Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Samenvatting

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Samenvatting

Lipidemetabolisme in de lever is complex. Naast het importeren en exporteren van lipiden via lipoproteïnen, kunnen hepatocyten lipide oxideren via vetzuuroxidatie, of alternatief, nieuwe lipiden synthetiseren via de novo lipogenese. De netto som van deze paden wordt bepaald door een aantal factoren, wat in bepaalde ziektetoestanden leidt tot levervetziekten. Overmatige ophoping van leverlipiden wordt geassocieerd met insulineresistentie in het hele lichaam en coronaire hartziekte. Hulpmiddelen om lipidemetabolisme in hepatocyten te bestuderen, zijn nuttig om de rol van hepatisch lipidemetabolisme bij bepaalde metabole stoornissen te begrijpen.

In de lever reguleren hepatocyten de afbraak en synthese van vetzuren via β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese, respectievelijk. Het kwantificeren van metabolisme in deze paden geeft inzicht in de hepatische lipideafhandeling. In tegenstelling tot in vitro kwantificering, met behulp van primaire hepatocyten, is het maken van metingen in vivo technisch uitdagend en veel middelen vereisend. Daarom biedt het kwantificeren van β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese in gekweekte muis-hepatocyten een eenvoudige methode om de lipideafhandeling van hepatocyten te beoordelen.

Hier beschrijven we een methode voor de isolatie van primaire muis-hepatocyten en we demonstreren kwantificering van β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese, met behulp van radiogelabelde substraten.

Inleiding

Non-alcoholische leververvetting is een van de belangrijkste oorzaken van leverziekten in gewesterniseerde culturen^1,2. Lipide-accumulatie in de lever is geassocieerd met celdood, fibrose en leverfalen via nog onbekende mechanismen^3-6. Bij leververvetting zijn hepatocyt-gemedieerde β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese belangrijke determinanten van netto lipide-accumulatie^7,8. Dit artikel zal zich daarom richten op het isoleren van hepatocyten, gevolgd door kwantificering van β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese.

Er zijn talloze methodologieën ontwikkeld om het lipidemetabolisme van hepatocyten te onderzoeken. Hoewel het mogelijk is om het vetmetabolisme in vivo te meten met behulp van stabiele isotopen^9,10, zijn deze methoden duur en vereisen ze een groot aantal dieren. Bovendien is de mogelijkheid om het effect van exogene chemicaliën te onderzoeken beperkt vanwege de aard van in vivo experimenten. Daarentegen biedt het isoleren van primaire hepatocyten uit de muizenlever een betaalbare mogelijkheid¹¹. Bovendien stelt het bestuderen van hepatocyten in cultuur onderzoekers in staat de effecten van verschillende chemicaliën op lipide-verwerking te bestuderen, terwijl ze de moeilijkheden van in vivo experimenten omzeilen. Ten slotte vermijden geïsoleerde hepatocyten enige verwarring door verschillende genetica, omdat ze zijn afgeleid van de lever van een enkel dier.

Hier isoleren en cultiveren we hepatocyten en we meten β-vetzuuroxidatie en de novo lipogenese, met behulp van radioactief gelabeld palmitaat. Het hieronder beschreven protocol is eenvoudig, effectief en reproduceerbaar.

Protocol

Alle dierproeven moeten in overeenstemming met de lokale en federale regelgeving en met de goedkeuring van een institutionele IACUC en stralingsveiligheid beheer worden uitgevoerd.

1. Voorbereiding

1. Enkele dagen voorafgaand aan de assay te ontdooien de fles 500 ml Liver Digest Medium (LDM) en opnieuw invriezen ~ 35 ml aliquots in 50 ml conische buizen. Bewaren bij -20 ° C totdat het nodig is.
2. Een dag voorafgaand aan de test, pre-steriliseren schone dissectie instrumenten door autoclaaf.
3. Op de dag van de test, de behandeling van de benodigde hoeveelheid van 24 putjes met collageen.
   1. Meng 1 deel van 3 mg / ml rattenstaart collageen met 50 delen van PBS. Voeg ongeveer 500 ul aan elk putje van een 24-wells plaat en incubeer gedurende 3-5 min bij kamertemperatuur (RT). Verwijder de collageen en laat de plaat droog in de hood lucht. Herhaal tenminste één extra tijd.
      Opmerking: Collageen coating kan worden uitgevoerd om een ​​week in advance en platen bewaard bij 4 ° C afgesloten in plastic folie.
4. Bereid LDM voor assay: Ontdooien LDM en warm tot 37 ° C en pH op 7,4 met gebruikmaking van 1 N KOH. Filter met 0,2 um spuitfilter en plaats in een recirculerende 42 ° C waterbad.
5. Warm 25 ml leverperfusie Medium tot 42 ° C in recirculerende waterbad.
6. Bereid 90% colloidaal silica gecoat met polyvinylpyrrolidonoplossing: Voeg 1 ml van 10x DPBS met 9 ml colloïdaal silica bekleed met polyvinylpyrrolidon. Stel de pH tot 7,4 met 0,1 N HCl. Filter met een steriel 0,2 urn spuitfilter. Slaan bij RT.
7. Warm Plating Medium tot 37 ° C.

