Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester

Samenvatting

Microglia kunnen neuronen en andere gliacellen in cultuur beïnvloeden door verschillende niet-celautonome mechanismen. Hier presenteren we een protocol om selectief microglia uit primaire neuronale culturen te depelen. Deze methode heeft het potentieel om de rol van microgliale-neuronale interacties te verduidelijken, met implicaties voor neurodegeneratieve aandoeningen waarbij neuro-inflammatie een karakteristieke eigenschap is.

Samenvatting

Microglia, de residente immunocompetente cellen van het CZS, spelen veelzijdige rollen in het moduleren en controleren van neuronale functie, evenals het mediëren van aangeboren immuniteit. Primaire knaagdier celkweekmodellen hebben ons begrip van neuronale-glia-interacties enorm bevorderd, maar pas recentelijk zijn methoden om microglia specifiek uit gemengde culturen te elimineren, gebruikt. Een van deze technieken – hier beschreven – is het gebruik van L-leucine methyl ester, een lysotroop middel dat wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij het lysosomale disruptie en daaropvolgende apoptose veroorzaakt^13,14. Experimenten met L-leucine methyl ester hebben de kracht om de bijdrage van microglia aan de omringende cellulaire omgeving onder diverse kweekcondities te identificeren. Met behulp van een in ons laboratorium geoptimaliseerd protocol, beschrijven we hoe microglia uit P5 knaagdier cerebellaire granulecelcultuur kan worden geëlimineerd. Deze benadering maakt het mogelijk om de relatieve impact van microglia op experimentele gegevens te beoordelen, evenals om te bepalen of microglia een neuroprotectieve of neurotoxische rol spelen in kweekmodellen van neurologische aandoeningen, zoals beroerte, Alzheimer’s of Parkinson’s ziekte.

Inleiding

Het menselijk brein bestaat uit een geschatte 85 miljard neuronen en een verdere 85 miljard niet-neuronale cellen, waaronder glia ^1. Vandaar de Griekse etymologie van 'glia "vertaald Engels zo - voor het grootste deel van de afgelopen 100 jaar neuroscientists zijn vooral gericht op de neuronale celpopulatie, geloven gliacellen weinig meer dan passieve steuncellen die structurele ondersteuning voor neuronen 'lijm'. Onlangs is het echter steeds duidelijker dat neuronale-gliale interacties veel fundamentele fundamentele aspecten van neurobiologie, neurofysiologie en het ontstaan ​​en de progressie van vele neurodegeneratieve ziekten kunnen zijn. Cerebellaire granule cellen (CBC), de meest voorkomende homogene neuronale populatie in het menselijk brein, domineren het cerebellum en make-up meer dan 90% van de cellulaire bestanddelen. Bijgevolg zijn deze cellen zijn uitgebreid gebruikt in vitro modelsysteem voor thij bestuderen van neuronale ontwikkeling, functie en pathologie ^2-6.

Echter, CGC culturen bevatten nog steeds microglia en andere glia in aantoonbaar significante proporties. Hierdoor kan CGC data vermoedelijk weergave van de directe neuronale reacties op andere cel behandelingen daadwerkelijk optreden - gedeeltelijk of geheel - van de indirecte secundaire respons van naburige glia in de kweek. Om dit te bepalen, we selectief afgesplitst microgliale van CGC neuronale kweken met behulp van L-leucine methylester (LME). LME is een lysomotropic middel oorspronkelijk gebruikt om selectief te vernietigen macrofagen ^7, en is sindsdien gebruikt om ook selectief afbrekende microglia van neurale, astrocyten, en gemengde gliale culturen ^8,9,10. LME wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij veroorzaakt lysosomale ontwrichting en daaropvolgende apoptose ^13,14. Macrofagen en microglia zijn karakteristiek rijk aan lysosomen, waardoor ze particula zijnrly kwetsbaar bij blootstelling aan LME behandeling. Dit protocol biedt een krachtige, maar eenvoudige en gemakkelijke manier om de bijdrage van microglia in experimenten met behulp van CGC en andere neuronale / gliale cultuur systemen vast te stellen.

Protocol

Alle experimenten die hierin zijn beschreven werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk Animals (Scientific Procedures) Act van 1986.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten

1. Bereid twee roestvrijstalen laboratorium ontleden schaar en twee roestvrijstalen laboratorium tang. Autoclaaf alle instrumenten en plaats in een cultuur kap O / N onder ultraviolet licht (UV) licht voor sterilisatie.
2. Voeg 500 ml minimaal essentieel medium (MEM) kweekmedium (10% foetaal runderserum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO _3, 30 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 gg / ml streptomycine en 6 ug / ml ampicilline) en filter steriliseren. Bewaar bij 4 ° C voor maanden.
3. Bereid 24 putjes met 14 mm, nummer 1 dikte coverslips. Autoclaaf de dekglaasjes en vacht bij 100 mg / l poly-d-lysine (PDL), zoals eerder beschreven ^3. UV-licht steriliseren O / N.

2. Voorbereiding van de CGC Cultuur Solutions

1. Bereid 'oplossing A (100 ml) in geautoclaveerde, UV licht behandelde, steriele dH ₂ O bevattende 250 mg glucose, 300 mg runderserumalbumine [BSA], 955 mg fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] (Ca2 ⁺ en Mg ⁺ vrij) en 1 ml van 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O.
2. Bereid 'oplossing B (10 ml) dat 1 ml 5 mg / ml trypsine verdund in 9 ml van oplossing A
3. Bereid "oplossing C" (10 ml) dat 1000 eenheden DNase, 0,5 mg sojaboontrypsineremmer, 100 gl 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O, verdund tot 10 ml met oplossing A
4. Bereid 'oplossing D' (20 ml) die 3,2 ml oplossing C, verdund tot 20 ml met oplossing A
5. Bereid BSA / Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) oplossing die EBSS, 25 mM NaHCO _3, 3 mM MgSO ₄ · 7H ₂ O, en4% BSA, pH 7,4, zoals eerder beschreven ^3.
6. Bereid LME door toevoeging pure LME in 5 ml MEM kweekmedium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven, de oplossing op pH 7,4 terug met een benchtop pH meter en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuit filter.

