende testartikel vergemakkelijken.

7. Post-incubatie

1. Aan het einde van de post-Soak onderdompelingsperiode, giet het proefmedium uit de weefsels en dep inzetstukken op een absorberend materiaal.
2. Breng de inserts in de gelabelde 6-wells plaat met 1 ml warm Assay Medium.
   1. Incubeer de weefsels voor 120 ± 15 min bij SCC voor vloeibare testmaterialen.
   2. Incubeer de weefsels voor 18 ± 0.25 uur bij SCC voor vaste testmaterialen.

8. MTT Levensvatbaarheid test - Dag 1 (Protocol voor vloeistoffen) en Dag 2 (Protocol voor Solids)

1. Voer de MTT-test na de Post-incubatie van 12077; 15 min voor vloeistoffen en 18 ± 0.25 uur voor vaste stoffen, respectievelijk.
2. Bereid 1,0 mg / ml MTT-oplossing en 0,3 ml aliquot van de oplossing in elk putje van een gelabelde 24-wells plaat.
   1. Gebruik de MTT commerciële kit (Tabel 5):
   2. 2 uur voor gebruik ontdooien de MTT concentraat bij KT. Combineer 2 ml van MTT concentraat en 8 ml van de MTT verdunningsmiddel 1,0 mg / ml MTT-oplossing leidt.
   3. Bewaar de MTT oplossing bij 4 ° C in het donker tot gebruik. Laat de MTT-oplossing voor meer dan 1 dag niet op te slaan.
3. Aan het einde van het bericht Incubatie Verwijder elke insert van de 6-well plaat en zachtjes vlek op een absorberend materiaal.
4. Plaats de inserts in de 24-wells plaat met 0,3 ml MTT-oplossing. Los eventuele luchtbellen gevangen onder de inserts. Incubeer de plaat gedurende 180 ± 10 min bij SCC.
5. MTT extractie
   1. Na 180 ± 10 min incubatie in de MTT-oplossing, verwijder elke insertvan de 24-well plaat en dep de onderkant van het inzetstuk op een absorberend materiaal.
   2. Voor niet-kleurstof vloeistof testartikelen (ondergedompeld extractie): Breng de inserts in een gelabelde 24-wells plaat met 2,0 ml van een extractiemiddeloplossing (isopropanol), zodat het onderdompelt het inzetstuk.
   3. Voor vaste stoffen en vloeibare verfsoorten (niet-ondergedompelde extractie om verontreiniging van de extractiemiddeloplossing voorkomen): Breng de inserts in een gelabelde 6-wells plaat met 1,0 ml van de extractiemiddeloplossing (isopropanol), zodat het niet het inzetstuk dompelen.
      Opmerking: Voer dezelfde niet-ondergedompelde opvraging overeenkomstige negatieve en positieve controles.
6. Dicht de platen (bijvoorbeeld met parafilm tussen de plaat deksel en bovenrand van de putjes of een standaardplaat sealer). Plaats de platen op een orbitale schudder plaat en schud gedurende 2 tot 3 uur bij RT om het MTT extraheren.
   1. Als alternatief, het uitvoeren van de winning O / N bij 2-876, C in het donker zonder schudden.
7. Voor niet-kleurstof vloeistof testartikelen (ondergedompeld extractie): Aan het eind van de extractieperiode, giet de vloeistof uit elke steek weer in de put en gooi de inzetstukken met RHCE weefsels.
   1. Meng het extract bevat en hevel twee 200 pi aliquots in de geschikte putjes van een gelabelde 96-well plaat volgens de plaat configuratie (figuur 2).
8. Voor vaste stoffen en vloeibare verfsoorten (niet-ondergedompelde extractie): Aan het eind van de extractieperiode, gooi het weefsel (de weefsels zorg ervoor dat niet doorboren).
   1. Voeg 1,0 ml van het extractiemiddel oplossing in elk putje van de 24-wells plaat met de oplossing geëxtraheerd uit de weefsels. Meng het extractiemiddel bevat en hevel twee 200 pi aliquots in de geschikte putjes van een gelabelde 96-well plaat volgens de plaat configuratie (figuur 2).
9. Bepaal tHij optische dichtheid (OD) van de geëxtraheerde monsters bij een golflengte tussen 550 en 590 nm (moet verenigbaar zijn binnen een laboratorium) op een plaatlezer of een spectrofotometer.
   1. Bij troebele oplossingen extract gevolg van onoplosbare vaste stoffen, centrifuge oplossingen voorafgaand aan het meten van de OD (afkoelen de centrifuge tot 4 ° C om verdamping te voorkomen). In het geval spoelen verwijdert niet de test artikel (TA) en de TA interfereert met MTT-reductie, moeten aanvullende controles worden gebruikt. Zie gedetailleerd SOP te corrigeren voor reductie van MTT ^16.
   2. Indien een TA blijkt te hebben, of kleur die kan samenwerken met de MTT metingen te ontwikkelen, moet een aanvullende test worden uitgevoerd om de hoeveelheid gebonden kleurstof te bepalen en vervolgens uit het weefsel geëxtraheerd. Verwijzen wij u naar een gedetailleerd SOP om te corrigeren voor gekleurde testartikelen ^16.

