Methodenartikel

Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

DOI:

10.3791/52989

⸱

18 augustus 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levermacrofagen, Kupffer-cellen genoemd, zijn verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes. We beschrijven hier een methode, met hoge celzuiverheid en opbrengst, voor het isoleren van Kupffer-cellen. De gemodificeerde LDH-test wordt hier gebruikt om de toxiciteit veroorzaakt door koolstofnanoboortjes in Kupffer-cellen te meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De grote meerderheid van in vitro studies hebben nanotoxicological geïmmortaliseerde cellijnen gebruikt voor hun bruikbaarheid. Echter, de resultaten van nanodeeltjes toxiciteit in geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen toonden verschillen, benadrukt de noodzaak om het gebruik van primaire cellen verlengen in vitro assays. Dit protocol beschrijft de isolatie van muizenlever macrofagen, genaamd Kupffer cellen en hun toepassing toxiciteit nanodeeltjes bestuderen. Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag bevolking in het lichaam en vormt een deel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die verantwoordelijk is voor de vangst van circulerende nanodeeltjes. De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De werkwijze, gebaseerd op collagenase digestie en dichtheid centrifugatie wordt aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. ontworpen voor rat levercellen isolation en levert hoge opbrengst (tot 14 x 10 6 cellen per muis) en een hoge zuiverheid (> 95%) van Kupffer cellen. Deze isolatie methode vereist geen geavanceerde of dure apparatuur en vormt daarom een ​​ideale compromis tussen complexiteit en cel opbrengst. Het gebruik van zwaardere muizen (35-45 g) verbetert de opbrengst van de isolatiemethode en maakt daarnaast opmerkelijk de procedure van poortader canule. De toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes f -CNTs gemeten in dit model de gemodificeerde LDH assay. Deze methode beoordeelt cellevensvatbaarheid door meting van het gebrek aan structurele integriteit van Kupffer celmembraan na incubatie met F -CNTs. Toxiciteit veroorzaakt door f -CNTs kunnen consequent worden gemeten met behulp van deze test, benadrukken dat geïsoleerde Kupffer cellen zijn nuttig voor de toxiciteit van nanodeeltjes testen. Het algemene begrip van nanotoxicologie kunnen profiteren van dergelijke modellen, waardoor de nanodeeltjes selectie voor klinische vertaling efficiënt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebied van nanotoxicologie onderzoek richt zich op het biologisch effect van nanodeeltjes te karakteriseren. Toxicologische studies op basis van in vivo onderzoek blijven de meest accurate methoden. Echter, is het gebruik beperkt door de kosten, arbeid en tijd eisen 1. Als alternatief zijn in vitro assays werden gebruikt vanwege hun eenvoud en de mogelijkheid van het ontwikkelen high-throughput in vitro testplatformen 2 - zodat uitbreiding van het aantal geteste omstandigheden. De meeste nanotoxicological studies worden uitgevoerd met behulp van in vitro testen met onsterfelijk gemaakte cellijnen. Er zijn echter zorgen over de extrapolatie van deze experimentele bevindingen in vivo toxicologische effecten 3. Inderdaad kan de eigenschappen van geïmmortaliseerde cellijnen significant van weefsels ze zijn ontleend, bijvoorbeeld genetische transformatie 4, verslechtering van de belangrijkste morfologische kenmerken te5, het verlies van cellulaire polariteit 6 en functionele veranderingen, zoals de regulering van ontstekingsmediatoren 7.

Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag populatie in het lichaam en die direct in contact met bloed door langs de wand van de lever sinusoïden. Als onderdeel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die macrofagen verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes en vormen derhalve een zeer geschikt model de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. In vivo 8 en in vitro studies 9 van inflammatoire responsen geassocieerd met Kupffer cellen blootgesteld aan nanodeeltjes elders gepubliceerd. Kupffer cellen zijn ook betrokken bij de pathogenese van leverziekten zoals alcoholische leverziekte 10, leverfibrose 11 of virale hepatitis 12. Er werd gemeld dat geïsoleerde Kupffer cellen nuttig inzicht om cellulaire mechanismen inv beschrijvenolved in de lever verstoring 13,14.

