Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device

Samenvatting

De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusietechnieken met behulp van ons eigen apparaat, maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om de decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.

Samenvatting

Decellularisatie en recellularisatie van parenchymale organen kunnen de generatie van functionele organen in vitro mogelijk maken, en er zijn al verschillende protocollen voor de decellularisatie van rattenlever gepubliceerd. We hadden als doel het decellularisatieproces te verbeteren door de constructie van een eigen perfusieapparaat dat selectieve perfusie via de poortader en/of de leverarterie mogelijk maakt. Verder probeerden we perfusie uit te voeren onder oscillerende omgevingsdrukcondities om de homogeniteit van decellularisatie te verbeteren. De homogeniteit van perfusie decellularisatie is tot nu toe een onderschatte factor. Tijdens decellularisatie kunnen gebieden binnen het orgaan die slecht geperfuseerd zijn nog steeds cellen bevatten, terwijl de extracellulaire matrix (ECM) in goed geperfuseerde gebieden al kan worden beïnvloed door alkalische detergenten. Oscillerende drukveranderingen kunnen de intra-abdominale drukveranderingen nabootsen die tijdens de ademhaling optreden om microperfusie in de lever te optimaliseren. In de hier gepresenteerde studie werden gedecellulariseerde rattenlevermatrices geanalyseerd door histologische kleuring, DNA-gehalteanalyse en corrosiecasting. Perfusie via de leverarterie vertoonde homogenere resultaten dan portaalveneuze perfusie. De toepassing van oscillerende drukcondities verbeterde de effectiviteit van perfusie decellularisatie. Levers geperfuseerd via de leverarterie en onder oscillerende drukcondities vertoonden de beste resultaten. De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusie met behulp van ons eigen apparaat maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.

Inleiding

Decellularisatie en hercellularisatie kunnen in vitro ¹ het genereren van functionele, transplanteren organen mogelijk maken. Door het verwijderen van cellen en antigeen materiaal (bv. DNA, a-Gal epitopen) uit een orgaan, de niet- of minder immunogeen extracellulaire matrix (ECM) worden verkregen. Deze matrix behoudt de driedimensionale microanatomie van een orgaan en kan dienen als het ideale biomatrix voor herbevolking met cellen van een andere, eventueel xenogene oorsprong ^2. Aldus zou een gedecellulariseerde rattenlever matrix worden herbevolkt met humane levercellen. Dit gehumaniseerd micro-lever zou kunnen dienen als een ex vivo model voor onderzoek naar ziekten (bv., Aangeboren stofwisselingsziekten, virale ziekten of maligniteiten) of voor preklinische farmaceutische testen ^3.

Er zijn verschillende protocollen voor rat leverperfusie decellularisatie zijn reeds gepubliceerd ^4-13. In alle protocollen, decellularordening werd bereikt door perfusie van basische ionische of niet-ionische detergentia via de canule poortader. Om het beste van onze kennis, waren we de eerste groep om rattenlever decellularisatie rapporteren door selectieve perfusie via de poortader en / of de rat leverslagader ^14. Het inschakelen van de selectieve perfusie van verschillende vasculaire systemen in de lever cellen ontdoen betere resultaten stellen en bovendien een belangrijke rol in de cellulaire herbevolking spelen.

In de studie hier beschreven, werden levers geperfundeerd in een op maat gemaakt proprietary perfusie apparaat, waardoor perfusie onder oscillerende druk omstandigheden. Deze druk omstandigheden na te bootsen de fysiologische respiratoire-afhankelijke perfusie van de lever: in situ, de lever hangt onder de copula van het middenrif, waarvan de beweging tijdens de ademhaling heeft een directe invloed op de lever perfusie. Inspiration bijzonder leidt tot verlaging van het membraan en knijpen van de lever, optimaliserenhepato-veneuze uitstroom, terwijl vervaldatum leidt tot verhoging van de lever en het verlagen van de intra-abdominale druk om portal-veneuze instroom ¹⁵ optimaliseren.

Ons doel was om te evalueren of oscillerende druk omstandigheden hebben een invloed op de homogeniteit van de rat leverperfusie decellularisatie door het nabootsen van intra-abdominale voorwaarden ex vivo. De homogeniteit van de decellularisatie werkwijze kan een onderschatte factor perfusie ontcelling zijn. Alle bekende middelen die worden gebruikt voor de lever decellularisatie oorzaak veranderingen aan de ECM. Cellen in slecht doorbloede gebieden blijven binnen de ECM, terwijl andere gebieden zijn al helemaal ontceld. Om de resterende cellen ontbinding moet de perfusie duur of de druk verhoogd, waardoor meer wijzigingen van de goed doorbloede gebieden. Zo moet wasmiddelen voor decellularisatie homogeen worden verdeeld binnen het orgaan.