9. Berekeningen voor Tissue levensvatbaarheid Test (tabel 6 en figuur 3) & #160;

1. Algemene berekeningen
   1. Bereken de gemiddelde OD waarde van de blanco controleputjes (Blk OD) voor elk experiment.
   2. Trek OD Blk uit elk OD-waarde van hetzelfde experiment (Blk gecorrigeerde gegevens).
   3. Bereken het gemiddelde van de twee monsters voor elk weefsel (= gecorrigeerde OD).
2. Bereken het percentage levensvatbaarheid van elk van beide repliceren weefsels voor elke controle- en testvoorwerp opzichte van de gemiddelde negatieve controle (100% controle).
   Levensvatbaarheid (%) = [gecorrigeerde OD behandelde weefsels / gecorrigeerde OD negatieve controle] x 100%
3. Bereken het verschil van de levensvatbaarheid (de levensvatbaarheid verschil tussen twee duplo weefsels).
4. Bereken de gemiddelde testvoorwerp levensvatbaarheid (TA levensvatbaarheid) en classificeren testvoorwerp volgens voorspellingsmodel.

10. voorspellingsmodel (figuur 3)

1. Als de TA-behandelde weefsel levensvatbaarheid van> 60,0 opzichte NC-behandelde weefsel vANSPRAKELIJKHEID, etiketteren de test artikel als niet-irriterend (NI) (GHS geen categorie).
2. Als de TA-behandelde levensvatbaarheid van het weefsel is ≤ 60,0 ten opzichte van NC-behandelde levensvatbaarheid van het weefsel, het etiket van de testartikel als irriterend (I) (GHS-categorieën 1 en 2).
   Opmerking: Het EIT testresultaten worden gekwalificeerd als beschouwd:
   • het EIT NC OD> 0,8 en <2,5;
   • de EIT PC levensvatbaarheid van het weefsel (%, betrokken op NC) is ≤50.0%;
   • het verschil tussen de beide repliceren weefsels (NC, PC en testvoorwerp) is <20,0%.

Resultaten

Representatieve EIT resultaten uitgevoerd met 10 testartikelen (TA) en negatieve en positieve controles worden in tabel 6 en figuur 3. De gemiddelde OD = 1,31 voor de NC overeen met 100% levensvatbaarheid van het weefsel, dus de PC (gemiddelde OD = 0,41) hadden relatieve levensvatbaarheid van het weefsel van 31,2%. Wanneer het EIT protocol werd uitgevoerd in 15 geldige onafhankelijke experimenten in 7 laboratoria met behulp van de vloeistof blootstelling protocol en in 8 onafhankelijke geldige experimenten in 4 laboratoria, met behulp van de vaste belichting protocol, de gemiddelde levensvatbaarheid van het weefsel voor de PC met behulp van de vloeistof protocol was 36,4 ± 4,0 % en 32,3 ± 6,4% van de vaste stoffen protocol. In alle gevallen waren de positieve controleresultaten onder de afgesneden waarde van 60,0% ^15.