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren en zuiveren Kupffer cellen. Celisolatie kan ontstaan ​​door mechanische of enzymatische dissociatie 15. Collagenase spijsvertering toont het voordeel van het behoud van de functionele integriteit van Kupffer cellen, terwijl leidt tot hoge Kupffer celopbrengst 16. Vele experimentele benaderingen, variërend in complexiteit en kosten, zijn gebruikt om Kupffercellen scheiden van andere levercel populaties. Zo kunnen Kupffer cellen zuiverheid worden bereikt door immunoaffiniteit 17, stroom 18 elektroforese, selectieve adhesie 16 of centrifugale technieken 16 die cellen te selecteren op basis van hun grootte en dichtheid. Een combinatie van deze methoden kunnen worden gekozen om de zuiverheid van de bevolking 16 verhogen. Er is geen consensus over de ideale methode voor Kupffer cel isolatie, want het is meestal afhankelijk van de toepassing en de beschikbare uitrustingt. In het geval van toxiciteit nanodeeltjes testen, de eenvoud en hoge opbrengst van de techniek in verband met functionele behoud van Kupffer cellen bleken het meest geschikt voor deze toepassing zijn.

De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De methode werd aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. 16 ontworpen voor rattenlever celisolatie. De meeste studies gerapporteerd en beschreven de isolatie van Kupffer cellen uit levers rat. Hierin beschrijven we een werkwijze voor Kupffercellen isoleren uit muizenlever, met een hoge opbrengst en zuiverheid. Het gebruik van muizen reduceert het experiment kosten en maakt de behandeling van verscheidene lever grote hoeveelheden Kupffercellen toxiciteit nanodeeltjes testen te verkrijgen.

In het volgende protocol werden Kupffer cellen geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f -CNTs). De unieke fysisch-chemische eigenschappen van CNTs - zoals bij hoge lengte tot diameter groot oppervlak hebben CNTs interessante kandidaten die als vectoren voor therapie en diagnose doeleinden. Echter, zijn bezorgdheid geuit over de toxiciteit van CNT 19, en de ontwikkeling van nieuwe in vitro testen is gericht op het vergroten van het inzicht in de CNT biologisch effect. Toxiciteit in Kupffer-cel is geassocieerd met een gebrek aan structurele integriteit van de celmembraan. Dit wordt gemeten door het verlies van de cytoplasmatische enzym LDH uit de cel in de supernatant. Het principe van deze methode is daarom om vrijgekomen LDH te verwijderen en meten wat overblijft in de cellen 20. Dit gebeurt in plaats van het meten van de vrijgekomen LDH in de supernatant omdat de aanwezigheid van CNTs in het supernatant interfereert met de test 21.

Wij stellen voor het gebruik van deze eenvoudige en kosteneffectieve Kupffer celisolatie method hoge aantal functionele Kupffer cellen te isoleren. Hierdoor kan de screening van toxiciteit van verschillende nanodeeltjes, in een relevante primaire macrofaag model.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, voorschriften en regelgevende instanties. Het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder de leiding en de goedkeuring van de Britse Home office regelgeving

1. Perfusie and Cell Collection (figuur 1)

figure-protocol-1
Figuur 1:. Leverperfusie Na verdoving van de muis, het spijsverteringskanaal lateraal naar links van de buik om de poortader (PV) toegankelijk te maken. De PV canule een trage stroomsnelheid (1-3 ml / min) van EGTA / HBSS oplossing en de onderste veina cava (IVC) onmiddellijk gescheurd om overtollige druk in de lever te voorkomen. In de eerste minuut van perfusie, wordt het debiet geleidelijk verhoogd tot 7 ml / min. De collagenase wordt vervolgens geperfuseerd bij 10 ml / min totdat de volledige digestie wordt verkregen.