Protocol

De dieren werden bij de Faciliteit voor Experimentele Geneeskunde (FEM, Charité, Berlijn, Duitsland) gehouden, en alle experimentele protocollen werden beoordeeld en door de Staat Bureau van Volksgezondheid en lokale zaken (LAGeSo, Berlijn, Duitsland goedgekeurd;. Reg No. O 0365 / 11).

1. Lever Oogsten

1. Pre-operatieve voorbereiding
   1. Gebruik een kurk bord voor fixatie. Zet een medische laken op het bord. Met behulp van vier naalden, stelt een inhalatie masker op de kurk plaat voor intra-operatieve inhalatie narcose.
2. Prearrangement van de Portal veneuze canule
   1. Sluit een perifere veneuze katheter (20 G) een driewegkraan. De katheter moet schuin worden gesneden met een lengte van ong. 1,5 cm.
   2. De lucht van het systeem met behulp van een 10 ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing. Het is heel belangrijk om zorgvuldig ontluchting omdat gasembolie negatief kan beïnvloeden perfusie cellen ontdoen.
3. Prearrangementvan de arteriële canule
   1. Gebruik een vlinder canule en snijd de naald tot een lengte van 5 mm. Monteer een 5 cm buis (ID 0,58 mm; OD 0.96 mm) om de 5 mm naald en zet deze vast met superlijm. Steek een 2 cm lange buis (ID 0,28 mm; OD 0.61 mm) in de grotere buis en zet deze vast met superlijm.
   2. Slip een andere buis over deze constructie als een steunpunt en zet deze vast met superlijm. De lucht van de arteriële canule met een 5 ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing.
4. Anesthesie en analgesie
   1. Braken narcose van de rat in de anesthesie inductie kamer met 3,5% isofluraan in zuurstof bij een stroomsnelheid van 1,5 L / min.
   2. Om veilig analgesie tijdens de werking, injecteer metamizol (100 mg / kg lichaamsgewicht) en lage dosis ketamine / medetomidine (10 mg / 0,1 mg per kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal.
   3. Leveren 1,5% isofluraan in 1 l / min zuurstof via het inademen masker voor latere onderhoud van chirurgische anesthesie.
5. Preoperatieve Regelingen
   1. Scheer de buik royaal met een elektrische scheren machine. Bevochtig de geschoren incisie op de buik met 70% ethanol voor desinfectie.
   2. Plaats het dier in rugligging op de geprepareerde plaat, steekt de kop in de inhalatiemasker en bevestig de ledematen met medische tape en pennen. Verwijder overtollige ethanol en vacht met een gaasje kompres.
6. Anesthesie Assessment
   1. Beoordeel de anesthesie diepte door te kijken naar de ademhaling. Als de verdoving lijkt diep genoeg (40-60 ademhalingen / min), controleer dan of analgesie voldoende is door te proberen om de teen knijpen reflex met chirurgische tang om de huid tussen de tenen van beide achterpoten knijpen triggeren.
7. Abdominale Approach
   1. Maak een mediane incisie in de caudale buikwand boven de blaas. Knip tussen die plaats en twee laterale ribben bogen in een V-vormig. Zorg ervoor niet te snijden in het middenrif. Trek de cut buikwand op de borst.
   2. Bevestig de zwaardvormig een Overholt klem, trek het craniaal en zet deze vast met een elastiekje. Gebruik natte wattenstaafjes naar de darm te evacueren. Wikkel de darm in een nat gaasverband. Bovendien bestrijken alle abdominale marges met natte verbanden.
8. Lever Voorbereiding
   1. Ontleden de ligamentum falciforme. Gebruik een natte gaasverband aan de mediale en linker leverlobben houden craniaal onder de koepel van het membraan. Expose de hepatoduodenale ligament en de bovenste omental lever kwab.
   2. Gebruik twee microforceps en veer schaar zorgvuldig ontleden ligament aan dit bovendeel omentale kwab tot het net mobiel. Verplaats de lob met natte wattenstaafjes onder het gaas kompres, die de mediale en liet lobben in de plaats.
   3. Na mobilisatie van de bovenste omental lever kwab, bewegen de maag naar links. Bevestig de maag met een klem en ontleden de minderjarige omentum met microforceps en het voorjaar schaar.
   4. Mobiliseer de onderste omental leverkwab tot het mobiele en vervolgens zet de kwab terug in de holte. Gebruik een Backhaus klem aan het duodenum behouden. Beweeg het duodenum naar links te rekken en de hepatoduodenale ligament bloot. Omschrijven de galweg in de uitgerekte hepatoduodenale ligament.
   5. Prepareer de galwegen van de vet- en pancreasweefsel. Snijd de galwegen 1,5 cm van de galwegen bifurcatie. Ontleden de poortader van de omringende vetweefsel. Expose de gastroduodenale ader.
   6. Afbinden de gastroduodenale ader twee keer met zijden 6-0 en verdeel de ader tussen de 2 ligaturen. Ontleden de coeliakie romp en de leverslagader van het omringende weefsel totdat alle slagaderlijke Rami worden onthuld.
   7. Bevrijd de gastroduodenale slagader van het omringende weefsel. Bind de gastroduodenale slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de gastroduodenale slagader tussen de 2 ligaturen.
   8. Bevrijd de milt slagadervan het omringende weefsel. Bind de milt slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de milt slagader tussen de 2 ligaturen.
   9. Bevrijd de linker maag slagader van het omringende weefsel. Bind de linker maag slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de slagader tussen de 2 ligaturen.
   10. Omschrijven de inferieure vena cava tussen de rechter nier en de rechter laterale lever kwab. Ontleden de ader van de retroperitoneale ruimte. Expose de aorta door de coeliakie kofferbak.
   11. Ontleden de retroperitoneale vetweefsel. Injecteer 1000 IE heparine in 1 ml zoutoplossing in de inferior vena cava. Trek de canule en sluit de incisie met een wattenschijfje. Wacht 1-2 min voor systemisch effect van heparine.
   12. Omschrijven de aorta met een tang. Ontleden de aorta en exsanguinate de rat. Verder ontleden de inferior vena cava distaal van de nier.
9. Portal Veneuze Canulatie (Gebruik de opgesteld in paragraaf 1.2 canule)
   1. Maak een vis-mond incisie in de distale poortader. Open de incisie met een pincet en canule de poortader. Spoel de lever met 20 ml Ringer oplossing totdat de lever ontkleurt en bevestig de canule met ligaturen (zijde 6-0).
10. Arteriële Canulatie (Gebruik de opgesteld in paragraaf 1.3 canule)
    1. Ontleden de aorta boven de coeliakie kofferbak. Bevrijd de aorta segment van de retroperitoneale ruimte. Snijd de aorta segment lengterichting om een ​​aorta patch te genereren. Steek de zelfgebouwde canule in een statische houder.
    2. Gebruik 2 tang om de aorta patch glijden over de canule. Afbinden de leverslagader met zijden 6-0 over de canule en bevestig de patch op het landhoofd.
11. Lever Explantatie
    1. Open het membraan, maak een cirkelvormige insnijding en ontleden van de lever van de omringende structuren.
12. Opslagruimte
    1. Stoopnieuw de lever in een steriele 500 ml reservoir gevuld met 350 ml Ringer oplossing tot gebruik.

