Dit artikel toont chirurgische procedures van gastro-oesofageale reflux bij muizen. Deze modellen zijn nuttige hulpmiddelen voor onderzoek naar mechanismen en behandeling van gastro-oesofageale refluxziekte en mogelijk Barrett’s slokdarm en slokdarmadenoom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgische Modellen van Gastro-oesofageale met Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn meerdere chirurgische ingrepen gemeld die gastro-oesofageale reflux bij dieren kunnen veroorzaken. Hierin beschrijven we drie chirurgische modellen met muizen met als doel reflux van maaginhoud, twaalfvingerige darminhoud of gemengde inhoud te induceren. Chirurgische procedures en algemene principes zijn in detail beschreven. Een onderzoeker met chirurgische ervaring zou de techniek na een korte periode van oefening moeten kunnen begrijpen. Na de operatie kunnen de meeste muizen overleven en reflux-oesofagitis ontwikkelen, vergelijkbaar met die bij mensen. Er moet echter worden opgemerkt dat histologische verschillen tussen de slokdarm van muizen en mensen de inherente beperkingen van deze chirurgische modellen zijn. Indien gebruikt voor onderzoek naar Barrett's slokdarm en adenocarcinoom, kunnen deze procedures mogelijk moeten worden gecombineerd met genetische modificaties.
Inleiding
Gastro-oesofageale refluxziekte (GERD) is een chronische aandoening veroorzaakt door de langdurige blootstelling van de distale slokdarm aan maag- of gastroduodenale inhoud1. Langdurige blootstelling aan deze schadelijke refluxaten beschadigt de intrinsieke verdedigingen in het slokdarm epitheel en resulteert daardoor in oesofagitis2. Barrett's slokdarm ontstaat in de context van chronische reflux, en is een premaligne lesie met een verhoogd risico op adenocarcinoom van de slokdarm3,4. Ondanks het klinische belang, zijn de mechanismen van GERD, Barrett's slokdarm en adenocarcinoom niet goed begrepen.
Diermodellen zijn essentieel voor onderzoek naar etiologie, pathologie, moleculaire mechanismen, preventie en behandeling van menselijke ziekten. Tot op heden zijn verschillende diermodellen van GERD, Barrett's slokdarm en adenocarcinoom ontwikkeld met behulp van modeldieren5,6. De slokdarm van een muis is bekleed met meerlaags plaveiselepitheel, dat histologisch vergelijkbaar is met dat van de menselijke slokdarm. Hoewel een muizenslokdarm verschilt van de menselijke slokdarm in termen van keratinisatie en het ontbreken van submucosale klieren, is de muis nog steeds een aantrekkelijk modeldier vanwege de relatief lage onderhoudskosten en de mogelijkheid van geavanceerde genetische modificaties. Twee benaderingen worden vaak gebruikt om GERD, Barrett's slokdarm en adenocarcinoom bij muizen te modelleren: refluxchirurgie en genetische modificatie. Refluxchirurgie is de beste manier om reflux te induceren en genetische modificaties bootsen moleculaire veranderingen na5,7. Refluxchirurgie kan worden gecombineerd met genetische modificaties om de ziektemechanismen beter te begrijpen8.
Veel chirurgische procedures zijn door ons en anderen gerapporteerd6,9: (1) gastrische reflux: pylorische ligatie, pylorische constrictie met forestomach ligatie, Wendel cardioplastiek en esophagogastrische anastomose; (2) gemengde reflux: esophagogastrododenale anastomose, esophagoduodenostomie (of esofago-jejunostomie); (3) duodenale reflux: esophagogastrododenale anastomose plus gastrectomie; (4) reflux van chemische componenten: bilieuze reflux, pancreatische reflux, slokdarmperfusie; en (5) slokdarmtransplantatie5. Onlangs werd een microchirurgisch muismodel gerapporteerd om jejunale reflux te produceren via een esofago-jejunostomie met magneten10. Deze chirurgische modellen hebben voordelen boven in vitro celcultuur of organotypische cultuurmodellen. In vitro kunnen slokdarmcellen geen medium met hoge zuurgraad of hoge concentraties galzuren verdragen. Ongeconjugeerde galzuren die gewoonlijk worden gebruikt om veranderingen in slokdarmcellen in vitro te produceren, zijn meestal niet aanwezig in het duodenale refluxaat in vivo. Dus conclusies getrokken uit dergelijke in vitro studies moeten met voorzichtigheid worden benaderd.