Zoals getoond in figuur 3, TA1, TA2, TA4, TA7 en TA8 had weefsel levensvatbaarheid> 60,0% en werden daarom als "NI". TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10 had weefsel levensvatbaarheid X04, 60,0% en werden daarom als "I". Het verschil van de levensvatbaarheid van het weefsel tussen dubbele weefsels was <20,0% voor alle TA met uitzondering van TA2. Daarom resultaten voor alle de test artikelen, met uitzondering van de TA2, werden beschouwd als "gekwalificeerd", omdat zij aan alle EIT acceptatiecriteria (paragraaf 10.2). Vanwege de hoge variabiliteit tussen dubbele weefsels voor TA2 in de eerste experiment werd een tweede experiment was nodig om gekwalificeerde EIT resultaten te verkrijgen.

Het EIT testmethode zoals hierin beschreven met behulp van het RHCE weefsel model werd gebruikt voor de beoordeling van oogirritatie in verschillende multilaboratory validatie studies, met inbegrip van formele validering door EURL ECVAM / Cosmetica Europa ^15,17-19. In alle studies werd het EIT getoond reproduceerbaar te zijn en was in staat om chemische stoffen (zowel stoffen en mengsels) niet vereist indeling en etikettering voor oogirritatie of ernstig oogletsel ac correct te identificerengens UN GHS ^15,17-19. Het EIT testmethode voldeden aan de acceptatiecriteria van de Validation Management Group (VMG) voor irritatie van de ogen voor de gevoeligheid, specificiteit en algemene nauwkeurigheid en momenteel wordt het in afwachting van de formele implementatie als een gedeeltelijke vervanging voor in vivo konijnen Draize-test ^19.

Figuur 1: Overzicht van het EIT protocol voor vloeibare en vaste testartikelen afkortingen gebruikt: AM, assaymedium;. SCC, standaard kweekomstandigheden; PBS, Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing; RT, kamertemperatuur.

Figuur 2:. De gestandaardiseerde 96-wells plaat configuratie voor de MTT-test weefsel levensvatbaarheid twee 200 pi aliquots zijn transferred aan de juiste putjes van een gelabelde 96-wells plaat. Afkortingen gebruikt: NC, negatieve controle; PC, positieve controle; TA1-TA20, testen artikelen 1-20; Blanco, extractiemiddeloplossing. 96- MTT plaat configuratie wordt gebruikt met Excel-spreadsheet ontworpen om RHCE levensvatbaarheid van het weefsel en EIT resultaten te berekenen.

Figuur 3: EIT resultaten verkregen voor 10-test artikelen, NC en PC controle met behulp van het RHCE weefsel model De grafiek wordt gegenereerd op basis van een Excel-spreadsheet ontworpen om EIT resultaten te presenteren.. Chemicaliën test die de levensvatbaarheid van het weefsel verlaagd ≤ 60,0% ten opzichte van NC worden als irriterend ingedeeld ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10) en test chemische stoffen die had levensvatbaarheid van het weefsel> 60,0% worden geclassificeerd als niet-Irriterende (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, en TA8).

Starttijd voor het EIT protocol werk stappen (een dag werk voor één operator)
Elke lijn correspondeert met een paar weefsels
Volgorde van de stappen:	1	2	3	4	5	6	7
Vloeistoffen:	PBS	TA Belichting	Post- Soak	Post- Incub.	MTT Reactie	MTT Extractie	Maatregel
	30 min	30 min	12 min	120 min	180 min	120 min	OD
NC	09:00	09:30	10:00	10:12	00:12	15:12	na
PC	09:01	09:31	10:01	10:13	00:13	15:13	17:30
TA-1	09:02	09:32	10:02	10:14	00:14	15:14
TA-2 </ strong>	09:03	09:33	10:03	10:15	00:15	15:15
TA-3	09:04	09:34	10:04	10:16	00:16	15:16
TA-4	09:05	09:35	10:05	10:17	00:17	15:17
TA-5	09:06	09:36	10:06	10:18	00:18	15:18
TA-6	09:07	09:37	10:07	10:19	00:19	15:19
TA-7	09:08	09:38	10:08	10:20	00:20	15:20
ng> TA-8	09:09	09:39	10:09	10:21	00:21	15:21
TA-9	09:10	09:40	10:10	10:22	00:22	15:22
TA-10	09:11	09:41	10:11	10:23	00:23	15:23

