Microglia kunnen neuronen en andere gliacellen in cultuur beïnvloeden door verschillende niet-celautonome mechanismen. Hier presenteren we een protocol om selectief microglia uit primaire neuronale culturen te depelen. Deze methode heeft het potentieel om de rol van microgliale-neuronale interacties te verduidelijken, met implicaties voor neurodegeneratieve aandoeningen waarbij neuro-inflammatie een karakteristieke eigenschap is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microglia, de residente immunocompetente cellen van het CZS, spelen veelzijdige rollen in het moduleren en controleren van neuronale functie, evenals het mediëren van aangeboren immuniteit. Primaire knaagdier celkweekmodellen hebben ons begrip van neuronale-glia-interacties enorm bevorderd, maar pas recentelijk zijn methoden om microglia specifiek uit gemengde culturen te elimineren, gebruikt. Een van deze technieken – hier beschreven – is het gebruik van L-leucine methyl ester, een lysotroop middel dat wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij het lysosomale disruptie en daaropvolgende apoptose veroorzaakt13,14. Experimenten met L-leucine methyl ester hebben de kracht om de bijdrage van microglia aan de omringende cellulaire omgeving onder diverse kweekcondities te identificeren. Met behulp van een in ons laboratorium geoptimaliseerd protocol, beschrijven we hoe microglia uit P5 knaagdier cerebellaire granulecelcultuur kan worden geëlimineerd. Deze benadering maakt het mogelijk om de relatieve impact van microglia op experimentele gegevens te beoordelen, evenals om te bepalen of microglia een neuroprotectieve of neurotoxische rol spelen in kweekmodellen van neurologische aandoeningen, zoals beroerte, Alzheimer’s of Parkinson’s ziekte.
Inleiding
Het menselijk brein bestaat uit een geschatte 85 miljard neuronen en een verdere 85 miljard niet-neuronale cellen, waaronder glia 1. Vandaar de Griekse etymologie van 'glia "vertaald Engels zo - voor het grootste deel van de afgelopen 100 jaar neuroscientists zijn vooral gericht op de neuronale celpopulatie, geloven gliacellen weinig meer dan passieve steuncellen die structurele ondersteuning voor neuronen 'lijm'. Onlangs is het echter steeds duidelijker dat neuronale-gliale interacties veel fundamentele fundamentele aspecten van neurobiologie, neurofysiologie en het ontstaan en de progressie van vele neurodegeneratieve ziekten kunnen zijn. C....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten die hierin zijn beschreven werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk Animals (Scientific Procedures) Act van 1986.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Bereid twee roestvrijstalen laboratorium ontleden schaar en twee roestvrijstalen laboratorium tang. Autoclaaf alle instrumenten en plaats in een cultuur kap O / N onder ultraviolet licht (UV) licht voor sterilisatie.
- Voeg 500 ml minimaal essentieel medium (MEM) kweekmedium (10% foetaal runderserum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 gg / ml strep....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het vermogen van deze techniek om selectief microglia van CGC en / of gemengde kweken elimineren berust op de daaropvolgende vermogen van de onderzoeker nauwkeurig te identificeren en differentiëren microglia van de omringende cellen. Dit kan worden bereikt door een microgliale-specifieke cel maker, zoals isolectin-B4, zie figuur 1. Zoals in figuur 2, werden geen waarneembare veranderingen in astrocyten en neuronale dichtheid en morfologie met betrekking op elke belangrijke behandelings.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste stappen voor de succesvolle selectieve eliminatie van microglia van CGC verzekeren en / of gemengde kweken zijn: 1) het handhaven van een steriele en gezonde CGC cultuur; 2) filter steriliseren van de LME-bevattend medium en terug de oplossing op pH 7,4; 3) het bijhouden van de ingehouden CGC media en LME-bevattende media bij 37 ° C naar heat shock te voorkomen; en 4) snel werken om de tijd cellen buiten de incubator gehouden verminderen.
We gebruikten 25 mM LME.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door een Aims2Cure, UK en een UCL Impact Award Ph.D. beurs aan JMP en een MRC Capacity Building Ph.D. beurs in dementie aan JMP.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Het gebogen uiteinde vergemakkelijkt het verwijderen van de kleine hersenen |
| Micro-dissectie schaar | Sigma-Aldrich | S3146 | Rechte, scherpe punt vergemakkelijkt P4-7 dissectie van knaagdieren |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS oplossing | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Bestrijk dekglasjes 1 dag voor gebruik |
| Rund serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Sojaboon trypsine-remmer | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Muis anti-ED1 antilichaam | Abcam | ab31630 |
Referenties
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