2. Isolatie van Primary Mouse Hepatocyten

1. Opgezet peristaltische pomp, slangen, en dissectie tafel: Steriliseren slang door te spoelen met 5 ml 70% ethanol in gedestilleerd water, gevolgd door 10 ml steriel water. Plaats de slang in leverperfusie Medium en lopen de pomp te vullengehele lengte buis.
2. Offer muis door de institutioneel goedgekeurde methode.
3. Ontleden geopend de buikholte: Spuit de muis buik royaal met 70% ethanol. Met behulp van blunt-end schaar, maak een middellijn incisie door de dermis de lengte van de buik en weerspiegelen lateraal. Wordt soortgelijke snede in het peritoneum om de ingewanden bloot te leggen.
   1. Met een stomp voorwerp voorzichtig verplaatsen van de darmen om bloot de buik vaatstelsel Zoek de abdominale vena cava inferior (IVC) en plaats een hechting onder het bloedvat, distaal van de nierader
4. Distaal van de hechtdraad, plaats een naald en katheter in de IVC, bevorderen zij boven het niveau van de hechtdraad. Met de naald nog steeds op zijn plaats, bind de hechtdraad rond de katheter om het te houden op zijn plaats. Verwijder de naald voorzichtig. Indien correct gedaan, met bloed stroom door de katheter.
5. Met behulp van een pipet, vul de resterende ruimte in de katheter met perfusie medium, zorgendat er geen lucht aanwezig is. Met grote zorg, bevestig de slang aan op de katheter.
6. Ontleden geopend de long holte: voorzichtig weerspiegelen de superieure lever lobben aan het middenrif bloot. Doorboren aandachtig het diafragma met scherpe punt schaar, maak dan een laterale incisie aan de borstholte bloot te leggen, zorg ervoor dat de galblaas en pleura vaatstelsel voorkomen. Plaats een bulldog klem rond de thoracale vena cava inferior net proximaal van de leverader.
7. Snijd de poortader en zet de pomp bij 3-4 ml / min. Perfuseren van de lever met leverperfusie Medium gedurende 5 min met behulp van ongeveer 20 ml perfusiemedium.
   Opmerking: De lever moet onmiddellijk veranderen van rood naar grijs / bruin. Wanneer gedeelten van de lever rood blijft, dit waarschijnlijk duidt op slechte perfusie en de kans op succesvolle isolatie sterk verminderd. Tijdens de perfusie, wees voorzichtig aan het medium niet opraken zorgen en dat er geen luchtbellen voer de slang.
8. Na de 5 min incubatie, stoppende pomp en breng de slang aan Liver Digest Medium. Start de pomp en perfuseren van de lever nog eens 10 - 15 minuten (totdat het medium uitgeput).
9. Aan het einde van de perfusie, stop de pomp. De lever zou een roze tint hebben en lijken enigszins vergroot. Accijnzen de lever door zorgvuldige dissectie. Verwijder de galblaas en de overdracht van de lever tot 10 cm weefselkweek schotel.
10. In een bioveiligheid kast, voeg 10 ml Plating Medium (tabel 1) naar de lever. Zachtjes schraap de lever met behulp van een tang of een scalpel aan de levercellen te verwijderen. Filter de ophanging met behulp van een 100 um cel zeef en transfer naar een 50 ml conische buis. Was de plaat met een extra 10 ml Plating Medium en het zwembad in de 50 ml conische buis.
11. Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 350 xg, 4 ° C.
12. Zuig medium en resuspendeer pellet in 10 ml Plating Medium en voeg 10 ml van 90% colloïdale silica gecoat met polyvinylpyrrolidone. Meng voorzichtig en centrifuge zoals in stap 2.11. Na centrifugeren wordt een laag dode cellen te drijven op de bovenkant van het mengsel, terwijl de levende cellen te pelleteren aan de bodem.
13. Aspireren dode cellen en medium. Was 2 maal met 20 ml plaatmedium, centrifuge zoals in 2,11.
14. Resuspendeer cellen in 10 ml plaatmedium. Tellen cellen met een hemocytometer en plaats 9 x 10 ⁴ cellen / putje in met collageen behandelde 24-putjes. Incubeer in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 2 uur. Elke plaat kan gebruikt worden voor de vetzuuroxidatie test of het assay Lipogenese.
15. Eventueel veranderen putten Maintenance Medium (tabel 1) en kweek bij 37 ° C. Cellen kunnen worden gekweekt gedurende 2 - 3 dagen zonder invloed testresultaten.