Tabel 3:. Sample tijdschema voor het testen van vloeibare testartikelen Protocol stappen inclusief pre-bevochtigen van de weefsels met DPBS, Toepassing van Test Artikelen (TAS), spoelen en Post-weken, Post-incubatieperiode, MTT assay, Winning van MTT, en waardering van MTT OD worden in kolommen. Tijden het duplicaat weefsels zijn georganiseerd in rijen. De gehele test testen 10 TA en controles kunnen worden afgewerkt in een dag.

e_content ">

Starttijd voor het EIT-protocol stappen (2 dagen werken voor een operator)
Elke lijn correspondeert met een paar weefsels
Dag 1					Dag 2 (de volgende dag)
Volgorde van de stappen:	1	2	3	4	5	6	7
Vaste stoffen:	PBS	TA Belichting	Post- Soak	Post- Incubaction	MTT Reactie	MTT Extractie	Maatregel
	30 min	6 uur	26 min	18 hr	180 min	120 min	OD
NC	09:00	09:30	15:30	15:56	09:56	00:56	na
PC	09:02	09:32	15:32	15:58	09:58	00:58	15:30
TA-1	09:04	09:34	15:34	16:00	10:00	13:00
TA-2	09:06	09:36	15:36	16:02	10:02	13:02
TA-3	09:08	09:38	15:38	16:04	10:04	13:04
TA-4	09:10	09:40	15:40	16:06	10:06	13:06
TA-5	09:12	09:42	15:42	16:08	10:08	13:08
TA-6	09:14	09:44	15:44	16:10	10:10	13:10
TA-7	09:16	09:46	15:46	16:12	10:12	13:12
TA-8	09:18	09:48	15:48	16:14	10:14	13:14
TA-9	09:20	09:50	15:50	16:16	10:16	13:16
TA-10	09:22	09:52	15:52	16:18	10:18	13:18

Tabel 4: Voorbeeld tijdschema voor het testen van vaste testartikelen. Protocol stappen inclusief pre-bevochtigen van de weefsels met DPBS, Toepassing van Test artikelen, spoelen en Post-weken, Post-incubatieperiode, MTT assay, Winning van MTT, en waardering van MTT OD worden gepresenteerd in kolommen. Tijden het duplicaat weefsels zijn georganiseerd in rijen. De gehele test testen 10 TA en controles wordt uitgevoerd over een periode van twee dagen.

Bedrag	Reagens	Opslagcondities	Bron	Beschrijving	Houdbaarheidsdatum
1 flacon, 2 ml	MTT concentraat (MTT-100-CON)	Beschermd tegen licht (-20ºC)	MatTek	Bevroren MTT concentraat	2 maanden
1 flacon, 8 ml	MTT verdunner	2-8 &# 186; C	MatTek	Voor verdunnen MTT concentraat voor gebruik in de MTT assay	2 maanden
1 fles, 60 ml	Isopropanol (CAS # 67-63-0)	RT	Sigma-Aldrich	Extractiemiddeloplossing	NA

Tabel 5: MTT-100 Assay Kit Components.

Code N °	Weefsel	Ruwe gegevens		Blanco gecorrigeerde gegevens		gemiddelde van OD	% Van de levensvatbaarheid
	n	Aliq. 1	Aliq. 2	Aliq. 1	Aliq. 2
NC	1	1,316	1.352	1,316	1.352	1,334	101.6
	2	1,277	1,309	1,277	1,309	1,293	98.4
PC	1	0,379	0,397	0,379	0,397	0,388	29.6
	2	0,419	0,442	0,419	0,442	0,431	32.8
TA1	1	1,213	1,244	1,213	1,244	1,229	93.5
	2	1,355	1,355	1,355	1,355	1,355	103.2
TA2	1	1.210	1,122	1.210	1,122	1,166	88.7
	2	0,828	0,837	0,828	0,837	0,833	63.4
TA3	1	0,167	0,168	0,167	0,168	0,167	12.7
	2	0,138	0,136	0,138	0,136	0,137	10.4
TA4	1	1,137	1,160	1,137	1,160	1,149	87.4
	2	1.262	1,191	1.262	1,191	1.227	93.4
TA5	1	0.610	0,621	0.610	0,621	0,616	46.9
	2	0,480	0,484	0,480	0,484	0,482	36.7
TA6	1	0,502	0,513	0,502	0,513	0,508	38.7
	2	0,396	0,407	0,396	0,407	0,402	30.6
TA7	1	1,048	1.050	1,048	1.050	1,049	79.9
	2	1,149	1.150	1,149	1.150	1.150	87.5
TA8	1	1,032	1,034	1,032	1,034	1.033	78.7
	2	0,941	0,935	0,941	0,935	0,938	71.4
TA9	1	0,022	0,022	0,022	0,022	0,022	1.7
	2	0,144	0,149	0,144	0,149	0,147	11.2
TA10	1	0.150	0.150	0.150	0.150	0.150	11.4
	2	0,254	0,255	0,254	0,255	0,255	19.4