3. Het kweken van de CBC's

1. Verzamel cerebella 4-7 dagen oude pups rat zoals eerder beschreven ^3. Direct plaatsen in petrischaal met 5 ml oplossing A op het ijs.
2. Giet het overtollige oplossing uit cerebella en plaats weefsel in de petrischaal deksel.
3. Hak fijn weefsel met een goed gevlamd scheermesje in ten minste drie verschillende richtingen.
4. Voeg gehakt weefsel aan oplossing B (spoel petrischaal met een oplossing beperkte weefsel zorgen verlies) en overbrengen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 5 min. Schud zachtjes om de paar minuten.
5. Voeg oplossing D (20 ml) aan de buis trypsine, schudden en cent neutraliserenrifuge bij 65 xg gedurende 5 min.
6. Giet supernatant.
7. Resuspendeer in 4 ml oplossing C. Triturate goed (ongeveer 10 maal elk) met drie gevlamde glas pipetten van afnemende diameter totdat de suspensie zo homogeen mogelijk.
8. Langzaam en voorzichtig enkele druppels van dit homogenaat bovenop de BSA / EBSS. Als het begint te dalen door de BSA / EBSS, tritureer meer en / of voeg een beetje oplossing C. Het homogenaat wordt in een laag bovenop de BSA / EBSS zitten. Niet schudden. Spin bij 100 xg gedurende 5 minuten.
9. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet (soft) in 1 ml MEM medium.
10. Tellen cellen met een hemocytometer en plaat bij 800.000 cellen / dekglaasje in 500 pl MEM medium. Plaats in een incubator bij 37 ° C met 6% _CO2.
11. Verander het medium de volgende dag (24-36 uur na de prep). Voeg een oplossing MEM medium dat 10 uM van de celcyclus inhibitor arabinofuranosyl cytidine (AraC).
    1. Perdekglaasje, behouden 250 ui van het oude medium in een frisse 24 wells plaat, zuigen de rest, voeg 250 ul van normale MEM medium en zuig dit om de cellen te wassen, voeg dan de 250 ul van het oude medium terug naar de cellen en vul met 250 pl AraC-bevattend medium.
       Opmerking: Cellen kunnen worden gebruikt vanaf 6 dagen in vitro (DIV).

4. Selectief Depleting de Microglia (Uitgevoerd op 6 DIV)

1. Toevoegen pure LME aan 5 ml van een afzonderlijke portie van MEM medium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven.
2. Breng de oplossing op pH 7,4 en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuitfilter.
3. Verdun oplossing tot een concentratie van 50 mM (2 x LME) in MEM medium en in een waterbad bij 37 ^{° C} gedurende 10 min met normale MEM medium voor controlekweken.
4. Verwijder de helft (250 ui) MEM medium van CGC kweken en bewaar bij 37 ° C.
5. Behandel cellenmet MEM medium dat 2 x LME (250 ui), verdunde 1: 1 geven een goed concentratie van 25 mM, of voorverwarmd MEM medium zonder LME (250 ul) van controlekweken.
6. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 6% _CO2 gedurende 1 uur.
7. Was cellen tweemaal in vers voorverwarmd MEM medium LME-bevattende media verwijderd en vervang de vastgehouden kweekmedium en een gelijk volume verse voorverwarmde MEM medium tot de overeenkomstige putjes.
8. Terug kweken in de broedstoof (bevochtigd met 6% _CO2 bij 37 ° C) en laat het rusten gedurende 24 uur voor verdere behandeling.

Resultaten

Het vermogen van deze techniek om selectief microglia van CGC en / of gemengde kweken elimineren berust op de daaropvolgende vermogen van de onderzoeker nauwkeurig te identificeren en differentiëren microglia van de omringende cellen. Dit kan worden bereikt door een microgliale-specifieke cel maker, zoals isolectin-B4, zie figuur 1. Zoals in figuur 2, werden geen waarneembare veranderingen in astrocyten en neuronale dichtheid en morfologie met betrekking op elke belangrijke behandelings...

Discussie

De belangrijkste stappen voor de succesvolle selectieve eliminatie van microglia van CGC verzekeren en / of gemengde kweken zijn: 1) het handhaven van een steriele en gezonde CGC cultuur; 2) filter steriliseren van de LME-bevattend medium en terug de oplossing op pH 7,4; 3) het bijhouden van de ingehouden CGC media en LME-bevattende media bij 37 ° C naar heat shock te voorkomen; en 4) snel werken om de tijd cellen buiten de incubator gehouden verminderen.

We gebruikten 25 mM LME...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	Het gebogen uiteinde vergemakkelijkt het verwijderen van de kleine hersenen
Micro-dissectie schaar	Sigma-Aldrich	S3146	Rechte, scherpe punt vergemakkelijkt P4-7 dissectie van knaagdieren
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS oplossing	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Bestrijk dekglasjes 1 dag voor gebruik
Rund serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Sojaboon trypsine-remmer	Sigma-Aldrich	T6414
Muis anti-ED1 antilichaam	Abcam	ab31630