  1. Prepaopnieuw vers alle reagentia in het materiaal tabel beschreven.
  2. Warm de EGTA (ethyleenglycol Tetra-azijnzuur) / HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) oplossing (50 ml per muis) en collagenase-oplossing (100 ml per muis) gedurende 30 minuten bij 40 ° C.
  3. Eerst spoelen met 70% ethanol de pomp flexibele slang. Giet 40 ml van EGTA / HBSS oplossing in een centrifugebuis ondergedompeld in het waterbad en spoel de pomp flexibele buis met voorverwarmde EGTA / HBSS oplossing.
  4. Voer terminal verdoving met een barbituraat om op betrouwbare wijze te produceren bewusteloosheid voor respiratoire depressie en de dood. Injecteer fenobarbital bij 1 mg / kg, ip een vrouwelijke of mannelijke CD1-muizen (35-45 g). Bevestig de narcose door teen knijpen.
  5. Scheren buik haren en steriliseer de buik oppervlak met 70% ethanol-oplossing.
  6. Knip de buikholte en de poortader en inferior vena cava bloot door het bewegen van de darm lateraal links van de buik.
  7. Stert de pomp met een snelheid van 1-3 ml / min met EGTA / HBSS oplossing canule en de poortader met een 23 g vlindernaald (wings gesneden). Klem het deel van de poortader gecanuleerde met de 23-G naald en vervolgens draai de serrefine tang aan het oppervlak van de geopende muis buik. De lever moet snel bleek binnen de eerste 30 seconden van EGTA / HBSS oplossing perfusie.
  8. Snel insnijden het onderste gedeelte van de inferior vena cava overdruk gebouw in de lever voorkomen, en vervolgens krachtiger debiet geleidelijk 7 ml / min, in de eerste minuut van perfusie. Het dier sterft als gevolg van bloeden secundair aan caval venapunctie Vena.
  9. Bij minder dan 5 ml van EGTA / HBSS oplossing is overgebleven in de centrifugebuis, vul het met Collagenase Solution (40-50 ml). Verhoog het debiet geleidelijk 10 ml / min gedurende 30 sec.
  10. Maak de lever deining door druk op de onderste vena cava, met een pincet voor 5-10 sec intervallen. This kan periodiek worden uitgevoerd (5-10 keer tijdens de spijsvertering). Deze stap zal de lever cel dissociatie te verbeteren en vermindering van de perfusie tijd met collagenase.
  11. Bij minder dan 10 ml collagenase oplossing achterblijft in de centrifugebuis, giet 40-50 ml voorverwarmde Collagenase oplossing in de centrifugebuis.
  12. Na 10-15 min perfusie en ongeveer 70-80 ml collagenase oplossing geperfuseerd met een klein druk op het oppervlak van de lever met een pincet. Een afdruk van de druk geeft aan dat de lever cellen worden gescheiden.
  13. Haal de lever uit de buikholte als een stuk en plaats het in een centrifuge buisje met 20-30 ml Kupffercellen Isolation Medium. Blijf levercellen op ijs of bij 4 ° C gedurende 3 uur maximum ter voorkoming van hinder levensvatbaarheid levercel.
  14. Herhaal de perfusie over verscheidene dieren indien nodig, terwijl de geperfuseerde lever op ijs. Pool 1-3 levers voor zuivering en ga verder met fase 3.

2. Bereiding van de dichtheidsgradiënt te centrifugeren (figuur 2)

figure-protocol-2
Figuur 2:. Voorbereiding van de dichtheidsgradiënt Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. De SIP wordt bereid door 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing 1,7 ml 10 x PBS. Een 5 ml SIP worden gemengd met 15 ml PBS tot 20 ml 25% SIP oplossing. 10 ml van SIP worden gemengd met 10 ml PBS tot 20 ml 50% SIP oplossing. Een centrifugebuis bevattende 50% SIP-oplossing (20 ml) wordt gekanteld en 25% SIP-oplossing (20 ml) wordt langzaam toegevoegd met behulp van een serologische pipet 25 ml.

  1. Ga verder met de volgende stappen (hoofdstuk 2., 3. en 5.) onder steriele conditie en houden cellen op ijs of bij 4 ° C. Bereid de SIP (oplossing isotoon beklede silicadeeltjes) door mengen van 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing met 1,7 ml 10 x PBS.
  2. Aan 20 ml van 25% SIP oplossing te maken, meng 5 ml van SIP met 15 ml PBS. Aan 20 ml van 50% SIP oplossing te maken, meng 10 ml van SIP met 10 ml PBS.
  3. Vul een centrifugebuis van 20 ml van de 50% oplossing SIP. Kantel de centrifugebuis een hoek dicht bij 90 ° en voeg langzaam 25% de SIP-oplossing (20 ml) aan de zijwand van de buis met behulp van een 25 ml serologische pipet, zonder het oppervlak van de 50% SIP laag raken. Bij het toevoegen van de 25% SIP oplossing geleidelijk verminderen van de hoek van de buis. Houd de dichtheidsgradiënt op ijs tot gebruik.