	betekenen	Dif.	gemiddelde van	Dif.	Dif. / 2	Classificatie
	van OD	van OD	levensvatbaarheid [%]	van de levensvatbaarheid
NC	1,314	0,041	100.0	3.12	1.56	NI	gediplomeerd
PC	0.410	0,043	31.2	3.23	1.62	Ik	gediplomeerd
TA1	1.292	0,127	98.3	9.63	4.81	NI	gediplomeerd
TA2	0,999	0,333	76.1	25,36	12,68	NI	D> 20
TA3	0,152	0,030	11.6	2.32	1.16	Ik	gediplomeerd
TA4	1,188	0,078	90.4	5.94	2.97	NI	gediplomeerd
TA5	0,549	0,134	41.8	10.16	5.08	Ik	gediplomeerd
TA6	0,455	0,106	34.6	8.07	4.03	Ik	gediplomeerd
TA7	1.100	0,101	83.7	7.65	3.82	NI	gediplomeerd
TA8	0,986	0.095	75.0	7.23	3.62	NI	gediplomeerd
TA9	0,085	0,125	6.4	9.48	4.74	Ik	gediplomeerd
TA10	0,203	0,105	15.4	7.95	3.98	Ik	gediplomeerd

Tabel 6:. EIT resultaten verkregen voor 10-test artikelen, NC en PC-besturingen De tafels zijn produced door een Excel-spreadsheet ontworpen om levensvatbaarheid van het weefsel en het EIT resultaten te berekenen. Chemicaliën test die de levensvatbaarheid van het weefsel verlaagd ≤ 60,0% ten opzichte van NC worden als irriterend ingedeeld ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10) en test chemische stoffen die had levensvatbaarheid van het weefsel> 60,0% worden geclassificeerd als niet-Irriterende (" NI ", TA1, TA2, TA4, TA7, en TA8).

Discussie

We hebben de oogirritatietest (figuur 1), die is ontwikkeld voor de EpiOcular weefsel model gepresenteerd. Het EIT is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) te scheiden van materialen die niet etikettering (GHS Geen categorie) met een hoge mate van gevoeligheid en specificiteit ^{17. Het} EIT vereisen zoals hierin gepresenteerd maakt geen onderscheid tussen GHS Categorie 1 van categorie 2 chemicaliën. Het EIT werd gevalideerd voor de indeling en etikettering van oogirritatie potentieel van een breed scala van chemische stoffen, met inbegrip van cosmetische en farmaceutische ingrediënten. In combinatie met andere in vitro testen, de EIT dienen als een vervanger voor de in vivo konijnen oogirritatie.

De EIT gebruikt twee vergelijkbare maar verschillende protocollen voor vloeibare en vaste stoffen, die verschillen in de duur van de blootstelling en na blootstelling incubatieperiode (figuur 1). Het eindpunt gebruikt in de EITis levensvatbaarheid van het weefsel, bepaald met de MTT-bepaling, die eerder gebruikt in relevante menselijke epitheelweefsel modellen ^20,21. Om deze test uit te voeren, is geen speciale apparatuur naast standaard celkweek apparatuur nodig. Vanwege de hoge weefsel tot weefsel reproduceerbaarheid, n = 2 weefsels in plaats van het normale aanbevolen n = 3 worden gebruikt. Het vermogen om gebruik n = 2 weefsels is een kritisch aspect van het protocol, aangezien het een ervaren operator twee weefsels tegelijkertijd verwerken, waardoor de variabiliteit van de test die kan optreden minimaliseren vanwege de verschillende behandeling van individuele weefsels ^14. Ook, door n = 2 per weefsels testvoorwerp, de irriterende werking van 10 teststoffen van dezelfde fysische toestand (vloeibaar of vast), samen met de positieve en negatieve controles, kunnen worden geëvalueerd met een kit (24 weefsels).