3. vetzuuroxidatie Assay

Waarschuwing: Het gebruik van radioactiviteit kan gevaarlijk zijn. Alle inkoop, opslag, handling, en disposal van radioactief materiaal moet in overeenstemming met de institutionele, provinciale en landelijke voorschriften en richtlijnen worden uitgevoerd.

1. 16 - 20 uur vóór de assay, was de cellen 2 maal met warm PBS. Verander de cellen aan serumvrije serum uitputtingsmedium (tabel 1) met 20 nM glucagon en incubeer overnacht bij 37 ° C.
   Let op: Omdat foetaal runderserum bevat een onbekende concentratie van metabole hormonen (zoals insuline, glucagon), serum verhongeren de cellen om eventuele verstorende gevolgen die dit kan hebben op de test te verwijderen. De cellen levensvatbaar in serum uitputtingsmedium gedurende> 24 uur. Glucagon behandeling wordt gebruikt vetzuuroxidatie in de hepatocyten stimuleren.
2. Op de ochtend van de test bereiden pre-incubatiemedium: Resuspendeer een geschikte hoeveelheid natrium palmitaat in ultrapuur water om een ​​100 mM oplossing en verhit tot 70 ° C gedurende 10 min te maken. Ondertussen bereidt de vereiste hoeveelheid (0,5 ml per putje van een 24 putjesplaat)DMEM met 25 mM HEPES, 1% BSA Fraction V, en 20 nM glucagon. Verwarm tot 37 ° C.
   1. Eens oplosbaar gemaakt, voeg Palmitaat tot een eindconcentratie van 250 uM tot het medium. Verander hepatocyten pre-incubatiemedium en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. Reserveren aantal pre-incubatiemedium bij 37 ° C voor later gebruik.
3. Tijdens de incubatie drogen een geschikte hoeveelheid van ¹⁴ C-palmitaat (0,5 uCi / putje) door verdamping onder stikstofgas.
   1. Om bijvoorbeeld 24 monsters te meten in een 24-wells plaat, overdracht 120 ul van 0,1 uCi / ml ¹⁴ C-palmitaat een 1,5 ml buis. Langzaam verdampen het ethanol oplosmiddel door te blazen stikstofgas via oplossing op een afstand van 3-5 cm in een zuurkast. Het oplosmiddel moet ongeveer 30 verdampen - 40 min, waardoor droge ¹⁴ C-palmitaat in de bodem van de buis.
4. Ongeveer 15 min vóór het einde van de incubatie, resuspendeer de ¹⁴C-palmitaat in 0,1 N NaOH (12,5 ul / uCi). Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 min. Voeg drie volumes warm pre-incubatiemedium en meng door en neer te pipetteren.
5. Spike elk putje met 25 ul van de verwaterde ¹⁴ C-Palmitaat. Meng door voorzichtig schommelen van de plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 90 min. Dit is de bepalingsplaat.
6. Tijdens de incubatie bereiden Filter Paper plaat (Figuur 1).
   1. Verwijder het deksel van een steriele 24-wells plaat. Plaats een 2 cm x 2 cm stuk filtreerpapier op de bodem van elk van de wells. Overlay de plaat met een stuk van 4 "x 7" parafilm.
   2. Met een groot rechthoekig voorwerp zoals een micropipettor top box, wrijf de parafilm aan de putjes op de parafilm bij de bron openingen perforeren en een afdichting over de rest van de plaat. Verwijder de geperforeerde cirkels van parafilm nu met betrekking tot de putten. De plaat moet nu goed worden afgedekt met parafilm op alle gebieden, behalve het goed openings.
7. 10 min vóór het einde van de incubatie, voeg 200 pl 3 N NaOH aan elk putje van de plaat filtreerpapier en controleer het filterpapier absorbeert alle vloeistof.
   1. Eventueel vóór het invriezen, dragen het medium om een ​​nieuwe 24-well plaat. Na eenmaal wassen met PBS, lyseren de overige cellen in 0,1 N HCl en eiwitgehalte door BCA assay berekenen.
8. Aan het einde van de incubatie snap-invriezen bepalingsplaat in vloeibare stikstof. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen elk putje wordt alvorens volledig bevroren.
9. Voeg 100 ul van 70% perchloorzuur aan elk putje van de assay plaat. Onmiddellijk bedekken met de Filter Paper Plate. Leg de platen op een rondschudapparaat en rots bij orbitale snelheid van 80 rpm bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
10. Na de incubatie verwerken monsters:
    1. Om de CO ₂ fractie te meten, de overdracht van de filter papier pleinen tot 4 ml vloeistof scintillatievloeistof in een scintillatieflesje en maatregel ¹⁴ C-signaal.
    2. Het zuur oplosbaar materiaal te meten, overdracht 400 ul van medium naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 10 min. Voeg 100 ul van de resulterende supernatant 500 gl 2: 1 chloroform-methanol (v / v) en vortex kort.
       1. Voeg 250 ul van water aan het mengsel en vortex weer. Centrifugeer monsters gedurende 10 min bij 3000 x g. Overdracht 200 ul van de bovenste fase 4 ml vloeibaar scintillatie fluïdum in een scintillatie-flesje en meet ¹⁴ C-signaal.