2. Wasmiddel Solutions

1. 10% Triton X-100 voorraadoplossing
   1. Vul een fles 1000 ml met 900 ml gedestilleerd water. en voeg 100 ml Triton X-100 (99,9%). Met een roerder om de Triton X-100 te lossen. Vul de fles met aqua dest. tot een totaal volume van 1000 ml wordt bereikt.
2. 1% Triton X-100
   1. Voeg 100 ml van de voorraadoplossing (10%) om een ​​fles 1000 ml. Voeg 900 ml gedestilleerd water. en tweemaal schud de fles. Filter de 1% Triton X-100 oplossing door een steriel filter.
3. 10% SDS voorraadoplossing
   1. Vul een fles 1000 ml met 900 ml gedestilleerd water. en voeg 66,99 g SDS (99,9%, dichtheid 0,67). Gebruik een roerder om de SDS op te lossen. Vul de fles met aqua dest. tot een totaal volume van 1000 ml wordt bereikt.
4. 1% SDS
   1. Voeg 100 ml van de oplossing (10%) tot een 1.000 ml botTLE. Voeg 900 ml gedestilleerd water. en tweemaal schud de fles. Filter de 1% SDS oplossing door een steriel filter.

3. Decellularisatie

1. Set-up van perfusie Device

Figuur 1:. Regeling van de perfusie apparaat voor selectieve arteriële en Portal veneuze perfusie van vier Rat Levers onder Oscillerende Druk Weersomstandigheden (. Gewijzigd van Struecker et al ¹⁴⁾

1. Verbinden de drain een driewegkraan en Heidelberger uitbreiding van het vulniveau reguleren en vullen van de reactor met 500 ml 0,9% NaCl.
   