Andere belangrijke punten die betrouwbare classificatie van de materialen zorgen zijn specificaties voor de positieve controle substance (levensvatbaarheid van het weefsel ≤50.0%), reproduceerbaarheid tussen dubbele weefsels (verschil <20,0%) en negatieve controle OD (> 0,8 en <2,5).

Bij het ​​uitvoeren van de EIT test, is het belangrijk zich te houden aan de gevalideerde protocol en de voorgestelde dosering en schema spoelen (tabellen 3 en 4), omdat afwijking van het protocol of veranderingen in de incubatieperiode kan resulteren in gewijzigde afloop. Evenzo zullen afwijkingen van het 3 uur tijd MTT incubatietijd resulteren in verschillende MTT waarden en kunnen assayresultaat beïnvloeden.

Af en toe kan een test chemische optische of andere eigenschappen die kunnen interfereren met de MTT weefsel levensvatbaarheid assay of de oorzaak reductie van MTT te hebben. Bijvoorbeeld, kan een chemische teststof direct verminderen MTT in blauwpaarse reactieproduct, of kan een gekleurde stof die licht absorbeert in hetzelfde bereik als MTT formazan (~ 570 nm) zijn. Echter, deze test stoffen prESENT probleem alleen wanneer op het tijdstip van de MTT-bepaling, een voldoende hoeveelheid van het materiaal nog aanwezig (of geabsorbeerd door) het weefsel. Om deze storing te voorkomen, worden uitgebreid spoelen procedures opgenomen in de EIT-protocol. Als het spoelen niet verwijderen van de TA en de TA interfereert met MTT-reductie, moeten aanvullende controles worden gebruikt om te detecteren en te corrigeren voor het. In het kort, indien rechtstreekse MTT vermindering van de teststof wordt vermoed, 50 gl (of 50 mg vaste stof) van de betrokken chemische stof wordt gedurende 3 uur met werken MTT oplossing bij SCC (NC, 50 ul steriel gedeïoniseerd water, moet draaien gelijktijdig). Als de MTT-oplossing wordt blauw-paars, is de test artikel geacht te hebben verminderd de MTT. In dit geval een functiecontrole behulp gevries- gedood weefsel controles moeten worden uitgevoerd om te beoordelen of het testmateriaal binding aan het weefsel en tot een foutieve verlaging MTT signaal. Als er aanzienlijke reductie van MTT in de TA-blootgestelde gedood weefselcontrole(betrokken op de hoeveelheid in de onbehandelde levende weefsel), de gemiddelde levensvatbaarheid weefsel van het testvoorwerp worden gecorrigeerd door het aftrekken van de gemiddelde levensvatbaarheid van de gedode control.

Het EIT ten onrechte aan de kant van de veiligheid, zoals aangetoond door de lage incidentie van vals-negatieve classificaties ^14,15,18. Belangrijk is dat geen van de GHS-categorie 1 chemische stoffen, die bijtend voor de ogen en die vertegenwoordigen de meest ernstige oculaire gevaar, werden geclassificeerd als niet-irriterend in deze test ^14,15,18,19. Tenslotte, een van de grote voordelen van het RHCE in vitro testmethode is de mogelijkheid testen keurige vloeibare en vaste stoffen (wat niet mogelijk is met tweedimensionale, ondergedompelde celculturen).

Het EIT zal een belangrijke bijdrage leveren bij het bepalen van de oogirritatie potentieel van een breed scala van materialen volgens de VN-GHS-indeling en etikettering systeem. De vervanging van dieren o bepalenname op toxiciteit is een doel van het toxicologisch onderzoek voor vele jaren. Het EIT testmethode is een formele valideringsstudie ondersteund door EURL ECVAM voltooid in 2014 en de EpiOcular EIT werd in 2015 in de OESO-richtlijnen als de OESO TG 492 geïmplementeerd.