Chirurgie aan de slokdarm van de muis blijft een technische uitdaging vanwege het kleine formaat. Een lage postoperatieve overlevingssnelheid maakt experimenten die een bepaalde steekproefomvang vereisen, niet toe aan het bereiken van statistisch degelijke conclusies. In het verleden hebben we met succes chirurgische modellen van gastrische reflux, gemengde reflux en duodenale reflux ontwikkeld en gekarakteriseerd met muizen in langetermijnexperimenten9,11,12. We hebben ook advies verleend aan verschillende andere groepen bij hun muizenchirurgie. Hierin beschrijven we drie chirurgische procedures bij muizen om de gemeenschap te helpen deze modellen in hun laboratoria te vestigen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Mouse Voorbereiding
- Gebruik muizen meer dan ~ 20 g lichaamsgewicht of hoger ~ 6 weken in leeftijd voor een operatie.
- Voor de operatie, geeft muizen een laboratorium chow en water ad libitum en op een 00:12 uur licht-donker cyclus te handhaven.
- Scheer de chirurgische gebied met een tondeuse. Verdoven muizen door intraperitoneale injectie van 80 mg / kg ketamine en 12 mg / kg xylazine. Deze dosis zet muizen in slaap in een paar minuten en biedt voldoende verdoving voor de volgende chirurgische procedures.
- Bevestig juiste verdoving op basis van de afwezigheid van de cornea reflex en ledematen intrekken wanneer de voetzool wordt geknepen. Breng smerende oogzalf op de ogen tot droog voorkomen.
- Steriliseren huid met betadine oplossing.
2. maagreflux Model (Figuur 1B)
- Maak een bovenstemiddellijn incisie van ~ 2 cm vanaf de xiphoid wijst naar de anus.
- Openstellen van de buikholte door de middellijn. Verwijder de zwaardvormig blootstelling met een schaar verbeteren.
- Apart en snijd het bindweefsel tussen de lever en de maag. Afbinden en snijd het schip bundel tussen de milt en de fundus om volledig vrij van de fundus.
- Draai de fundus iets naar links en links van de gastro-oesofageale overgang bloot in het veld. Wordt 5 mm longitudinale incisie op de spier langs de distale slokdarm met een scherpe schaar het epitheel bloot.
- Opengesneden de epitheel langs dezelfde richting (incisie 1, Figuur 1B). Maak drie insnijdingen aan de voormaag (insnijding 2, 3 en 4, figuur 1B) om de meeste van de voormaag af met scherpe werkende schaar. Als de maag niet leeg is, voorzichtig maaginhoud te verwijderen.
- Plaats een 8-0 prolene Suture (met een spitse punt naald) door middel van een punt (op de slokdarm) en Point een '(op de voormaag) met accurate mucosale oppositie mucosale. Eveneens plaats hechtingen door het punt B en punt B ', en andere paren van punten, respectievelijk. Gelijkmatig ruimte deze hechtingen 3-4 mm van elkaar.
- Was de buikholte met fysiologische zoutoplossing te ruimen bloed en maaginhoud. Sluit de buikwand met zijden hechtingen en de huid met metalen clips.
3. Mixed Reflux Model (figuur 1C)
- Volg de stappen 2.1 tot 2.4 op de gastro-oesofageale overgang bloot.
- Voorzichtig scheiden de dorsale zijde van de slokdarm van de bloedvaten achter de slokdarm. Passeren een klein wattenstaafje tussen de slokdarm en de bloedvaten.