3. Kupffer Cell Purification (figuur 3)

figure-protocol-3
Figuur 3:. Zuivering van Kupffer cellen door dichtheidsgradiënt centrifugeren en celadhesie Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. (A) na breuk van de Glisson de capsule worden levercellen gefiltreerd door een 100 micrometer zeef. De suspensie wordt bij 50 x g gecentrifugeerd om hepatocyten (pellets) gooi en het verzamelen van de niet-parenchymcel fractie (supernatant). Deze stap wordt 3 maal herhaald. Non-parenchymale cellen worden toegevoegd op een discontinue gradiënt isotone en gecentrifugeerd bij 800 x g gedurende 15 min. Kupffer cellen vanuit het 25% SIP kussen worden verder gezuiverd door celadhesie selectie. (B) Cellen worden uitgeplaat in 24-well plaat en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min. Niet-hechtende cellen worden eenmaal gewassen met 500 pi HBSS. Kupffercellen tonen hun hechtende morfologie 4 uur na plateren, wanneer f -CNTs kunnen worden toegevoegd aan de cellen. De schaal bar vertegenwoordigt 25 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Zet een doorbloed lever in een petrischaal met 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Scheuren van de Glisson's capsule (membraan van de lever) met een schaar en laat alle levercellen in de Kupffer-cel isolatiemedium. Filtreer de oplossing hoewel een 100 urn zeef cel te halen in een centrifugebuis. Herhaal de perfusie procedure aanvullende levers geperfuseerd en bundelen de cellen in dezelfde centrifugebuis (15 ml van een muis, tot 45 ml van drie muizen).
  2. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Parenchymale cellen (hepatocyten) zal in de pellet en niet-parenchymale cellen (inclusief Kupffercellen) zal in het supernatant.
  3. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone centrifugebuis en centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 minuten elk. Herhaal deze stap drie keer.
  4. Centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min aan niet-parenchymale cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van Kupffer Cell isolatiemedium.
  5. Voeg de niet-parenchymcellen-oplossing isotoon de discontinue gradiënt 25/50%, zoals beschreven in 2.3. Centrifuge bij 850 xg gedurende 15 min zonder versnelling of breken.
  6. Lokaliseer de Kupffer verrijkte celfractie troebele verschijning in de 25% fractie SIP nabij de 25/50% SIP interface (Figuur 3). Met behulp van een 10 ml serologische pipet, zuig ongeveer 12 ml van de verrijkte Kupffer celfractie. Transfer cellen in een centrifugebuis die 35-40 ml Kupffer Cell isolatiemedium. Meng voorzichtig en centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
  7. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5-10 ml voorverwarmde Kupffer celkweekmedium. Tellen cellen (hemocytometer) en meet de levensvatbaarheid met trypanblauw vlekken.
  8. Plate het gezuiverde niet-parenchymale cellen in 24-wells platen met een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 (figuur 3). Na 30 min, verwijder voorzichtig het medium, wassen met voorverwarmd Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) keer dan vervangenmet 500 pl vers en voorverwarmde Kupffer Cell Culture Medium (per putje).
  9. Laat Kupffer cellen ten minste 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 vóór de behandeling met nanodeeltjes, zodat zij hun hechtende morfologie verwerven.

4. Karakterisering

  1. Kupffercellen Zuiverheid
    1. Bereid verse PBS / BSA-oplossing gebruikt om Kupffer levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Was de cellen eenmaal met 500 ui PBS / BSA oplossing. Verwijder de PBS / BSA-oplossing en los Kupffer cellen in 500 ul van verse PBS / BSA-oplossing met zachte schrapen. Wanneer cellen worden uitgeplaat in 24-puts platen inkorten uiteinden van schraapbladen met een schaar de onthechting gemakkelijker gaan maken. Overdracht cellen in flowcytometrie tubes.
    2. Tellen Kupffer cellen met een hemocytometer en centrifuge 1 x 10 5 cellen bij 1350 x g. Resuspendeer Kupffer cellen in 30 ui F4 / 80 antilichaam (puur). Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Houd de ongekleurde cellen (niet geïncubeerd met het antilichaam) op ijs.
    3. Voeg 2 ml PBS / BSA oplossing in gekleurde cellen, centrifuge op 1350 g gedurende 5 minuten en gooi de resulterende supernatant. Resuspendeer gekleurde cellen in 200 ul PBS / BSA.
    4. Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-1 kanaal.
    5. Herhaal deze procedure Gekleurde Kupffer cellen behoud van dezelfde instellingen voor de flowcytometrie analyse van ongekleurde Kupffer cellen. Selecteren en kwantificeren van de fluorescentie van gekleurde cellen om de zuiverheid van Kupffer cellen te beoordelen.
  2. Kupffer Cell fagocytoseactiviteit
    1. Vervang medium met 0,5% (v / v) fluorescerende beads in Kupffer celkweekmedium en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
    2. Om niet-geïnternaliseerde kralen, centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, di verwijderenscard het supernatant en resuspendeer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing. Herhaal deze stap nog 2 keer.
    3. Schraap Kupffer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing en overdracht cellen in een flow-cytometrie buis.
    4. Centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, gooi het supernatant en resuspendeer cellen in 200 ul PBS / BSA Solution.
    5. Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-2-kanaal.