4. Lipogenese Assay

1. De avond voorafgaand aan het beginnen van de test, was de cellen 2 maal met warm PBS. Verander de hepatocyten te Serum Starvation Medium met 100 nM insuline. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
   Opmerking: Omdat foetaal runderserum bevat een onbekende concentratie van metabole hormonen (zoals insuline, glucagon), Serum verhongeren de cellen om eventuele verstorende gevolgen die dit kan hebben op de test te verwijderen. De cellen levensvatbaar in serum uitputtingsmedium gedurende> 24 uur. Insuline wordt in deze assay lipogenese stimuleren.
2. Maak Lipogenese Medium: Serum Honger Medium met 100 nM insuline, 10 uM koud acetaat en 0,5 uCi ^3H-acetaat per putje. Verander cellen Lipogenese Medium en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. Omvatten alle verbindingen van belang te testen.
3. Na de incubatieperiode was cellen 2 maal met PBS. Lyse cellen door schrapen in 120 ui 0,1 N HCI. Reserve 10 ul van proteïne assay (beoordelen door BCA assay), en overdracht 100 ul aan 1,5 ml microcentrifugebuis.
4. Extract lipiden door toevoeging van 500 gl van 2: 1 chloroform-methanol (v / v). Vortex kort en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 250 ui water, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende nog 5 min. Centrifugeer de monsters 10 min bij 3000 x g, kamertemperatuur. Voorzichtigoverdragen onderste fase 4 ml vloeistof scintillatievloeistof in een scintillatieflesje en meet ³ H activiteit.

Resultaten

Hepatocyt isolatie resulteren meestal in 1-3 x 10 ⁷ totale cellen. Na overnacht incubatie worden de cellen blijken zeshoekige, waarvan vele worden binucleaire (figuur 2). Gezonde cellen moeten verstoken van granulaties of blebs, die indicatief zijn voor celdood bent.

In het algemeen wordt vetzuuroxidatie assay uitgevoerd in 3-4 herhalingen per testverbinding. Geldt voor de CO ₂ monsters ongeveer een vijfde van die afgeleid van het zuur oplosbaar materia...

Discussie

De tijd van offeren perfusie zou minder dan 3 min voor optimale perfusie en collagenase digestie van de lever. Zodra perfusie met perfusie Medium wordt gestart, moet de lever direct te wijzigen uiterlijk van rood tot licht. Na ongeveer 10 minuten van incubatie met LDM, zal de lever lijken gezwollen en roze. Indien onvoldoende perfusie, kan de lever vertonen deze veranderingen, en dit zal gewoonlijk leiden tot een lager rendement hepatocyten.

Na de wasstappen, kan geïsoleerde hepatocyten word...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot en bewaar bij -20 °C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Colloidal silica coated with polyvinylpyrrolidone	GE Life Sciences	17-0891-01
Sodium Pyruvate	Cellgro	25-000-CI
Penicillin / Streptomycin	Cellgro	30-001-CI
Insulin	Sigma	I0516-5ML
Dexamethasone	Sigma	D2915-100MG
Albumin (BSA), Fraction V	MP Biomedicals	103703
24-Well Culture Dish	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Tubing	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Catheter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculating Water Bath	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L Peristaltic Pump	MasterFlex	HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Voorbereiden steriliseren in autoclaaf
5” Straight, Blunt-Blunt Operating Scissors	Roboz	RS-6810	Voorbereiden steriliseren in autoclaaf
24 mm Blade Straight, Sharp-point Microdissecting Scissors	Roboz	RS-5912	Voorbereiden steriliseren in autoclaaf
4” 0.8 mm Tip Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5130	Voorbereiden steriliseren in autoclaaf
4” 0.8 mm Tip Full Curve Microdissecting Forceps	Roboz	RS-5137	Voorbereiden steriliseren in autoclaaf
60 ml Syringe	Becton Dickinson	309653
50 ml conical tubes	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Biosafety Cabinet
CO2 Incubator
Serological pipets
1,000, 200, 20 μl pipet and tips