Opmerking: Katoen kan gedeeltelijk uit de top verwijderd worden om de omvang ervan te verminderen. Dit wattenstaafje dient twee doelen, het optillen van de slokdarm en de bloedvaten beschermen. - Maak twee 5 mm longitudinale incisions elk van de gastro-oesofageale overgang en het proximale uiteinde van duodenum naast de pylorus met scherpe werkende schaar. Voor de insnijding op het duodenum, te voorkomen bloedvaten en op de anti-mesenteriale grens.
- Anastomoseren de insnijdingen met accurate mucosale oppositie met onderbroken 8-0 Prolene hechtingen mucosale. Gewoonlijk plaats 3-4 hechtingen aan de rugzijde en 2-3 hechtingen aan de voorzijde.
- Verwijder het wattenstaafje. Was de buikholte met fysiologische zoutoplossing en sluit de buikwand en de huid.
4. Duodenal Reflux Model (figuur 1D)
- Volg stap 3,1-3,4 voor gemengde reflux genereren.
- Til de maag om zijn achterkant bloot. Een leverkwab kunnen onder bindweefsel tussen de lever en de achterkant van de maag. Snijden voorzichtig het bindweefsel, goed beschermen de lever en de bloedvaten aan de rugzijde van de slokdarm bloot.
- Ligeren ende bloedvaten snijden. Afbinden en snijd de slokdarm aan de gastro-oesofageale overgang.
- Afbinden het duodenum aan de pylorus. Afbinden en snijd de mesenterium. Verwijder het gehele maag.
- Was de buikholte met een normale zoutoplossing. Sluit de buikwand en de huid.
5. Post-chirurgische behandeling
- Na de operatie te handhaven lichaamstemperatuur met een verwarmingselement. Pas na het herwinnen borstligging, plaatst de muizen terug met andere dieren.
- Geef antibiotica en pijnstillende om infectie te voorkomen en verlichten de pijn. Injecteer Baytril (10 mg / kg, ip, qd, gedurende 3 dagen) om infectie te voorkomen en buprenorfine hydrochloride (0,05 mg / kg, sc, bid. Twee dagen) als pijnstiller. Vasten is niet nodig na de operatie.
Een vloeibare of zachte dieet kan worden. - Beoordelen van de algemene gezondheidstoestand van de dagelijkse basis.If de muizen tonen de volgende symptomen (dramatische gewichtsverlies> 15%, het ontbreken van appetite, stemgebruik, ontslag uit de mond, neus of ogen, gebogen gebaar, inactiviteit, abnormale verzorging activiteit), euthanaseren de muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De meeste muizen (> 95%) kan de operatie te overleven. Tijdens de perioperatieve periode, de belangrijkste doodsoorzaken onder overdosis verdovingsmiddelen, bloeden en onbekende redenen.
Vier weken na de operatie,> 90% muizen met maagreflux of gemengde reflux en> 80% muizen met duodenale reflux overleven. Tijdens deze periode, voornamelijk muizen sterven oesofageale vernauwing en het onvermogen om te eten. Deze muizen vertonen tekenen van ernstige stress (gebogen houding, inactivite...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Diverse chirurgische modellen zijn opgericht om maag, twaalfvingerige darm en gemengde reflux bij knaagdieren na te bootsen. Deze drie hier beschreven geschikt voor langdurige experimenten met redelijke prijzen postoperatieve overleving. Een onderzoeker met chirurgische ervaring moet in staat zijn de techniek begrijpen na een korte periode van gebruik.
Bloeden kan voortvloeien uit intraperitoneale injectie van anesthesie voor de operatie, scheuring van de lever tijdens scheiding van het bind...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Een van de auteurs (XC) ontving financiering die werd verstrekt door Takeda Pharmaceutical Company Ltd, dat basisonderzoek ondersteunt dat verband houdt met gastro-oesofageale refluxziekte. Geen van de reagentia of instrumenten die in dit artikel zijn gebruikt, wordt geproduceerd door dit bedrijf.
Dankbetuigingen
Wij worden ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Natural Science Foundation of China (NO. 81400590), National Institutes of Health (U54 CA156735) en Takeda Pharmaceutical Company Ltd. (MA-NC-D-156).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
Referenties
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59(2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