5. Incubatie van Chemisch gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f -CNTs)

  1. Bereid een dispersie van f -CNTs (1 mg / ml) in water door sonicatie gedurende 15 min vóór gebruik. F -CNTs bereid in-house 22.
  2. Bereid 2x geconcentreerd f- CNTs dispersie in Kupffer celkweekmedium. Sonificeer f- CNTs verspreid in medium voor2 min voordat u doorgaat met stap 5.3).
  3. Voor elke goed, vervang 250 ul van oude media met 250 pi van 2x f -CNTs dispersie. Onbehandelde putten (250 ui geconditioneerd medium + 250 ul vers Kupffer Cell Culture Medium) en putjes behandeld met 10% DMSO worden als negatieve en positieve controles, respectievelijk.
  4. Incubeer Kupffer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 of 72 uur.

6. toxiciteit Evaluatie van f -CNTs in Kupffer cellen door de Modified lactaatdehydrogenase (LDH) Assay

  1. Verwijder het supernatant.
  2. Voeg 200 ul (per putje van 24-putjes plaat) lysisbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten 1 uur.
  3. Na het uitvoeren van krachtig pipetteren, verzamel gelyseerde Kupffer cellen in microcentrifuge buizen en centrifugeer bij 40.000 xg gedurende 10 min f -CNTs die door cellen en celafval werden pelleteren.
  4. Verzamel de bovenstaande vloeistoffen (ƒ-CNT gratis) inmicrocentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C of ga verder met stap 6.5).
  5. Transfer 50 pi in een 96-well plaat en een gelijk volume van het substraatmengsel oplossing (LDH kit) aan elk putje. Bedek de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor het toevoegen van 50 pi van de stopoplossing (LDH kit). Drievoud blanco putjes die 50 pl lysisbuffer, 50 ui substraatmengsel-oplossing en 50 gl stopoplossing toevoegen.
  6. Lees de absorptie bij 490 nm in een microplaat reader en gebruik de volgende formule om de (%) cellevensvatbaarheid te berekenen.

figure-protocol-4

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het aantal niet-gezuiverde parenchymcellen consistent was en varieerde tussen 8 en 14 x 10 6 cellen per muis (17 isolaties werden uitgevoerd). Elke muis contrast was voldoende om 16 tot 28 wells plaat. Cel levensvatbaarheid door trypan blauw kleuring toonden cellevensvatbaarheid ~ 95%. Kupffer cellen vertoonden een ronde vorm in 30 min incubatie bij 37 ° C, in verband met hun onvolledige hechtende morfologie (figuur 4A). Bij 4 uur incuberen en vervolgens werden de cellen uitgespreid en celclu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende stappen zijn cruciaal voor hoge opbrengst en hoge levensvatbaarheid van Kupffercellen bereiken. Aseptische omstandigheden moeten worden gebruikt om de kans op bacteriële en fungale contaminatie. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voor gebruik. Reagentia moeten vers worden bereid voor het uitvoeren van de isolatie procedure.