Figuur 2:. Schema van de perfusie opstelling Verbind de perfusie kamer (1400 cm ³⁾ (1) naar het distale uiteinde (4) van de opvanginrichting (5) via de portale veneuze toegang (2) of via de arteriële acproces (3). De bubble trap (5) moeten worden uitgerust met een obturation (4) aan het distale uiteinde en een opening (6). Sluit de bubble trap (5) om een ​​Heidelberger extensie (7). Koppel de Heidelberger verlenging van de pomp segment (8). Bovendien sluit de pomp segment (8) naar een andere Heidelberger extensie (9). Plaats de laatste Heidelberger verlengstuk (9) in de fles reinigingsmiddel (10). Sluit de respirator (11) aan de perfusie kamer (of de drukverdeler bij meervoudige perfusies). Aan de reactor vloeistoffen drain, sluit de uitstroom naar de fles afval (12).

1. Plaats het segment pomp in de pomp. Start de pomp om de cyclus met PBS te vullen, sluit het distale einde van de zeepbel val en open de ontluchting. Wanneer de onderkant van de bel stevig bedekt met PBS (2-3 cm), sluit de opening en opent het distale uiteinde van de opvanginrichting.
2. Lever Installatie
   1. Verbinden de driewegkraan van de poortader canule om de bijbehorende toegang reactor. Cluit de arteriële canule om de arteriële. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de systemen.
3. Toepassing van Oscillerende Druk Weersomstandigheden
   1. Gebruik een respirator met een frequentie van 15 slagen per minuut en een amplitude van 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Sluit de respirator naar de drukverdeling kamer en sluit de kamer naar de reactor. Start druk applicatie.
4. Decellularisatie Protocol
   1. Voer perfusie stappen met een debiet van 5 ml / min. Start de cellen ontdoen met perfusie van de lever met 1% Triton X-100 gedurende 90 min. Laat afval uitstraling via de uitstroom van de perfusie apparaat om het vloeistofniveau in de perfusie kamer constant en boven de geperfuseerde lever te houden. Na 90 min, verandert het wasmiddel tot 1% SDS.
      
      

Figuur 3: perfusie protocol voor alle experimentele groepen.

Resultaten

De homogeniteit en daarmee de effectiviteit van verschillende ontcelling protocols werden geëvalueerd door macroscopische observatie, histologische analyse en analyse van de resterende DNA inhoud in gedecellulariseerde lever matrices. Bovendien werd corrosie casting uitgevoerd om de intacte microanatomie van levers visualiseren na decellularisatie.

Macroscopie

Tijdens decellularisatie, levers geworden Lucent, met vermelding van het verwijderen van mobiele content...

Discussie

Hoewel de gepresenteerde techniek rattenlever oogsten en ontcelling gemakkelijk reproduceerbaar, zijn er bepaalde kritische stappen te overwegen:

Tijdens het prepareren van de lever oogsten, is het belangrijk om ernstig bloeden voorkomen omdat bloedstolling wordt geactiveerd en kunnen leiden tot de vorming van bloedstolsels in de lever. Naar onze mening is het voordelig om de abdominale aorta direct incise vóór canulatie van de poortader om bloed instroom via de leverslagader tijdens perfusi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zelf gebouwde arteriële canule
Portex niet-steriele polyetheenbuis	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm ID 0,61 mm OD
Portex niet-steriele polyetheenbuis	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm OD
Venodrop Safe butterflykatheter	Fresenius Kabi	3275851	21 G
portale venecanule
Perifeer veneuze katheter	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Driewegstopkraan	smiths medical	888-101RE
chirurgie
Katoenen stokken	Hecht-Assistent	4302
Katoenen pads	Shaoxing Zhengde chirurgisch verband	13H118-03
Gaasverband	Hubei Haige  Medische instrumenten	14388
Ringer-oplossing	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml spuit	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml spuit	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Hechtdraad (zijde 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
medisch scherm	Shaoxing Zhengde chirurgisch verband	D0613011
chirurgische instrumenten
naaldhouder	Geuder	17570
micro-pincetten	Inox-Electronic	91150-20
micro-schaar	Martin	11-740-11
micro-pincetten	S&T	112314
klem	Aesculap	BH111R
schaar	F S T	14501-14
chirurgische pincetten	Aesculap	BD 557
Decellularisatie
Respirator	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Perfusieapparaat	Charite, laboratorium voor medische techniek	op maat gemaakt apparaat	decellularisatieapparaat
peristaltische pomp ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4-kanaals
heidelberger verlengsnoer 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA pomp-segment	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
CA 2-stopbuis	Pharmed	BPT NSF-51
bubbelval		op maat gemaakt item
Luer Lock slangkoppeling	Neolab	Nr. 02-1887
Detergentia
SDS-pellets	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
kleuring
Eosine 1%	Morphisto	10177
Mayer hematoxylinen	AppliChem	A4840
Gomori-kleuring	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS-kleuring	Morphisto	11388
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548