De keuze van de collagenase IV, met een lage tryptisch activiteit, is cruciaal. Verschillende partijen van dezelfde leverancier verschillende enzy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het EU FP7-ITN Marie-Curie Netwerkprogramma RADDEL. MB en KAJ willen Joe Varguese en Rui Serra Maia graag bedanken voor hun hulp en suggesties tijdens de optimalisatie van de Kupffer celisolatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Euthatal (pentobarbital natrium)Merial
CD1 muizenCharles River  -Het gewicht van de muis moet variëren van 35 tot 45 g. We adviseren het gebruik van mannelijke CD1-muizen omdat hun gewicht snel toeneemt (bv. een mannelijke CD1-muis van 7 weken oud overschrijdt 35 g in gewicht). Het wordt ook aangeraden om vooraf contact op te nemen met de dierenleverancier om de levering van oudere dieren te regelen. Als alternatief kunnen dieren binnenshuis zijn om het gewenste gewicht te bereiken. 
HBSS (Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat)  Life Technologies  14175-053HBSS moet  Ca2+ vrij zijn. 
Ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA) tetranatriumzout Sigma-Aldrich  E8145  EDTA kan ook worden gebruikt, maar EGTA heeft het voordeel dat het Ca2+ selectief aan zich bindt. 
HEPES (1 M) Life Technologies  15630-056 100 ml 
Collageenase type IV Worthington CSL-4 Het wordt geadviseerd om verschillende batches van collageenase te testen of op zijn minst de leverancier te vermelden dat het product geschikt moet zijn voor isolatie van levercellen 
 Low glucose DMEM Sigma-Aldrich  D5523 500 ml 
RPMI (met natriumpyruvaat en Glutamax) Life Technologies  12633-012 500 ml
Penicilline/Steptomycine Life Technologies  15140-122100 ml
Fetaal bovien serum First-Link  60-00-850 500 ml 
Trypanblauwoplossing Sigma-Aldrich T8154 100 ml 
Gekoelde silicadeeltje-oplossing (Percoll)GE Healtcare  17-0891-02 Percoll® is zeer stabiel en kan meerdere jaren worden bewaard 
1x Fosfaatbufferoplossing met zoutoplossing  Life Technologies  10010-023500 ml 
10x Fosfaatbufferoplossing met zoutoplossing  Life Technologies  70011-036500 ml
Dimethylsulfoxide Fisher D/4120/PB08 500 ml 
LDH-kit (CytoTox 96) Promega G1781 Beschermd tegen licht bewaren 
DMEM zonder fenolrode kleurstofLife Technologies  31053-028 500 ml 
F4/80-antilichaam (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488Niet verdunnen, gebruikt in zuivere vorm voor flowcytometrie
Fluorescente kralenSigmaL2778Latexkralen, amine-gemodificeerd polystyreen, fluorescerend rood. 1 ml
Naam van het materiaalBedrijf Catalogusnummer Opmerkingen/Beschrijving 
Butterfly-bloedafnameset (23 G/305 mm lange buis)  BD 367288
Spuitfilters (0,22 μm Blue Rim) Minisart 16534-K 
Centrifugebuizen (50 ml blauwe dop) BD Biosciences, Falcon 35 2070 
Petrischaal (90 x 15 mm) Thermo Fisher Scientific  BSN 101VR20 
100 μm celzeef  BD  352360
Peristaltiekpomp Watson Marlow SciQ 300  Spoel de buis voor en na elk gebruik met steriel PBS en 70% ethanol.
24-welplatenCorning  3526
96-welplaten Corning  3595
Centrifuge Eppendorf5810R
Plate readerBMG LabtechFLUOstar Omega
Serrefine-tangHammacher GmbH Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051De serrefine-tang maakt het mogelijk om het vat dat is gekannuleerd met de 23 G-naald te klemmen zonder dat de tang tijdens de perfusieprocedure vastgehouden hoeft te worden. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
FlowcytometriebuizenBD Biosciences, Falcon 352052
Microcentrifugebuizen (1,5 ml)Elkay  000-MICR-150
CelkrabberBD Biosciences, Falcon353086Snijd de uiteinden van de messen af met een paar schaar om cellen in 24-welplaten te schrapen.
Naam van het reagensBedrijf Catalogusnummer Opmerkingen/Beschrijving 
 EGTA (Ethyleenglycoltetraazijnzuur)/HBSS (Hank's gebalanceerde zout-oplossing) oplossing HBSS bevattend 0,5 mM EGTA en 25 mM HEPES. Breng de pH naar 7,4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kupffer Cell IsolationNanoparticle Toxicity TestingMouse Liver MacrophagesCollagenase DigestionDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisFunctionalized Carbon NanotubesModified LDH AssayNon Parenchymal CellsPortal Vein Cannulation

Gerelateerde artikelen